技术摘要：
本发明公开了一种VKORC1基因rs9923231位点多态性的分型检测方法与试剂盒。本发明采用VKORC1基因特异性的引物SEQ1和SEQ2扩增VKORC1基因片段，同时在VKORC1基因特异性的引物界定的扩增区域内设计VKORC1基因特异性人工模拟核酸分子信标SEQ3‑FAM和SEQ4‑VIC。本发明提供的 全部
背景技术：
深静脉血栓形成（DVT）是在深静脉中形成的血凝块，常见于股静脉或腘静脉等大 静脉中。常见表现为相关部位的疼痛、肿胀、发热。血凝块可以转移到肺部，形成肺栓塞。DVT 形成的因素包括手术、创伤、癌症、肥胖、吸烟、激素分娩控制、抗磷脂综合征和遗传病等。随 着年龄的增长，其发病率逐渐增加。 目前，抗凝血（血液稀释剂）治疗DVT是普遍采用的方法。典型的药物包括低分子量 的肝素、华法林、香豆素或直接口服抗凝剂。其中，华法林是广泛使用的第一代抗凝血剂，常 用于治疗血栓，预防中风。然而患者对华法林的治疗反应却受到不同因素的影响，如年龄、 性别、维生素K摄入量和药物剂量。此外，某些基因缺陷的个体会出现治疗反应不良，在临床 实践中会导致内出血和中风。全基因组关联研究证实，某些基因与华法林药物代谢相关，它 们与环境等其它因素相互作用，共同影响华法林治疗的给药剂量。 维生素K环氧还原酶复合物1（VKORC1）是内质网的一种小跨膜蛋白，在维生素K途 径中起主要作用，是华法林的靶蛋白。VKORC1基因非编码突变的存在导致蛋白的差异表达， 决定了患者的药物剂量。已发现VKORC1的rs9923231(G/A)是华法林剂量相关的重要标签。A 为低剂量高度敏感型，G为高剂量不敏感型。对该位点进行检测是针对不同患者治疗的重要 依据。 目前，基因多态性检测的方法主要有PCR-Sanger测序法、芯片杂交法、高分辨率溶 解曲线法等。这些方法虽然都可以在一定程度上检测基因多态性，但都有不可忽视的局限 性。Sanger测序法步骤较多，需要PCR后处理，不仅操作繁琐，还易产生污染，并不能满足临 床的需求。芯片杂交法操作繁琐，其检测还依赖于昂贵的设备仪器，导致成本较高。高分辨 率溶解曲线法对仪器要求高，需要具有安装高分辨率软件、温度比较敏感的机器才能使用， 临床推广存在困难。基于Taqman水解探针的荧光定量PCR，利用Taq酶的外切酶活性，切断探 针产生荧光信号，由于Taqman探针荧光基团与淬灭基团并不紧密靠近，导致荧光淬灭不彻 底，存在背景荧光信号。此外，Taqman探针对于单碱基错配识别能力较差，极易生成 非特异 荧光信号，干扰结果判读，进而影响检测的准确性。因此，临床上迫切需要一种简便易行、灵 敏度高、准确可靠的检测基因多态性的方法。 分子信标（Molecular Beacon）在空间结构上呈发夹型，由环状区和茎干区组成， 环状区与靶DNA序列互补，长约15-35个核苷酸，茎杆区长约5-7个核苷酸，由GC含量较高的 与靶序列无关的互补序列构成，分子信标的5′端标记荧光基团（F），3′端标记淬灭基团（Q）。 对于分子信标来说，自由状态时，荧光基团与淬灭基团靠近（约为7-10nm）。此时发生荧光共 振能量转移，使荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被 3 CN 111593101 A 说 明 书 2/5 页 淬灭，荧光本底极低。当分子信标的环状区与序列完全互补的靶DNA杂交形成双链杂交体 时，分子信标茎杆区被拉开，荧光基团和淬灭基团距离增大。根据Foerster理论，中心荧光 能量转移效率与两者距离的6次方成反比，因此，杂交后分子信标的荧光几乎100%恢复，且 所检测到的荧光强度与溶液中靶DNA的量成正比（图1）。因此，理想的分子信标比Taqman水 解探针更为高效。然而，由于分子信标中与靶序列无关的茎杆区的引入导致分子信标与模 板序列之间常会产生一些非特异性相互作用，从而导致背景信号增强，进而影响检测效率。 而要消除这种背景信号，就会对分子信标的设计尤其是茎杆区的序列设计产生很高的要 求。