技术摘要：
本发明提供了一种新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液的纯化方法。该方法包括：将灭活的病毒液通过滤膜初步过滤，然后通过滤膜超滤浓缩得到新型冠状病毒浓缩液；加入核酸酶，降解Vero细胞中残留的DNA；将复合填料Capto Core 700装入层析柱中，先采用碱液冲洗，再用洗脱 全部
背景技术：
2019年底发现的新型冠状病毒SARS-CoV-2疫情迅速席卷全球，对全球各地区人民 的生命健康和社会的经济发展都带来巨大的损失。 疫苗作为狙击和预防新冠病毒的一种有效方式，成为全球药物研发的关注焦点。 灭活疫苗是指将通过物理或者化学的方法使病毒失去感染性和复制能力，但保留 了病毒能引起人体免疫应答的活性而制备成的疫苗。灭活疫苗是针对新发突发传染病最有 效的疫苗研发途径。具有生产工艺成熟、质量标准可控、保护范围广等优点，可用于大规模 接种，并且有国际通行标准来判断疫苗的安全性和有效性。 SARS-CoV-2病毒直径在为60～140nm，主要有4种结构蛋白，分别为S(棘突)蛋白、N (核衣壳)蛋白、M(膜)蛋白、E(包膜)蛋白。其中，S蛋白是病毒最重要的表面膜蛋白，也是引 起免疫应答的重要抗原，是疫苗设计的关键靶点。因此，高效、快速地完成病毒纯化同时减 少表面S蛋白的损伤对制备灭活疫苗至关重要。 Capto core 700是一种复合模式的层析填料，由辛胺配基核心和惰性壳层组成， 惰性壳层可以阻排分子量大于700KD的分子，阻止其经壳上的孔进入核心；内层含有带正电 荷且具有疏水性的辛胺配基，常见的宿主蛋白、DNA片段、核酸酶的杂质均可以进入孔内与 辛胺基结合而被去除。适用于病毒类疫苗凝胶过滤纯化，可以去除培养基中的杂蛋白、宿主 细胞蛋白，具有处理量大、流速快、化学稳定性高和良好的机械性能等特点，易于实现规模 扩大。 目前对新型冠状病毒尚无有效的预防疫苗，未发现应用复合填料Capto Core 700 纯化新型冠状病毒灭活疫苗的技术报道。
技术实现要素：
为了能够快速制备灭活疫苗，尽可能地去除病毒培养液中所含的宿主蛋白与DNA 等杂质，本发明的目的在于采用Capto core 700复合填料纯化新型冠状病毒(SARS-CoV-2) Vero细胞灭活疫苗病毒液；新冠病毒SARS-CoV-2的分子大小在100nm左右，不能进去空隙从 而以流穿模式得到纯化。 本发明的目的通过以下技术方案得以实现： 一方面，本发明提供一种新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液的纯化方法，其 包括以下步骤： 将灭活的新型冠状病毒Vero细胞病毒液通过滤膜初步过滤，除去细胞碎片及部分 杂蛋白；然后通过滤膜超滤浓缩得到新型冠状病毒浓缩液； 向新型冠状病毒浓缩液中加入核酸酶，降解Vero细胞中残留的DNA； 3 CN 111575249 A 说 明 书 2/5 页 将复合填料Capto Core 700装入层析柱中，先采用碱液冲洗(至少1个柱体积，去 除内毒素)，然后再用洗脱液平衡2～5个柱体积，接着将核酸酶处理后的新型冠状病毒浓缩 液泵入到层析柱中，采用洗脱液洗脱；在紫外检测波长280nm条件下，收集第一个流穿峰即 为新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒纯化液。 纯化新型冠状病毒Vero细胞病毒液的难点在于需要高效、快速的完成病毒纯化同 时减少表面抗原的损伤，尽可能去除宿主细胞蛋白与DNA，以符合疫苗质量标准。本发明创 造性地采用“核酸酶处理 复合填料Capto Core 700一步纯化法”，通过向新型冠状病毒浓 缩液中加入核酸酶能够将宿主Vero细胞DNA裂解为小片段，同时对新冠病毒不会造成损伤， 再通过Capto core 700纯化后能够更加有效去除宿主细胞DNA与杂蛋白；两种操作的组合 能够保证抗原的高效回收，同时有效去除宿主Vero细胞DNA与杂蛋白。 本发明的纯化方法中，先采用碱液冲洗能够除去纯化前层析系统、管路以及填料 中都可能有细菌残留，这些残留的细菌会产生内毒素，进入人体会造成发热、内毒素休克等 不良影响。 