技术摘要：
本发明涉及化学耐受性的葡萄糖脱氢酶突变体及其在辅酶再生中的应用，属于生物工程技术领域。本发明提供了巨大芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶突变体，其编码基因、含有该基因序列的重组表达载体和重组表达转化体，突变体酶制剂的制备方法，以及该突变体酶制剂在氧化还原反应中参 全部
背景技术：
葡萄糖脱氢酶(Glucose dehydrogenase ,GDH)是用于辅酶再生的一类重要工具 酶。它能催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，同时将产生的氢负离子与电子受体NAD 或NADP 结 合，生成还原型辅酶NADH或NADPH，从而实现还原型辅酶的循环再生。葡萄糖脱氢酶催化辅 酶再生具有以下优点：(1)酶催化效率高；(2)双辅酶再生(NADH和NADPH)，(3)所使用的底物 葡萄糖廉价易得；(4)对于NAD(P) 的Km较小，即与辅酶的亲和力大；(5)反应不可逆。上述的 这些优点使得葡萄糖脱氢酶在辅酶再生的领域具有广泛的应用前景及潜力。为了满足工业 应用日益增长的需求，从巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌中克隆获得了多种葡萄糖脱氢酶并 于大肠杆菌中重组表达。并且已经详细研究了来自巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的葡萄糖 脱氢酶的特征。 在应用方面，Makino等人对来源于Bacillus megaterium IWG3的葡萄糖脱氢酶进 行了化学诱变，得到了四株热稳定性提高的突变体E96A、E96G、Q252L和Y253C，其中E96A最 稳定，与母本相比，热稳定性提高了大约20℃(FEBS Lett.,1989,253:113-116)。Baik等人 将来源于Bacillus licheniformis IFO12200，Bacillus megaterium IFO 15308， Bacillus subtilis IFO 13719和来源于Bacillus megaterium IWG3的葡萄糖脱氢酶突变 体Q252L通过DNA shuffling得到了一个热稳定性进一步提高的突变体Q252L/E170K (Appl.Environ.Microbiol.,2005,71:3285-3293)。通过上述分子改造，使得高活性天然葡 萄糖脱氢酶突破了热稳定性差的瓶颈，从而使其在工业应用中具有更大的竞争优势。 葡萄糖脱氢酶作为一种性能优良的辅酶再生工具酶，因其良好的催化活性和热稳 定性，已经基本满足了大部分的实际应用需求。但在大规模工业应用中，催化体系中常常存 在高浓度的疏水性底物或产物，导致葡萄糖脱氢酶快速失活，限制了其广泛应用。酶在高浓 度疏水性底物或产物中的稳定性，通常称为化学耐受性或化学稳定性，类似于有机溶剂的 耐受性。Ding等人发现来源于Lactobacillus salivarius的葡萄糖脱氢酶LsGDH在与水互 溶的有机溶剂和双相溶剂系统中都表现出了较高的化学稳定性，但在正丁醇中却展现出很 差的 化学耐受性 ，使 用1 0％ ( v / v ) 的 正丁醇处理 后 ，其活性几乎完全丧失 (Bioresour.Technol.,2011,102:1528-1536)。研究人员也在酶有机溶剂耐受性方面做了 大量改造工作，其中利用蛋白质工程来提高酶的有机溶剂耐受性已成为比较成熟的方法。 酶工程的方法集中于改变蛋白质分子的一级序列，以产生在有机介质中具有优异稳定性和 活性的酶突变体。但是，目前针对葡萄糖脱氢酶对于高浓度底物耐受性的改造工作还未见 报道。通过定向进化等蛋白质工程技术对其结构进行分子改造，提高其化学稳定性及在高 浓度化学品转化体系中的辅酶再生能力，有助于进一步降低酶催化生产成本、推动生物催 4 CN 111593030 A 说 明 书 2/12 页 化在医药、农药、材料、能源等领域中的更广泛应用。
技术实现要素：
鉴于现有技术存在的不足，本发明选择已报道具有高活性和热稳定性的 BmGDHQ252L/E170K(PDB:1RWB)作为目标，通过蛋白质工程的手段对其进行进一步的分子改造， 使用高浓度1-苯乙醇对突变库进行有机溶剂耐受性筛选，获得了对高浓度化学品耐受性显 著提升的突变体，增强了该酶的应用性。 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现： 技术方案之一，本发明提供对高浓度苯乙醇耐受性显著提升的葡萄糖脱氢酶突变 体。以氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的葡萄糖脱氢酶BmGDH作为母本，通过随机突变的方 法，结合酶标仪高通量初筛和进一步摇瓶复筛，鉴别获得多个对高浓度苯乙醇耐受性提高 的突变体，与母本相比，优选的突变体不仅提高了其化学稳定性，在热稳定性方面也有所提 高。 