此外，研究显示分子信标在环状区序列较短时，用于检测基因突变（包括单碱基的错配、 缺失或插入突变）效果较好，但实际上，很多时候，由于特定靶序列区的GC含量较低，往往会 导致环状区序列过长，从而影响检测效率。因此，得到一个理想的分子信标往往比较困难。 针对碱基的修饰改造也就是人工模拟的非天然核苷酸对的研究发展至今已有近 40年的历史，这其中异胞嘧啶脱氧核苷酸-异鸟嘌呤脱氧核苷酸（isoC-isoG）及其衍生物5- 甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸-异鸟嘌呤脱氧核苷酸（isoMeC-isoG）中的人工核苷酸对堪称经 典。有关isoC-isoG中的核苷酸对的研究工作最早是由美国著名合成生物学家Benner SA开 展的，其团队实现了异胞嘧啶脱氧核苷酸-异鸟嘌呤脱氧核苷酸（isoC-isoG）的人工扩展核 酸在体外的复制、转录乃至翻译的整个中心法则。如图2所示，isoC和isoG分别是天然核苷 酸C和G的异构体，它们自身可以完美配对，但无法与天然核苷酸之间形成配对。 除了以上人工对碱基结构的改造，还有一大类基于对碱基糖环的改造的非天然核 酸，如锁核酸（LNA）。LNA泛指含有一个或多个LNA单体（锁核苷酸）的寡核苷酸序列，是一类 近年来迅速发展起来的并且已经在分子诊断、基因治疗等领域得到广泛应用的人工模拟核 酸。如图3所示，LNA单体的戊糖环的2’-O和4’-C之间形成了一个亚甲基桥。LNA不改变天然 核酸的碱基配对，但相对于天然核酸有着更强的亲和力以及更强的错配识别能力。
技术实现要素：
本发明的目的是基于人工模拟核酸的分子信标提供一种新型的VKORC1基因 rs9923231多态性位点的分型检测方法与试剂盒。 为实现上述目的，本发明首先提供了用于检测人VKORC1基因rs9923231位点多态 性的分子信标。 本发明提供的用于检测人VKORC1基因rs9923231位点多态性的分子信标由分子信 标甲和分子信标乙组成； 所述分子信标甲的序列为序列表中序列2，其中，序列2第2位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核 苷酸残基，第3位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，第15位为锁核苷酸残基，第29位为5-甲基异 胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第30位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，其余核苷酸残基均为天然核 苷酸残基； 所述分子信标乙的序列为序列表中序列3，其中，序列3第2位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核 苷酸残基，第3位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，第15位为锁核苷酸残基，第29位为5-甲基异 胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第30位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，其余核苷酸残基均为天然核 苷酸残基。 所述分子信标甲和所述分子信标乙的第7-25位均为环状区序列，第1-6位及第26- 4 CN 111593101 A 说 明 书 3/5 页 31位均为茎干区序列。 所述分子信标甲和所述分子信标乙的环状区均靶向VKORC1基因rs9923231位点。 其中，所述分子信标甲靶向VKORC1基因rs9923231位点的“G”；所述分子信标乙靶向VKORC1 基因rs9923231位点的“A”。 进一步的，所述分子信标甲和所述分子信标乙的两端还标记有荧光基团和淬灭基 团，且所述分子信标甲和所述分子信标乙标记的荧光基团不同。所述分子信标甲和所述分 子信标乙标记的淬灭基团可以相同也可以不同。 每个分子信标中，所述荧光基团发出的荧光可被所述淬灭基团吸收。