新型冠状病毒主要通过呼吸道传播，传播能力强，灭活病毒疫苗生产难度高，在生 产工艺中可能产生气溶胶；因此，本发明的纯化方法中，收获的新型冠状病毒Vero细胞病毒 液首先进行灭活，是针对新冠病毒的特殊工艺操作。 灭活步骤包括： 向收获的新型冠状病毒Vero细胞病毒液中加入灭活剂β-丙内酯(β-丙内酯与病毒 液的体积比为1:(2000～8000))，静置于2～8℃冰箱内灭活，灭活时间为16～48h；灭活完成 后进行水解，水解步骤为：将病毒液置于恒温箱内37℃水解2小时，得到灭活的新型冠状病 毒Vero细胞病毒液。 上述的纯化方法中，优选地，所述新型冠状病毒为冠状病毒SARS-CoV-2。 上述的纯化方法中，优选地，进行初步过滤的滤膜孔径为0.45～5.0μm。 上述的纯化方法中，优选地，进行超滤浓缩的滤膜的截留分子量为100～300KD。 上述的纯化方法中，优选地，超滤浓缩体积为10倍以上。 上述的纯化方法中，优选地，向新型冠状病毒浓缩液中加入核酸酶，使核酸酶在浓 缩液中的终浓度为50～300U/ml，室温下放置2～12h或37℃下放置0.5～4h，降解Vero细胞 中残留的DNA。 上述的纯化方法中，优选地，将复合填料Capto Core 700装入层析柱中的柱高为 20～50cm。 上述的纯化方法中，优选地，所述碱液为1mol/L的氢氧化钠溶液。采用1mol/L的 NaOH溶液冲洗能够有效去除层析系统、管路、填料中的内毒素，使产品符合质量标准。 上述的纯化方法中，优选地，所述洗脱液为pH值为6.2～8.0的PBS缓冲液。 上述的纯化方法中，优选地，采用洗脱液进行洗脱的洗脱流速为30～100cm/h。 上述的纯化方法中，优选地，将核酸酶处理后的新型冠状病毒浓缩液泵入到层析 柱中的上样体积为柱体积的10％～30％。 上述的纯化方法中，优选地，所述核酸酶包括全能核酸酶，优选采用Benzonase核 酸酶和/或Biolonase核酸酶。 本发明的纯化方法中，关键在于确定了应用复合填料Capto Core 700纯化新型冠 4 CN 111575249 A 说 明 书 3/5 页 状病毒灭活疫苗纯化液有重要影响的因素条件：柱高、上样体积占柱体积百分比、洗脱溶液 pH，洗脱流速等。通过控制这些因素条件在本发明的范围内，能成功纯化出以Vero细胞为基 质的新型冠状病毒纯化液，所得病毒纯化液具有较高的抗原回收率，并较好地去除培养液 中的残余细胞宿主蛋白和DNA，符合国家限量标准。 上述的纯化方法中，优选地，所述层析柱包括XK50/60层析柱、XK16/40层析柱或 BPG 140/500层析柱。 另一方面，本发明还提供一种新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒纯化液，其是 采用上述纯化方法纯化获得的。 再一方面，本发明还提供一种新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗，其是采用上述新 型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒纯化液经过适当稀释后配制新型冠状病毒灭活疫苗，配 制后分装，即为Vero细胞新型冠状病毒灭活疫苗制品。 本发明的有益效果： 本发明通过采用超滤浓缩、核酸酶消化和柱层析工艺步骤，结合柱层析首次采用 复合填料Capto Core 700对新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液进行纯化，能够快速、 稳定地大规模生产新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒纯化液。 附图说明 图1显示应用Capto core 700纯化后的新冠病毒纯化液，经过聚丙烯凝胶电泳 (SDS-PAGE)方法进行鉴定的图谱(M：marker；1：病毒浓缩液；2：病毒纯化液)。 图2显示应用Capto core 700纯化后的新冠病毒纯化液，经过Western Blot方法 进行鉴定的图谱(从左到右分别为：一抗：抗S蛋白；一抗：抗N蛋白；一抗：新冠肺炎恢复期患 者血清)。 图3显示应用Capto core 700纯化后的新冠病毒纯化液，经过HPLC方法进行纯度 分析的图谱。 图4显示应用Capto core 700纯化后的新冠病毒纯化液的电镜图片(A为全局图， B、C为局部放大图)。