本发明所述葡萄糖脱氢酶突变体，是将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白质 的第23位甲硫氨酸、第41位赖氨酸、第47位丝氨酸、第72位缬氨酸、第74位天冬酰胺、第85位 赖氨酸、第99位缬氨酸、第100位丝氨酸、第111位赖氨酸、第137位赖氨酸、第139位苏氨酸、 第166位赖氨酸、第194位脯氨酸、第202位天冬氨酸、第210位谷氨酸或第213位异亮氨酸中 的一个或多个氨基酸残基替换为其他氨基酸残基所形成的新氨基酸序列的衍生蛋白质，所 述衍生蛋白质对高浓度苯乙醇耐受性显著提升，在热稳定性方面也有所提高。 具体的，所述葡萄糖脱氢酶突变体是如下序列中的一种： (1)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第100位丝氨酸替换为脯氨酸； (2)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第166位赖氨酸替换为精氨酸； (3)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第202位天冬氨酸替换为天冬酰 胺； (4)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第100位丝氨酸替换为脯氨酸， 第166位赖氨酸替换为精氨酸； (5)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第166位赖氨酸替换为精氨酸， 第210位谷氨酸替换为甘氨酸； (6)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第99位缬氨酸替换为丙氨酸，第 166位赖氨酸替换为精氨酸； (7)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第166位赖氨酸替换为精氨酸， 第202位天冬氨酸替换为天冬酰胺； (8)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第23位甲硫氨酸替换为缬氨酸， 第99位缬氨酸替换为丙氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸； (9)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第100位丝氨酸替换为脯氨酸， 第166位赖氨酸替换为精氨酸，第210位谷氨酸替换为甘氨酸； (10)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第100位丝氨酸替换为脯氨酸， 第137位赖氨酸替换为精氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸； (11)将如序列表中SEQ ID No .2所示氨基酸序列的第72位缬氨酸替换为异亮氨 5 CN 111593030 A 说 明 书 3/12 页 酸，第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸； (12)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第166位赖氨酸替换为精氨酸， 第139位苏氨酸替换为丙氨酸，第210位谷氨酸替换为甘氨酸； (13)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第99位缬氨酸替换为丙氨酸， 第166位赖氨酸替换为精氨酸，第202位天冬氨酸替换为天冬酰胺； (14)将如序列表中SEQ ID No .2所示氨基酸序列的第47位丝氨酸替换为半胱氨 酸，第85位赖氨酸替换为苏氨酸，第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨 酸； (15)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第100位丝氨酸替换为脯氨酸， 第111位赖氨酸替换为精氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸，第194位脯氨酸替换为精氨 酸； (16)将如序列表中SEQ ID No .2所示氨基酸序列的第72位缬氨酸替换为异亮氨 酸，第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第137位赖氨酸替换为精氨酸，第166位赖氨酸替换为精 