所述荧光基 团和所述淬灭基团可分别位于基础分子信标的5’末端和3’末端，所述荧光基团和所述淬灭 基团的位置也可以交换，只要满足自由状态下的基础分子信标中的荧光基团发出的荧光可 被淬灭基团淬灭即可。 更进一步的，所述荧光基团可为FAM、Hex、TET、Cy3、JOE；所述淬灭基团可为 Dabcyl、TAMRA。在本发明中，所述分子信标甲的5’末端标记有FAM荧光基团，3’末端标记有 Dabcyl淬灭基团；所述分子信标乙的5’末端标记有VIC荧光基团，3’末端标记有Dabcyl淬灭 基团。 为了实现上述目的，本发明又提供了用于检测人VKORC1基因rs9923231位点多态 性的成套试剂。 本发明提供的用于检测人VKORC1基因rs9923231位点多态性的成套试剂由上述分 子信标与能从人基因组中扩增得到含有上述分子信标环状区识别序列的引物对组成。 上述成套试剂中，所述引物对由序列表中序列4所示的单链DNA和序列表中序列5 所示的单链DNA组成。 上述成套试剂中，所述分子信标与所述引物对均独立包装。所述分子信标中的分 子信标甲和所述分子信标乙的摩尔比可为1:1；所述引物对中的两条单链DNA的摩尔比可为 1:1。所述成套试剂中的分子信标甲、分子信标乙与所述引物对的两条单链DNA的摩尔比可 为2:2:5:5。 为了实现上述目的，本发明还提供了用于检测人VKORC1基因rs9923231位点多态 性的试剂盒。 本发明提供的用于检测人VKORC1基因rs9923231位点多态性的试剂盒包括上述分 子信标或上述成套试剂。 所述试剂盒还可包括阳性质控、阴性质控及其他试剂。所述其他试剂可为反应缓 冲液、dNTPs、MgCl2溶液、DNA聚合酶和/或无核酸酶水等试剂。所述阳性质控包括重组质粒 1、重组质粒2和重组质粒3。所述重组质粒1为将大肠杆菌克隆载体pUC57中的EcoRV和SmaI 识别序列间的DNA片段替换为序列1所示的DNA片段（序列1中的VKORC1基因rs9923231位点 为“G”）得到的重组质粒；所述重组质粒2为将大肠杆菌克隆载体pUC57中的EcoRV和SmaI识 别序列间的DNA片段替换为序列1所示的DNA片段（序列1中的VKORC1基因rs9923231位点为 “A”）得到的重组质粒；所述重组质粒3为所述重组质粒1与所述重组质粒2按照摩尔比为1:1 的比例混合得到的。所述阴性质控具体可为无核酸酶水。所述DNA聚合酶具体可为EX Taq DNA聚合酶。 为了实现上述目的，本发明还提供了上述分子信标或上述成套试剂的新用途。 5 CN 111593101 A 说 明 书 4/5 页 本发明提供了上述分子信标或上述成套试剂在检测人VKORC1基因rs9923231位点 多态性中的应用。 本发明还提供了上述分子信标或上述成套试剂在预测或辅助预测待测患者华法 林治疗剂量中的应用。 为了实现上述目的，本发明最后提供了用于检测人VKORC1基因rs9923231位点多 态性的方法。 本发明提供的用于检测人VKORC1基因rs9923231位点多态性的方法包括如下步 骤：利用上述分子信标或上述成套试剂检测待测样本，根据待测样本中荧光信号的变化确 定所述待测样本中VKORC1基因rs9923231位点多态性。 上述方法中，利用所述分子信标或所述成套试剂检测待测样本为利用所述分子信 标或所述成套试剂检测所述待测样本的DNA。 所述根据待测样本中荧光信号的变化确定所述待测样本中VKORC1基因rs9923231 位点多态性的方法如下： 若待测样本释放FAM荧光信号，不释放VIC荧光信号，且FAM荧光信号值不断升高，则待 测样本VKORC1基因rs9923231位点的基因型为或候选为GG基因型； 若待测样本释放VIC荧光信号，不释放FAM荧光信号，且VIC荧光信号值不断升高，则待 测样本VKORC1基因rs9923231位点的基因型为或候选为AA基因型； 若待测样本释放VIC荧光信号和FAM荧光信号，且FAM荧光信号值和VIC荧光信号值均不 断升高，则待测样本VKORC1基因rs9923231位点的基因型为或候选为AG基因型。 