本发明提供了一种新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液的纯化方法。该方法包括：将灭活的病毒液通过滤膜初步过滤，然后通过滤膜超滤浓缩得到新型冠状病毒浓缩液；加入核酸酶，降解Vero细胞中残留的DNA；将复合填料Capto Core 700装入层析柱中，先采用碱液冲洗，再用洗脱 全部
背景技术：
2019年底发现的新型冠状病毒SARS-CoV-2疫情迅速席卷全球，对全球各地区人民 的生命健康和社会的经济发展都带来巨大的损失。 疫苗作为狙击和预防新冠病毒的一种有效方式，成为全球药物研发的关注焦点。 灭活疫苗是指将通过物理或者化学的方法使病毒失去感染性和复制能力，但保留 了病毒能引起人体免疫应答的活性而制备成的疫苗。灭活疫苗是针对新发突发传染病最有 效的疫苗研发途径。具有生产工艺成熟、质量标准可控、保护范围广等优点，可用于大规模 接种，并且有国际通行标准来判断疫苗的安全性和有效性。 SARS-CoV-2病毒直径在为60～140nm，主要有4种结构蛋白，分别为S(棘突)蛋白、N (核衣壳)蛋白、M(膜)蛋白、E(包膜)蛋白。其中，S蛋白是病毒最重要的表面膜蛋白，也是引 起免疫应答的重要抗原，是疫苗设计的关键靶点。因此，高效、快速地完成病毒纯化同时减 少表面S蛋白的损伤对制备灭活疫苗至关重要。 Capto core 700是一种复合模式的层析填料，由辛胺配基核心和惰性壳层组成， 惰性壳层可以阻排分子量大于700KD的分子，阻止其经壳上的孔进入核心；内层含有带正电 荷且具有疏水性的辛胺配基，常见的宿主蛋白、DNA片段、核酸酶的杂质均可以进入孔内与 辛胺基结合而被去除。适用于病毒类疫苗凝胶过滤纯化，可以去除培养基中的杂蛋白、宿主 细胞蛋白，具有处理量大、流速快、化学稳定性高和良好的机械性能等特点，易于实现规模 扩大。 目前对新型冠状病毒尚无有效的预防疫苗，未发现应用复合填料Capto Core 700 纯化新型冠状病毒灭活疫苗的技术报道。
技术实现要素：
为了能够快速制备灭活疫苗，尽可能地去除病毒培养液中所含的宿主蛋白与DNA 等杂质，本发明的目的在于采用Capto core 700复合填料纯化新型冠状病毒(SARS-CoV-2) Vero细胞灭活疫苗病毒液；新冠病毒SARS-CoV-2的分子大小在100nm左右，不能进去空隙从 而以流穿模式得到纯化。 本发明的目的通过以下技术方案得以实现： 一方面，本发明提供一种新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液的纯化方法，其 包括以下步骤： 将灭活的新型冠状病毒Vero细胞病毒液通过滤膜初步过滤，除去细胞碎片及部分 杂蛋白；然后通过滤膜超滤浓缩得到新型冠状病毒浓缩液； 向新型冠状病毒浓缩液中加入核酸酶，降解Vero细胞中残留的DNA； 3 CN 111575249 A 说 明 书 2/5 页 将复合填料Capto Core 700装入层析柱中，先采用碱液冲洗(至少1个柱体积，去 除内毒素)，然后再用洗脱液平衡2～5个柱体积，接着将核酸酶处理后的新型冠状病毒浓缩 液泵入到层析柱中，采用洗脱液洗脱；在紫外检测波长280nm条件下，收集第一个流穿峰即 为新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒纯化液。 纯化新型冠状病毒Vero细胞病毒液的难点在于需要高效、快速的完成病毒纯化同 时减少表面抗原的损伤，尽可能去除宿主细胞蛋白与DNA，以符合疫苗质量标准。本发明创 造性地采用“核酸酶处理 复合填料Capto Core 700一步纯化法”，通过向新型冠状病毒浓 缩液中加入核酸酶能够将宿主Vero细胞DNA裂解为小片段，同时对新冠病毒不会造成损伤， 再通过Capto core 700纯化后能够更加有效去除宿主细胞DNA与杂蛋白；两种操作的组合 能够保证抗原的高效回收，同时有效去除宿主Vero细胞DNA与杂蛋白。 本发明的纯化方法中，先采用碱液冲洗能够除去纯化前层析系统、管路以及填料 中都可能有细菌残留，这些残留的细菌会产生内毒素，进入人体会造成发热、内毒素休克等 不良影响。 