氨酸； (17)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第100位丝氨酸替换为脯氨酸， 第111位赖氨酸替换为精氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸，第202位天冬氨酸替换为天冬 酰胺； (18)将如序列表中SEQ ID No .2所示氨基酸序列的第41位赖氨酸替换为甲硫氨 酸，第74位天冬酰胺替换为丝氨酸，第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第166位赖氨酸替换为精 氨酸，第213位异亮氨酸替换为缬氨酸； (19)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第74位天冬酰胺替换为天冬氨 酸，第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第111位赖氨酸替换为精氨酸，第166位赖氨酸替换为精 氨酸，第194位脯氨酸替换为精氨酸。 技术方案之二，本发明提供编码所述葡萄糖脱氢酶突变体的核酸序列。同时，本发 明还提供含有所述酶基因核酸序列的重组表达载体。 所述核酸编码表达如技术方案一所述的进化改造获得的葡萄糖脱氢酶突变体，其 来源包括：通过基因工程技术对技术方案一所述的系列葡萄糖脱氢酶突变体的基因序列进 行克隆；或者通过人工全序列合成的方法得到编码如技术方案一所述葡萄糖脱氢酶突变体 的核酸分子。 所述的重组表达载体可通过本领域常规方法，将本发明所述的葡萄糖脱氢酶突变 体基因的编码核酸序列连接于各种市售空载载体上构建而成。所述的市售空载载体可以是 本领域常规的各种质粒载体，只要所述重组表达载体可以在相应的表达宿主中正常复制， 并能表达出相应的酶即可。针对不同的表达宿主，优选的质粒载体是不同的。本领域一般技 术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。对于大肠杆菌宿主，所述 质粒载体优选的为pET-28a( )质粒。可通过下述方法制备本发明所述的大肠杆菌重组表达 载体：将通过PCR扩增所得的葡萄糖脱氢酶突变体基因片段用限制性内切酶Nde I和BamH I 双酶酶切，同时将空载质粒pET-28a( )同样用限制性内切酶Nde I和BamH I进行双酶酶切， 回收上述酶切后的葡萄糖脱氢酶突变体的DNA片段以及空载质粒，利用T4 DNA连接酶进行 连接，构建获得用于大肠杆菌表达的含有所述葡萄糖脱氢酶突变体编码核酸的重组表达载 6 CN 111593030 A 说 明 书 4/12 页 体。 技术方案之三，本发明提供包含本发明所述葡萄糖脱氢酶突变体基因或其重组表 达载体的重组表达转化体。 可通过将已经构建好的重组表达载体转化至宿主细胞来制备重组表达转化体。所 述宿主细胞为本领域的各种常规宿主细胞，只要所述的重组表达载体能够稳定地自行复制 并能通过诱导剂诱导有效表达目标蛋白即可。本发明首选大肠杆菌作为宿主细胞，更优选 大肠杆菌E.coli BL21(DE3)用于高效表达本发明所述的葡萄糖脱氢酶突变体。 技术方案之四，本发明提供重组葡萄糖脱氢酶突变体催化剂，所述的重组葡萄糖 脱氢酶突变体催化剂是以下形式中的任意一种： (1)培养本发明所述的重组表达转化体，分离含有所述葡萄糖脱氢酶突变体的转 化体细胞； (2)培养本发明所述的重组表达转化体，分离含有所述葡萄糖脱氢酶突变体的粗 酶液； (3)培养本发明所述的重组表达转化体，分离含有所述葡萄糖脱氢酶突变体的粗 酶液，冷冻干燥得到的粗酶粉。 (4)所述葡萄糖脱氢酶突变体直接作为重组葡萄糖脱氢酶突变体催化剂。 其中所述重组表达转化体的培养方法和条件为本领域常规的方法和条件，其包括 如下步骤：培养本发明的重组表达转化体，获得重组葡萄糖脱氢酶突变体。对于重组大肠杆 菌，优选培养基为LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 6.5-7.0。优选的培 养方法为：将如上所述构建的重组大肠杆菌，接种至含有卡那霉素(Kanamycin)的LB培养基 中，37℃、180rpm振荡培养过夜。按1-2％(v/v)的接种量接入装有100ml LB培养基(含卡那 霉素)的500mL三角烧瓶中，置于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD600达到0.6-0.8 时，加入终浓度为0.1-0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂，16-25℃诱导 16-24h后，将培养液离心，收集沉淀，然后用生理盐水洗涤两次，获得重组表达转化体细胞。 将收获的重组细胞进行冷冻干燥，即可获得含有所述葡萄糖脱氢酶突变体的冻干细胞。将 收获的重组细胞悬浮于5-10倍体积(v/w)的缓冲液中，超声破碎，离心收集上清液，即可获 得所述重组葡萄糖脱氢酶突变体的粗酶液。