所述GG基因型是指待测样本DNA的两条同源染色体上的VKORC1基因rs9923231位 点的碱基均为G的纯合体； 所述AA基因型是指待测样本DNA的两条同源染色体上的VKORC1基因rs9923231位点的 碱基均为A的纯合体； 所述AG基因型是指待测样本DNA的两条同源染色体上的VKORC1基因rs9923231位点的 碱基为A和G的杂合体。 上述方法中，所述待测样本具体可为待测患者（如深静脉血栓患者）的血液样本。 上述分子信标或成套试剂或试剂盒或应用或方法中，所述VKORC1基因rs9923231 位点位于序列1第51位。 与现有技术相比，本发明的有益效果如下：本发明提供的基于基因特异性PCR结合 人工模拟核酸分子信标判断VKORC1基因rs9923231位点多态性的方法不仅准确率高，而且 还具有检测速度快、操作简单、结果判读客观、闭管反应污染少等优点，非常适合于在临床 中大规模开展。 附图说明 图1是分子信标工作原理图。 图2是非天然核苷酸异鸟嘌呤核苷酸残基（isoG）与非天然核苷酸5-甲基异胞嘧啶 脱氧核苷酸残基（isoMeC）的结构图。 图3是锁核苷酸残基的结构图。 图4是本发明实施例2中人VKORC1基因rs9923231位点GG基因型特异性扩增曲线示 6 CN 111593101 A 说 明 书 5/5 页 意图。 图5是本发明实施例2中人VKORC1基因rs9923231位点AA基因型特异性扩增曲线示 意图。 图6是本发明实施例2中人VKORC1基因rs9923231位点AG基因型特异性扩增曲线示 意图。 图7是利用SEQ1和SEQ2引物对、普通Taqman探针SEQ5-FAM和SEQ6-VIC检测标准品 样本1的扩增曲线示意图。 图8是利用SEQ1和SEQ2引物对、普通Taqman探针SEQ5-FAM和SEQ6-VIC检测标准品 样本2的扩增曲线示意图。 7 CN 111593101 A 序 列 表 1/2 页 序列表 <110> <160> 7 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 101 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 1 ccacctcggc ctcccaaaat gctaggatta taggcgtgag ccaccgcacc nggccaatgg 60 ttgtttttca ggtcttctct tgcttgactt cccagaggga t 101 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 2 ccgacacacc gcaccgggcc aatggtgtcg g 31 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 3 ccgacacacc gcaccaggcc aatggtgtcg g 31 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 4 ccacctcggc ctccca 16 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 5 atccctctgg gaagtcaagc 20 <210> 6 <211> 24 <212> DNA 8 CN 111593101 A 序 列 表 2/2 页 <213> 人工序列 <400> 6 gccaccgcac cgggccaatg gttg 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 7 gccaccgcac caggccaatg gttg 24 9 CN 111593101 A 说 明 书 附 图 1/4 页 图1 图2 图3 10 CN 111593101 A 说 明 书 附 图 2/4 页 图4 图5 11 CN 111593101 A 说 明 书 附 图 3/4 页 图6 图7 12 CN 111593101 A 说 明 书 附 图 4/4 页 图8 13