新型冠状病毒主要通过呼吸道传播，传播能力强，灭活病毒疫苗生产难度高，在生 产工艺中可能产生气溶胶；因此，本发明的纯化方法中，收获的新型冠状病毒Vero细胞病毒 液首先进行灭活，是针对新冠病毒的特殊工艺操作。 灭活步骤包括： 向收获的新型冠状病毒Vero细胞病毒液中加入灭活剂β-丙内酯(β-丙内酯与病毒 液的体积比为1:(2000～8000))，静置于2～8℃冰箱内灭活，灭活时间为16～48h；灭活完成 后进行水解，水解步骤为：将病毒液置于恒温箱内37℃水解2小时，得到灭活的新型冠状病 毒Vero细胞病毒液。 上述的纯化方法中，优选地，所述新型冠状病毒为冠状病毒SARS-CoV-2。 上述的纯化方法中，优选地，进行初步过滤的滤膜孔径为0.45～5.0μm。 上述的纯化方法中，优选地，进行超滤浓缩的滤膜的截留分子量为100～300KD。 上述的纯化方法中，优选地，超滤浓缩体积为10倍以上。 上述的纯化方法中，优选地，向新型冠状病毒浓缩液中加入核酸酶，使核酸酶在浓 缩液中的终浓度为50～300U/ml，室温下放置2～12h或37℃下放置0.5～4h，降解Vero细胞 中残留的DNA。 上述的纯化方法中，优选地，将复合填料Capto Core 700装入层析柱中的柱高为 20～50cm。 上述的纯化方法中，优选地，所述碱液为1mol/L的氢氧化钠溶液。采用1mol/L的 NaOH溶液冲洗能够有效去除层析系统、管路、填料中的内毒素，使产品符合质量标准。 上述的纯化方法中，优选地，所述洗脱液为pH值为6.2～8.0的PBS缓冲液。 上述的纯化方法中，优选地，采用洗脱液进行洗脱的洗脱流速为30～100cm/h。 上述的纯化方法中，优选地，将核酸酶处理后的新型冠状病毒浓缩液泵入到层析 柱中的上样体积为柱体积的10％～30％。 上述的纯化方法中，优选地，所述核酸酶包括全能核酸酶，优选采用Benzonase核 酸酶和/或Biolonase核酸酶。 本发明的纯化方法中，关键在于确定了应用复合填料Capto Core 700纯化新型冠 4 CN 111575249 A 说 明 书 3/5 页 状病毒灭活疫苗纯化液有重要影响的因素条件：柱高、上样体积占柱体积百分比、洗脱溶液 pH，洗脱流速等。通过控制这些因素条件在本发明的范围内，能成功纯化出以Vero细胞为基 质的新型冠状病毒纯化液，所得病毒纯化液具有较高的抗原回收率，并较好地去除培养液 中的残余细胞宿主蛋白和DNA，符合国家限量标准。 上述的纯化方法中，优选地，所述层析柱包括XK50/60层析柱、XK16/40层析柱或 BPG 140/500层析柱。 另一方面，本发明还提供一种新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒纯化液，其是 采用上述纯化方法纯化获得的。 再一方面，本发明还提供一种新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗，其是采用上述新 型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒纯化液经过适当稀释后配制新型冠状病毒灭活疫苗，配 制后分装，即为Vero细胞新型冠状病毒灭活疫苗制品。 本发明的有益效果： 本发明通过采用超滤浓缩、核酸酶消化和柱层析工艺步骤，结合柱层析首次采用 复合填料Capto Core 700对新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液进行纯化，能够快速、 稳定地大规模生产新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒纯化液。 附图说明 图1显示应用Capto core 700纯化后的新冠病毒纯化液，经过聚丙烯凝胶电泳 (SDS-PAGE)方法进行鉴定的图谱(M：marker；1：病毒浓缩液；2：病毒纯化液)。 图2显示应用Capto core 700纯化后的新冠病毒纯化液，经过Western Blot方法 进行鉴定的图谱(从左到右分别为：一抗：抗S蛋白；一抗：抗N蛋白；一抗：新冠肺炎恢复期患 者血清)。 图3显示应用Capto core 700纯化后的新冠病毒纯化液，经过HPLC方法进行纯度 分析的图谱。 图4显示应用Capto core 700纯化后的新冠病毒纯化液的电镜图片(A为全局图， B、C为局部放大图)。
