技术摘要：
本发明公开了一种用于生产(R)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯的酮还原酶突变体，属于生物技术领域，其源于Meyerozyma guilliermondii的野生型酮还原酶，能将4‑氯乙酰乙酸乙酯转化生成(R)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯，与野生型序列相比具有更高的醇脱氢酶活性，该酮还原酶突变  全部
背景技术：
酮还原酶是一种多用途催化剂，通过醛或酮的对映体选择性还原成对应醇。  (R) 特异性酮还原酶与(S)特异性酮还原酶具有不同特性，并且这些催化剂在光学活性醇的工 业合成中被越来越频繁地用到。旋光性是许多医药和农药活性化合物选择性作用的必要条 件，在一些情况下，一个对映体具有有益的药物活性，另一个对映体却具有基因毒性作用。 因此，在药用和农药用活性化合物的合成中，需要使用具有所要求的立体特异性的催化剂 合成光学活性醇。 手性纯的(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯是一种重要的手性醇。(R)-CHBE(4-氯-3-  羟 基丁酸乙酯)已经被用作(R)-肉碱，R-4-氨基-3-羟基丁酸，(R)-4-羟基-2-吡咯烷酮和其他 五烯化学品的主要前体。并且近年来有报道将(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯用于超级他汀类 药物的新合成路线，有望打破原合成工艺的专利垄断。一些属于SDRs的氧化还原酶已被筛 选并应用于生物还原4-氯乙酰乙酸乙酯为CHBE  (4-氯-3-羟基丁酸乙酯)。大多数报道的微 生物酶产生的都是(S)型CHBE，并同时具有高对映选择性和高产率。但是，仅有极少有酶能 产生(R)型CHBE，并伴随立体选择性较低(如70％e.e.)或产率低等特性。许等人报道了一株 产酮的芽孢杆菌还原酶，其中一个羰基还原酶能转化COBE为(R)-CHBE(99.6％e.e.)，收率 为91.7％，但是需要用到水-甲苯两相系统底物需要分三次加入反应体系，增加了生产成本 并加重了生产负担；并且该催化体系活力偏低，需要依赖投入大量的酶或细胞才能使反应 结束(0.5g干细胞催化2.158g底物)，对于市场需用量大价格低廉的中间体CHBE来说该工艺 几乎不具有放大前景。 日本人Kataoka等使用Sporobolomyces  salmonicolor来源的酮还原酶被用来做 (R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，底物浓度高达300gL，但是只有92％的手性纯度，无法应用于对 手性纯度高要求的药物合成。 中国专利CN104988085A利用(R)4-氯-3-羟基丁酸乙酯及其衍生物的生物合成方 法，以4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)及其衍生物为起始原料，利用重组E.coli CCZU-H15静息细 胞为生物催化剂，以葡萄糖为辅底物，实现了(R)-CHBE及其衍生物的合成。 中国专利CN103160547中利用Candida  albicans来源的醇脱氢酶不对称还原  4- 氯乙酰乙酸乙酯制备(R)-4-氯-3羟基丁酸乙酯，以醇脱氢酶为催化剂，以4-氯乙酰乙酸乙 酯为底物，以NADH为辅因子，不对称还原制备(R)-4-氯-3羟基丁酸乙酯。但是底物浓度仅为 25g/L-50g/L，且投酶量过高(5g菌体/25ml体系)，转化率低，不具备工业生产前景。
技术实现要素：
本发明的主要目的是为了提供一种用于生产(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的酮还原 3 CN 111575256 A 说　明　书 2/9 页 酶突变体。 本发明的目的可以通过采用如下技术方案达到： 一种用于生产(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的酮还原酶突变体，其源于  Meyerozyma  guilliermondii的野生型酮还原酶，能将4-氯乙酰乙酸乙酯转化生成  (R)-4-氯-3-羟基丁 酸乙酯，与野生型序列相比具有更高的醇脱氢酶活性，与SEQ ID  NO.8具有90％以上相似性 且具有以下特征中的一个或多个突变：R13K，  G77D，N89G，T92A，L97N，F131Y，T138P，L146I， G149N，L150V，M154V，  V157A，L166Y，V169I，H170K，L176V，A180S，N200A，Y201F，C203A，  C208V，C247V，G248S，L278F，S283L，R285L，G295W，W307L，T309S，  Q327E，K330E，R331K，该酮 还原酶突变体的序列为SEQ  ID  NO.2。 一种用于生产(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的酮还原酶突变体，该酮还原酶突变体 的酶活性比野生型酮还原酶的活性至少增强2-10倍。 一种多核苷酸，该多核苷酸的编码由序列为SEQ  ID  NO.2的酮还原酶重组的多肽。 一种多核苷酸，该多核苷酸的序列为SEQ  ID  NO.1。 一种重组质粒，包括表达载体连接序列为SEQ  ID  NO.1的多核苷。 一种宿主细胞，其包含所述的重组质粒。 一种宿主细胞，该细胞是一种大肠杆菌。 一种宿主细胞，所述重组质粒的密码子已经为在宿主细胞中表达而进行优化了的 密码子。 