本发明公开了一种VKORC1基因rs9923231位点多态性的分型检测方法与试剂盒。本发明采用VKORC1基因特异性的引物SEQ1和SEQ2扩增VKORC1基因片段，同时在VKORC1基因特异性的引物界定的扩增区域内设计VKORC1基因特异性人工模拟核酸分子信标SEQ3‑FAM和SEQ4‑VIC。本发明提供的 全部
背景技术：
深静脉血栓形成（DVT）是在深静脉中形成的血凝块，常见于股静脉或腘静脉等大 静脉中。常见表现为相关部位的疼痛、肿胀、发热。血凝块可以转移到肺部，形成肺栓塞。DVT 形成的因素包括手术、创伤、癌症、肥胖、吸烟、激素分娩控制、抗磷脂综合征和遗传病等。随 着年龄的增长，其发病率逐渐增加。 目前，抗凝血（血液稀释剂）治疗DVT是普遍采用的方法。典型的药物包括低分子量 的肝素、华法林、香豆素或直接口服抗凝剂。其中，华法林是广泛使用的第一代抗凝血剂，常 用于治疗血栓，预防中风。然而患者对华法林的治疗反应却受到不同因素的影响，如年龄、 性别、维生素K摄入量和药物剂量。此外，某些基因缺陷的个体会出现治疗反应不良，在临床 实践中会导致内出血和中风。全基因组关联研究证实，某些基因与华法林药物代谢相关，它 们与环境等其它因素相互作用，共同影响华法林治疗的给药剂量。 维生素K环氧还原酶复合物1（VKORC1）是内质网的一种小跨膜蛋白，在维生素K途 径中起主要作用，是华法林的靶蛋白。VKORC1基因非编码突变的存在导致蛋白的差异表达， 决定了患者的药物剂量。已发现VKORC1的rs9923231(G/A)是华法林剂量相关的重要标签。A 为低剂量高度敏感型，G为高剂量不敏感型。对该位点进行检测是针对不同患者治疗的重要 依据。 目前，基因多态性检测的方法主要有PCR-Sanger测序法、芯片杂交法、高分辨率溶 解曲线法等。这些方法虽然都可以在一定程度上检测基因多态性，但都有不可忽视的局限 性。Sanger测序法步骤较多，需要PCR后处理，不仅操作繁琐，还易产生污染，并不能满足临 床的需求。芯片杂交法操作繁琐，其检测还依赖于昂贵的设备仪器，导致成本较高。高分辨 率溶解曲线法对仪器要求高，需要具有安装高分辨率软件、温度比较敏感的机器才能使用， 临床推广存在困难。基于Taqman水解探针的荧光定量PCR，利用Taq酶的外切酶活性，切断探 针产生荧光信号，由于Taqman探针荧光基团与淬灭基团并不紧密靠近，导致荧光淬灭不彻 底，存在背景荧光信号。此外，Taqman探针对于单碱基错配识别能力较差，极易生成 非特异 荧光信号，干扰结果判读，进而影响检测的准确性。因此，临床上迫切需要一种简便易行、灵 敏度高、准确可靠的检测基因多态性的方法。 分子信标（Molecular Beacon）在空间结构上呈发夹型，由环状区和茎干区组成， 环状区与靶DNA序列互补，长约15-35个核苷酸，茎杆区长约5-7个核苷酸，由GC含量较高的 与靶序列无关的互补序列构成，分子信标的5′端标记荧光基团（F），3′端标记淬灭基团（Q）。 对于分子信标来说，自由状态时，荧光基团与淬灭基团靠近（约为7-10nm）。此时发生荧光共 振能量转移，使荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被 3 CN 111593101 A 说 明 书 2/5 页 淬灭，荧光本底极低。当分子信标的环状区与序列完全互补的靶DNA杂交形成双链杂交体 时，分子信标茎杆区被拉开，荧光基团和淬灭基团距离增大。根据Foerster理论，中心荧光 能量转移效率与两者距离的6次方成反比，因此，杂交后分子信标的荧光几乎100%恢复，且 所检测到的荧光强度与溶液中靶DNA的量成正比（图1）。因此，理想的分子信标比Taqman水 解探针更为高效。然而，由于分子信标中与靶序列无关的茎杆区的引入导致分子信标与模 板序列之间常会产生一些非特异性相互作用，从而导致背景信号增强，进而影响检测效率。 而要消除这种背景信号，就会对分子信标的设计尤其是茎杆区的序列设计产生很高的要 求。