收集的粗酶液置于-80℃下冷冻，然后使用真空 冷冻干燥机低温干燥，即可得到冻干酶粉。将所获得的冻干酶粉保存在4℃冰箱内，可以方 便地使用。 本发明中所述葡萄糖脱氢酶突变体的活力测定方法：将含200mM葡萄糖和1mM NADP 的1mL反应体系(100mM磷酸钠缓冲液，pH 7.0)预热至30℃，然后加入适量的葡萄糖脱 氢酶突变体，30℃保温反应，在分光光度计上检测340nm处NADPH的吸光度变化，记录1分钟 内吸光度的变化值。 用下式计算得到酶活力： 酶活力(U)＝EW×V×103/(6220×l) 式中，EW为1分钟内340nm处吸光度的变化；V为反应液的体积，单位为mL；6220为 NADPH的摩尔消光系数，单位为L/(mol·cm)；l为光程距离，单位为cm。1个酶活力单位(U)定 义为上述条件下每分钟催化生成1μmolNADPH所需的酶量。 技术方案之五，本发明提供所述BmGDH母本及其突变体对苯乙醇耐受性的检测方 7 CN 111593030 A 说 明 书 5/12 页 法，将纯化后的所述BmGDH与10％(v/v)的苯乙醇溶液混合，纯酶浓度控制在0.5mg/mL。并于 30℃、1000r/min的振荡反应器中振荡，每隔一段时间取样测定残余活力，按照本发明技术 方案四中所述的葡萄糖脱氢酶突变体活力测定方法测定残余酶活力，计初始酶的活力为 100％，以此来衡量所述BmGDH对所测化合物的耐受性。 技术方案之六，本发明提供了所述BmGDH母本及其突变体热稳定性(T 6050 )的检测 方法，将纯化后的所述BmGDH分别置于不同温度下保温，纯酶浓度控制在0.5mg/mL。每隔一 段时间取样测定残余活力，按照本发明技术方案四中所述的葡萄糖脱氢酶突变体活力测定 方法测定残余酶活力，计未处理酶的酶活力为100％，当残余酶活力下降到20％以下，即定 义为失活，从而确定所述BmGDH的热稳定性。 技术方案之七，本发明提供技术方案之四所述的重组葡萄糖脱氢酶突变体催化剂 的应用。 所述重组葡萄糖脱氢酶突变体催化剂在催化辅酶NADH和NADPH再生中的应用。 本发明利用定向进化技术对巨大芽孢杆菌来源的葡萄糖脱氢酶进行了分子改造， 得到了热稳定性和化学耐受性均显著提升的突变体，满足了工业应用的需求。与现有技术 相比，本发明所述突变体不仅具有高的活性和热稳定性，而且还具有很好的化学耐受性，将 更有助于含高浓度有机助溶剂或高浓度底物/产物的生物催化反应体系中的辅酶再生，在 工业应用中显示出更加广泛的应用前景。
本发明涉及化学耐受性的葡萄糖脱氢酶突变体及其在辅酶再生中的应用，属于生物工程技术领域。本发明提供了巨大芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶突变体，其编码基因、含有该基因序列的重组表达载体和重组表达转化体，突变体酶制剂的制备方法，以及该突变体酶制剂在氧化还原反应中参 全部
背景技术：
葡萄糖脱氢酶(Glucose dehydrogenase ,GDH)是用于辅酶再生的一类重要工具 酶。它能催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，同时将产生的氢负离子与电子受体NAD 或NADP 结 合，生成还原型辅酶NADH或NADPH，从而实现还原型辅酶的循环再生。葡萄糖脱氢酶催化辅 酶再生具有以下优点：(1)酶催化效率高；(2)双辅酶再生(NADH和NADPH)，(3)所使用的底物 葡萄糖廉价易得；(4)对于NAD(P) 的Km较小，即与辅酶的亲和力大；(5)反应不可逆。上述的 这些优点使得葡萄糖脱氢酶在辅酶再生的领域具有广泛的应用前景及潜力。为了满足工业 应用日益增长的需求，从巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌中克隆获得了多种葡萄糖脱氢酶并 于大肠杆菌中重组表达。并且已经详细研究了来自巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的葡萄糖 脱氢酶的特征。 在应用方面，Makino等人对来源于Bacillus megaterium IWG3的葡萄糖脱氢酶进 行了化学诱变，得到了四株热稳定性提高的突变体E96A、E96G、Q252L和Y253C，其中E96A最 稳定，与母本相比，热稳定性提高了大约20℃(FEBS Lett.,1989,253:113-116)。Baik等人 将来源于Bacillus licheniformis IFO12200，Bacillus megaterium IFO 15308， Bacillus subtilis IFO 13719和来源于Bacillus megaterium IWG3的葡萄糖脱氢酶突变 体Q252L通过DNA shuffling得到了一个热稳定性进一步提高的突变体Q252L/E170K (Appl.Environ.Microbiol.,2005,71:3285-3293)。