一种生产(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，包括在与序列为SEQ  ID  NO.2 的酮 还原酶突变体的存在下，将4-氯乙酰乙酸乙酯转化生成(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。 本发明的有益技术效果： 本专利提供一种医药中间体(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的制备方法，整个体系使 用单酶或双酶催化，使用葡萄糖或醇类用于辅酶循环，底物浓度高达  120g/L-200g/L，手性 纯度大于99％，底物用量/NAD用量高达3017∶1，辅酶循环次数高，使得(R)-4-氯-3-羟基丁 酸乙酯生产成本接近(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，有效的扩大了下游应用范围。 本发明人发现，微生物Meyerozyma  guilliermondii中天然存在的野生型酮还原 酶，具有将4-氯乙酰乙酸乙酯转化生成(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的潜力。本公开内容的发 明人已发现包括在一定位置突变的酮还原酶与Meyerozyma guilliermondii产生的野生型 酮还原酶(SEQ  ID  NO：8)相比表现出增加的催化活性。″野生型酮还原酶″、″野生型KRED酶″ 及″野生型KRED酮还原酶″指由源自Meyerozyma  guilliermondii的具有SEQ  ID  NO：8氨基 酸序列的酮还原酶。该酶可将4-氯乙酰乙酸乙酯转化生成(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。″野 生型″指与自然中所发现的一样的材料或物质的形式。实施例如野生型的蛋白质或核酸序 列是可以从自然界中的分离并且未经过人为修饰的，在生物体中存在的原始序列形式。″增 加的催化活性″指在体外或体内试验中所测量的与野生型酮还原酶相比，表现出使底物(实 施例如4-氯乙酰乙酸乙酯)向产物(实施例如(R)-4- 氯-3-羟基丁酸乙酯)转化速率增加的 酮还原酶。 本发明提供一种酮还原酶突变体，其源于Meyerozyma  guilliermondii的野生型 酮还原酶，表现出使底物(实施例如4-氯乙酰乙酸乙酯)向产物(实施例如  (R)-4-氯-3-羟 基丁酸乙酯)转化速率增加的酮还原酶。所述酮还原酶突变体，与  SEQ  ID  NO.8的野生型酮 4 CN 111575256 A 说　明　书 3/9 页 还原酶相比表现出更强的催化活性。酮还原酶突变体和编码这种突变体的多核苷酸可以使 用本领域技术人员通常使用的方法制备。突变体可以通过使编码该酶的体外重组、多核苷 酸诱变、DNA改组、易错PCR和定向进化方法等获得。 上述酮还原酶突变体，具有选自以下特征中的一个或多个突变： R13K，G77D，N89G，T92A，L97N，F131Y，T138P，L146I，G149N，L150V，M154V，V157A， L166Y，V169I，H170K，L176V，A180S，N200A，Y201F，  C203A，C208V，C247V，G248S，L278F， S283L，R285L，G295W，W307L，  T309S，Q327E，K330E，R331K。 上述酮还原酶突变体，优先自序列SEQ  ID  NO.2，全长突变的酮还原酶对于保持酶 的催化活性并不是必需的。相应地，应考虑酮还原酶突变体的截短的类似物和有催化活性 的片段。实施例如，在一些实施方案中，C端或N端的数个氨基酸可以被删去。任何特定的截 短的类似物或片段可以利用相应的试验来评估催化活性。同样的，额外的氨基酸残基可以 被添加到一个或两个末端而不影响催化活性。额外序列可以是功能性的或非功能性的。实 施例如，额外氨基酸序列可以被用来帮助纯化，做为标记，或执行一些其它的功能。因此，本 公开内容的酮还原酶突变体可以是融合蛋白的形式，其中酮还原酶突变体(或其片段)诸如 通过助溶标签(如SUMO蛋白)、纯化标签(如结合金属的His标签)  和细菌定位信号(如分泌 信号)的实施例而非限制的方式被融合到其它蛋白质。 本发明提供一种酮还原酶突变体，其酮还原酶活性比野生型酮还原酶的活性至少 增强2-10倍。 上述酮还原酶突变体编码序列，其优选自SEQ  ID  NO.1，其已经过序列优化以适于 在大肠杆菌中表达。在一些实施方案中，多核苷酸包括被优化用于在特定类型的宿主细胞 中表达的密码子。用于各种不同类型的微生物的密码子的使用和偏好性是已知的，因为其 是用于在这些微生物的表达特定的氨基酸的优化的密码子。本发明提供一种重组质粒，在 一些实施方案中，控制序列包括启动子、前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列 和转录终止子等。对于细菌宿主细胞，指导编码序列的转录的适合的启动子包括但不限于 从噬菌体  T5、噬菌体T7、噬菌体lambda、大肠杆菌lacUV5操纵子、大肠杆菌trp操纵子、大肠 杆菌tac操纵子等。 附图说明 图1为Mgu-3的表达质粒图谱。 图2为Mgu-CK，Mgu-1，Mgu-2，Mgu-3，生物转化反应21小时的TLC 图谱，从左至右依 次为Mgu-CK，Mgu-1，Mgu-2，Mgu-3，上方黄色条带为底物，下方白色条带为产物。 图3为Mgu-2在不同反应条件下生物转化20小时的TLC图谱，从左至右依次为实施 例12，实施例13，实施例14，实施例15的反应结果。 图4为Mgu-3在200g/L底物浓度下生物转化5.5小时的TLC图谱，从左至右依次为实 施例16，实施例17，实施例18的反应结果。 图5为手性检测图谱，自上而下依次为S型标准品，R型标准品，对照反应实施例19 产物，实施例10产物。 5 CN 111575256 A 说　明　书 4/9 页