此外，研究显示分子信标在环状区序列较短时，用于检测基因突变（包括单碱基的错配、 缺失或插入突变）效果较好，但实际上，很多时候，由于特定靶序列区的GC含量较低，往往会 导致环状区序列过长，从而影响检测效率。因此，得到一个理想的分子信标往往比较困难。 针对碱基的修饰改造也就是人工模拟的非天然核苷酸对的研究发展至今已有近 40年的历史，这其中异胞嘧啶脱氧核苷酸-异鸟嘌呤脱氧核苷酸（isoC-isoG）及其衍生物5- 甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸-异鸟嘌呤脱氧核苷酸（isoMeC-isoG）中的人工核苷酸对堪称经 典。有关isoC-isoG中的核苷酸对的研究工作最早是由美国著名合成生物学家Benner SA开 展的，其团队实现了异胞嘧啶脱氧核苷酸-异鸟嘌呤脱氧核苷酸（isoC-isoG）的人工扩展核 酸在体外的复制、转录乃至翻译的整个中心法则。如图2所示，isoC和isoG分别是天然核苷 酸C和G的异构体，它们自身可以完美配对，但无法与天然核苷酸之间形成配对。 除了以上人工对碱基结构的改造，还有一大类基于对碱基糖环的改造的非天然核 酸，如锁核酸（LNA）。LNA泛指含有一个或多个LNA单体（锁核苷酸）的寡核苷酸序列，是一类 近年来迅速发展起来的并且已经在分子诊断、基因治疗等领域得到广泛应用的人工模拟核 酸。如图3所示，LNA单体的戊糖环的2’-O和4’-C之间形成了一个亚甲基桥。LNA不改变天然 核酸的碱基配对，但相对于天然核酸有着更强的亲和力以及更强的错配识别能力。
技术实现要素：
本发明的目的是基于人工模拟核酸的分子信标提供一种新型的VKORC1基因 rs9923231多态性位点的分型检测方法与试剂盒。 为实现上述目的，本发明首先提供了用于检测人VKORC1基因rs9923231位点多态 性的分子信标。 本发明提供的用于检测人VKORC1基因rs9923231位点多态性的分子信标由分子信 标甲和分子信标乙组成； 所述分子信标甲的序列为序列表中序列2，其中，序列2第2位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核 苷酸残基，第3位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，第15位为锁核苷酸残基，第29位为5-甲基异 胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第30位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，其余核苷酸残基均为天然核 苷酸残基； 所述分子信标乙的序列为序列表中序列3，其中，序列3第2位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核 苷酸残基，第3位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，第15位为锁核苷酸残基，第29位为5-甲基异 胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第30位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，其余核苷酸残基均为天然核 苷酸残基。 所述分子信标甲和所述分子信标乙的第7-25位均为环状区序列，第1-6位及第26- 4 CN 111593101 A 说 明 书 3/5 页 31位均为茎干区序列。 所述分子信标甲和所述分子信标乙的环状区均靶向VKORC1基因rs9923231位点。 其中，所述分子信标甲靶向VKORC1基因rs9923231位点的“G”；所述分子信标乙靶向VKORC1 基因rs9923231位点的“A”。 进一步的，所述分子信标甲和所述分子信标乙的两端还标记有荧光基团和淬灭基 团，且所述分子信标甲和所述分子信标乙标记的荧光基团不同。所述分子信标甲和所述分 子信标乙标记的淬灭基团可以相同也可以不同。 每个分子信标中，所述荧光基团发出的荧光可被所述淬灭基团吸收。