通过上述分子改造，使得高活性天然葡 萄糖脱氢酶突破了热稳定性差的瓶颈，从而使其在工业应用中具有更大的竞争优势。 葡萄糖脱氢酶作为一种性能优良的辅酶再生工具酶，因其良好的催化活性和热稳 定性，已经基本满足了大部分的实际应用需求。但在大规模工业应用中，催化体系中常常存 在高浓度的疏水性底物或产物，导致葡萄糖脱氢酶快速失活，限制了其广泛应用。酶在高浓 度疏水性底物或产物中的稳定性，通常称为化学耐受性或化学稳定性，类似于有机溶剂的 耐受性。Ding等人发现来源于Lactobacillus salivarius的葡萄糖脱氢酶LsGDH在与水互 溶的有机溶剂和双相溶剂系统中都表现出了较高的化学稳定性，但在正丁醇中却展现出很 差的 化学耐受性 ，使 用1 0％ ( v / v ) 的 正丁醇处理 后 ，其活性几乎完全丧失 (Bioresour.Technol.,2011,102:1528-1536)。研究人员也在酶有机溶剂耐受性方面做了 大量改造工作，其中利用蛋白质工程来提高酶的有机溶剂耐受性已成为比较成熟的方法。 酶工程的方法集中于改变蛋白质分子的一级序列，以产生在有机介质中具有优异稳定性和 活性的酶突变体。但是，目前针对葡萄糖脱氢酶对于高浓度底物耐受性的改造工作还未见 报道。通过定向进化等蛋白质工程技术对其结构进行分子改造，提高其化学稳定性及在高 浓度化学品转化体系中的辅酶再生能力，有助于进一步降低酶催化生产成本、推动生物催 4 CN 111593030 A 说 明 书 2/12 页 化在医药、农药、材料、能源等领域中的更广泛应用。
技术实现要素：
鉴于现有技术存在的不足，本发明选择已报道具有高活性和热稳定性的 BmGDHQ252L/E170K(PDB:1RWB)作为目标，通过蛋白质工程的手段对其进行进一步的分子改造， 使用高浓度1-苯乙醇对突变库进行有机溶剂耐受性筛选，获得了对高浓度化学品耐受性显 著提升的突变体，增强了该酶的应用性。 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现： 技术方案之一，本发明提供对高浓度苯乙醇耐受性显著提升的葡萄糖脱氢酶突变 体。以氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的葡萄糖脱氢酶BmGDH作为母本，通过随机突变的方 法，结合酶标仪高通量初筛和进一步摇瓶复筛，鉴别获得多个对高浓度苯乙醇耐受性提高 的突变体，与母本相比，优选的突变体不仅提高了其化学稳定性，在热稳定性方面也有所提 高。 本发明所述葡萄糖脱氢酶突变体，是将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白质 的第23位甲硫氨酸、第41位赖氨酸、第47位丝氨酸、第72位缬氨酸、第74位天冬酰胺、第85位 赖氨酸、第99位缬氨酸、第100位丝氨酸、第111位赖氨酸、第137位赖氨酸、第139位苏氨酸、 第166位赖氨酸、第194位脯氨酸、第202位天冬氨酸、第210位谷氨酸或第213位异亮氨酸中 的一个或多个氨基酸残基替换为其他氨基酸残基所形成的新氨基酸序列的衍生蛋白质，所 述衍生蛋白质对高浓度苯乙醇耐受性显著提升，在热稳定性方面也有所提高。 具体的，所述葡萄糖脱氢酶突变体是如下序列中的一种： (1)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第100位丝氨酸替换为脯氨酸； (2)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第166位赖氨酸替换为精氨酸； (3)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第202位天冬氨酸替换为天冬酰 胺； (4)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第100位丝氨酸替换为脯氨酸， 第166位赖氨酸替换为精氨酸； (5)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第166位赖氨酸替换为精氨酸， 第210位谷氨酸替换为甘氨酸； (6)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第99位缬氨酸替换为丙氨酸，第 166位赖氨酸替换为精氨酸； (7)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第166位赖氨酸替换为精氨酸， 第202位天冬氨酸替换为天冬酰胺； (8)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第23位甲硫氨酸替换为缬氨酸， 