所述荧光基 团和所述淬灭基团可分别位于基础分子信标的5’末端和3’末端，所述荧光基团和所述淬灭 基团的位置也可以交换，只要满足自由状态下的基础分子信标中的荧光基团发出的荧光可 被淬灭基团淬灭即可。 更进一步的，所述荧光基团可为FAM、Hex、TET、Cy3、JOE；所述淬灭基团可为 Dabcyl、TAMRA。在本发明中，所述分子信标甲的5’末端标记有FAM荧光基团，3’末端标记有 Dabcyl淬灭基团；所述分子信标乙的5’末端标记有VIC荧光基团，3’末端标记有Dabcyl淬灭 基团。 为了实现上述目的，本发明又提供了用于检测人VKORC1基因rs9923231位点多态 性的成套试剂。 本发明提供的用于检测人VKORC1基因rs9923231位点多态性的成套试剂由上述分 子信标与能从人基因组中扩增得到含有上述分子信标环状区识别序列的引物对组成。 上述成套试剂中，所述引物对由序列表中序列4所示的单链DNA和序列表中序列5 所示的单链DNA组成。 上述成套试剂中，所述分子信标与所述引物对均独立包装。所述分子信标中的分 子信标甲和所述分子信标乙的摩尔比可为1:1；所述引物对中的两条单链DNA的摩尔比可为 1:1。所述成套试剂中的分子信标甲、分子信标乙与所述引物对的两条单链DNA的摩尔比可 为2:2:5:5。 为了实现上述目的，本发明还提供了用于检测人VKORC1基因rs9923231位点多态 性的试剂盒。 本发明提供的用于检测人VKORC1基因rs9923231位点多态性的试剂盒包括上述分 子信标或上述成套试剂。 所述试剂盒还可包括阳性质控、阴性质控及其他试剂。所述其他试剂可为反应缓 冲液、dNTPs、MgCl2溶液、DNA聚合酶和/或无核酸酶水等试剂。所述阳性质控包括重组质粒 1、重组质粒2和重组质粒3。所述重组质粒1为将大肠杆菌克隆载体pUC57中的EcoRV和SmaI 识别序列间的DNA片段替换为序列1所示的DNA片段（序列1中的VKORC1基因rs9923231位点 为“G”）得到的重组质粒；所述重组质粒2为将大肠杆菌克隆载体pUC57中的EcoRV和SmaI识 别序列间的DNA片段替换为序列1所示的DNA片段（序列1中的VKORC1基因rs9923231位点为 “A”）得到的重组质粒；所述重组质粒3为所述重组质粒1与所述重组质粒2按照摩尔比为1:1 的比例混合得到的。所述阴性质控具体可为无核酸酶水。所述DNA聚合酶具体可为EX Taq DNA聚合酶。 为了实现上述目的，本发明还提供了上述分子信标或上述成套试剂的新用途。 5 CN 111593101 A 说 明 书 4/5 页 本发明提供了上述分子信标或上述成套试剂在检测人VKORC1基因rs9923231位点 多态性中的应用。 本发明还提供了上述分子信标或上述成套试剂在预测或辅助预测待测患者华法 林治疗剂量中的应用。 为了实现上述目的，本发明最后提供了用于检测人VKORC1基因rs9923231位点多 态性的方法。 本发明提供的用于检测人VKORC1基因rs9923231位点多态性的方法包括如下步 骤：利用上述分子信标或上述成套试剂检测待测样本，根据待测样本中荧光信号的变化确 定所述待测样本中VKORC1基因rs9923231位点多态性。 上述方法中，利用所述分子信标或所述成套试剂检测待测样本为利用所述分子信 标或所述成套试剂检测所述待测样本的DNA。 所述根据待测样本中荧光信号的变化确定所述待测样本中VKORC1基因rs9923231 位点多态性的方法如下： 若待测样本释放FAM荧光信号，不释放VIC荧光信号，且FAM荧光信号值不断升高，则待 测样本VKORC1基因rs9923231位点的基因型为或候选为GG基因型； 若待测样本释放VIC荧光信号，不释放FAM荧光信号，且VIC荧光信号值不断升高，则待 测样本VKORC1基因rs9923231位点的基因型为或候选为AA基因型； 若待测样本释放VIC荧光信号和FAM荧光信号，且FAM荧光信号值和VIC荧光信号值均不 断升高，则待测样本VKORC1基因rs9923231位点的基因型为或候选为AG基因型。 所述GG基因型是指待测样本DNA的两条同源染色体上的VKORC1基因rs9923231位 点的碱基均为G的纯合体； 所述AA基因型是指待测样本DNA的两条同源染色体上的VKORC1基因rs9923231位点的 碱基均为A的纯合体； 所述AG基因型是指待测样本DNA的两条同源染色体上的VKORC1基因rs9923231位点的 碱基为A和G的杂合体。 上述方法中，所述待测样本具体可为待测患者（如深静脉血栓患者）的血液样本。 上述分子信标或成套试剂或试剂盒或应用或方法中，所述VKORC1基因rs9923231 位点位于序列1第51位。 与现有技术相比，本发明的有益效果如下：本发明提供的基于基因特异性PCR结合 人工模拟核酸分子信标判断VKORC1基因rs9923231位点多态性的方法不仅准确率高，而且 还具有检测速度快、操作简单、结果判读客观、闭管反应污染少等优点，非常适合于在临床 中大规模开展。 附图说明 图1是分子信标工作原理图。 图2是非天然核苷酸异鸟嘌呤核苷酸残基（isoG）与非天然核苷酸5-甲基异胞嘧啶 脱氧核苷酸残基（isoMeC）的结构图。 图3是锁核苷酸残基的结构图。 图4是本发明实施例2中人VKORC1基因rs9923231位点GG基因型特异性扩增曲线示 6 CN 111593101 A 说 明 书 5/5 页 意图。 图5是本发明实施例2中人VKORC1基因rs9923231位点AA基因型特异性扩增曲线示 意图。 图6是本发明实施例2中人VKORC1基因rs9923231位点AG基因型特异性扩增曲线示 意图。 图7是利用SEQ1和SEQ2引物对、普通Taqman探针SEQ5-FAM和SEQ6-VIC检测标准品 样本1的扩增曲线示意图。 图8是利用SEQ1和SEQ2引物对、普通Taqman探针SEQ5-FAM和SEQ6-VIC检测标准品 样本2的扩增曲线示意图。 7 CN 111593101 A 序 列 表 1/2 页 序列表 <110> <160> 7 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 101 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 1 ccacctcggc ctcccaaaat gctaggatta taggcgtgag ccaccgcacc nggccaatgg 60 ttgtttttca ggtcttctct tgcttgactt cccagaggga t 101 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 2 ccgacacacc gcaccgggcc aatggtgtcg g 31 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 3 ccgacacacc gcaccaggcc aatggtgtcg g 31 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 4 ccacctcggc ctccca 16 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 5 atccctctgg gaagtcaagc 20 <210> 6 <211> 24 <212> DNA 8 CN 111593101 A 序 列 表 2/2 页 <213> 人工序列 <400> 6 gccaccgcac cgggccaatg gttg 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 7 gccaccgcac caggccaatg gttg 24 9 CN 111593101 A 说 明 书 附 图 1/4 页 图1 图2 图3 10 CN 111593101 A 说 明 书 附 图 2/4 页 图4 图5 11 CN 111593101 A 说 明 书 附 图 3/4 页 图6 图7 12 CN 111593101 A 说 明 书 附 图 4/4 页 图8 13