第99位缬氨酸替换为丙氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸； (9)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第100位丝氨酸替换为脯氨酸， 第166位赖氨酸替换为精氨酸，第210位谷氨酸替换为甘氨酸； (10)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第100位丝氨酸替换为脯氨酸， 第137位赖氨酸替换为精氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸； (11)将如序列表中SEQ ID No .2所示氨基酸序列的第72位缬氨酸替换为异亮氨 5 CN 111593030 A 说 明 书 3/12 页 酸，第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸； (12)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第166位赖氨酸替换为精氨酸， 第139位苏氨酸替换为丙氨酸，第210位谷氨酸替换为甘氨酸； (13)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第99位缬氨酸替换为丙氨酸， 第166位赖氨酸替换为精氨酸，第202位天冬氨酸替换为天冬酰胺； (14)将如序列表中SEQ ID No .2所示氨基酸序列的第47位丝氨酸替换为半胱氨 酸，第85位赖氨酸替换为苏氨酸，第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨 酸； (15)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第100位丝氨酸替换为脯氨酸， 第111位赖氨酸替换为精氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸，第194位脯氨酸替换为精氨 酸； (16)将如序列表中SEQ ID No .2所示氨基酸序列的第72位缬氨酸替换为异亮氨 酸，第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第137位赖氨酸替换为精氨酸，第166位赖氨酸替换为精 氨酸； (17)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第100位丝氨酸替换为脯氨酸， 第111位赖氨酸替换为精氨酸，第166位赖氨酸替换为精氨酸，第202位天冬氨酸替换为天冬 酰胺； (18)将如序列表中SEQ ID No .2所示氨基酸序列的第41位赖氨酸替换为甲硫氨 酸，第74位天冬酰胺替换为丝氨酸，第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第166位赖氨酸替换为精 氨酸，第213位异亮氨酸替换为缬氨酸； (19)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第74位天冬酰胺替换为天冬氨 酸，第100位丝氨酸替换为脯氨酸，第111位赖氨酸替换为精氨酸，第166位赖氨酸替换为精 氨酸，第194位脯氨酸替换为精氨酸。 技术方案之二，本发明提供编码所述葡萄糖脱氢酶突变体的核酸序列。同时，本发 明还提供含有所述酶基因核酸序列的重组表达载体。 所述核酸编码表达如技术方案一所述的进化改造获得的葡萄糖脱氢酶突变体，其 来源包括：通过基因工程技术对技术方案一所述的系列葡萄糖脱氢酶突变体的基因序列进 行克隆；或者通过人工全序列合成的方法得到编码如技术方案一所述葡萄糖脱氢酶突变体 的核酸分子。 所述的重组表达载体可通过本领域常规方法，将本发明所述的葡萄糖脱氢酶突变 体基因的编码核酸序列连接于各种市售空载载体上构建而成。所述的市售空载载体可以是 本领域常规的各种质粒载体，只要所述重组表达载体可以在相应的表达宿主中正常复制， 并能表达出相应的酶即可。针对不同的表达宿主，优选的质粒载体是不同的。本领域一般技 术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。对于大肠杆菌宿主，所述 质粒载体优选的为pET-28a( )质粒。可通过下述方法制备本发明所述的大肠杆菌重组表达 载体：将通过PCR扩增所得的葡萄糖脱氢酶突变体基因片段用限制性内切酶Nde I和BamH I 双酶酶切，同时将空载质粒pET-28a( )同样用限制性内切酶Nde I和BamH I进行双酶酶切， 回收上述酶切后的葡萄糖脱氢酶突变体的DNA片段以及空载质粒，利用T4 DNA连接酶进行 连接，构建获得用于大肠杆菌表达的含有所述葡萄糖脱氢酶突变体编码核酸的重组表达载 6 CN 111593030 A 说 明 书 4/12 页 体。 技术方案之三，本发明提供包含本发明所述葡萄糖脱氢酶突变体基因或其重组表 达载体的重组表达转化体。 可通过将已经构建好的重组表达载体转化至宿主细胞来制备重组表达转化体。所 述宿主细胞为本领域的各种常规宿主细胞，只要所述的重组表达载体能够稳定地自行复制 并能通过诱导剂诱导有效表达目标蛋白即可。本发明首选大肠杆菌作为宿主细胞，更优选 大肠杆菌E.coli BL21(DE3)用于高效表达本发明所述的葡萄糖脱氢酶突变体。 技术方案之四，本发明提供重组葡萄糖脱氢酶突变体催化剂，所述的重组葡萄糖 脱氢酶突变体催化剂是以下形式中的任意一种： (1)培养本发明所述的重组表达转化体，分离含有所述葡萄糖脱氢酶突变体的转 化体细胞； (2)培养本发明所述的重组表达转化体，分离含有所述葡萄糖脱氢酶突变体的粗 酶液； (3)培养本发明所述的重组表达转化体，分离含有所述葡萄糖脱氢酶突变体的粗 酶液，冷冻干燥得到的粗酶粉。 (4)所述葡萄糖脱氢酶突变体直接作为重组葡萄糖脱氢酶突变体催化剂。 其中所述重组表达转化体的培养方法和条件为本领域常规的方法和条件，其包括 如下步骤：培养本发明的重组表达转化体，获得重组葡萄糖脱氢酶突变体。对于重组大肠杆 菌，优选培养基为LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 6.5-7.0。优选的培 养方法为：将如上所述构建的重组大肠杆菌，接种至含有卡那霉素(Kanamycin)的LB培养基 中，37℃、180rpm振荡培养过夜。按1-2％(v/v)的接种量接入装有100ml LB培养基(含卡那 霉素)的500mL三角烧瓶中，置于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD600达到0.6-0.8 时，加入终浓度为0.1-0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂，16-25℃诱导 16-24h后，将培养液离心，收集沉淀，然后用生理盐水洗涤两次，获得重组表达转化体细胞。 将收获的重组细胞进行冷冻干燥，即可获得含有所述葡萄糖脱氢酶突变体的冻干细胞。将 收获的重组细胞悬浮于5-10倍体积(v/w)的缓冲液中，超声破碎，离心收集上清液，即可获 得所述重组葡萄糖脱氢酶突变体的粗酶液。收集的粗酶液置于-80℃下冷冻，然后使用真空 冷冻干燥机低温干燥，即可得到冻干酶粉。将所获得的冻干酶粉保存在4℃冰箱内，可以方 便地使用。 本发明中所述葡萄糖脱氢酶突变体的活力测定方法：将含200mM葡萄糖和1mM NADP 的1mL反应体系(100mM磷酸钠缓冲液，pH 7.0)预热至30℃，然后加入适量的葡萄糖脱 氢酶突变体，30℃保温反应，在分光光度计上检测340nm处NADPH的吸光度变化，记录1分钟 内吸光度的变化值。 用下式计算得到酶活力： 酶活力(U)＝EW×V×103/(6220×l) 式中，EW为1分钟内340nm处吸光度的变化；V为反应液的体积，单位为mL；6220为 NADPH的摩尔消光系数，单位为L/(mol·cm)；l为光程距离，单位为cm。1个酶活力单位(U)定 义为上述条件下每分钟催化生成1μmolNADPH所需的酶量。 技术方案之五，本发明提供所述BmGDH母本及其突变体对苯乙醇耐受性的检测方 7 CN 111593030 A 说 明 书 5/12 页 法，将纯化后的所述BmGDH与10％(v/v)的苯乙醇溶液混合，纯酶浓度控制在0.5mg/mL。并于 30℃、1000r/min的振荡反应器中振荡，每隔一段时间取样测定残余活力，按照本发明技术 方案四中所述的葡萄糖脱氢酶突变体活力测定方法测定残余酶活力，计初始酶的活力为 100％，以此来衡量所述BmGDH对所测化合物的耐受性。 技术方案之六，本发明提供了所述BmGDH母本及其突变体热稳定性(T 6050 )的检测 方法，将纯化后的所述BmGDH分别置于不同温度下保温，纯酶浓度控制在0.5mg/mL。每隔一 段时间取样测定残余活力，按照本发明技术方案四中所述的葡萄糖脱氢酶突变体活力测定 方法测定残余酶活力，计未处理酶的酶活力为100％，当残余酶活力下降到20％以下，即定 义为失活，从而确定所述BmGDH的热稳定性。 技术方案之七，本发明提供技术方案之四所述的重组葡萄糖脱氢酶突变体催化剂 的应用。 所述重组葡萄糖脱氢酶突变体催化剂在催化辅酶NADH和NADPH再生中的应用。 本发明利用定向进化技术对巨大芽孢杆菌来源的葡萄糖脱氢酶进行了分子改造， 得到了热稳定性和化学耐受性均显著提升的突变体，满足了工业应用的需求。与现有技术 相比，本发明所述突变体不仅具有高的活性和热稳定性，而且还具有很好的化学耐受性，将 更有助于含高浓度有机助溶剂或高浓度底物/产物的生物催化反应体系中的辅酶再生，在 工业应用中显示出更加广泛的应用前景。
