技术摘要：
本发明公开了一种血浆外泌体蛋白Mortalin作为HPV阳性宫颈癌诊断标志物及其应用。通过蛋白质组学比较宫颈癌肿瘤组病人、癌前病变病人(CIN)及健康人血浆外泌体的差异蛋白，以及敲除HPV关键分子HPVE6/E7后的mortalin表达情况，发现外泌体mortalin能够作为宫颈癌的分子标志 全部
背景技术：
宫颈癌是危害我国女性的第二大恶性肿瘤，其危险程度仅次于乳腺癌，发病率排 在女性肿瘤的第四位，死亡率为第二位，是女性肿瘤相关疾病死亡的主要原因。宫颈癌严重 降低了女性生活质量，并威胁着女性的生命健康。因此，对宫颈癌发病的早诊早治，并有效 控制宫颈癌发病率、死亡率变成了当务之急。 HPV的感染是宫颈癌发生的主要原因之一，其相关率高达99.7％。HPV感染诱发宫 颈癌的两个必要条件，一是高危型HPV(high risk HPV，hrHPV)感染，二是HPV持续性感染。 HPV分为低中高危型，高危型HPV包含16、18、31、33、39、45、52亚型等，其中HPV16 和HPV18是 最常见的高危型亚型，占宫颈癌发病原因的75％。 现如今宫颈癌的筛查手段分为TCT液基细胞检测以及HPV DNA检测。这两项检测可 分别进行宫颈细胞不典型增生和癌变的检测以及判断是否感染HPV，但这两项检测都需要 专门的妇科学检查来辅助确诊。通常情况下，在这两项检查结果表明高度怀疑宫颈癌后，再 进行阴道镜和组织活检进行病理学诊断来确诊。 TCT检查是利用美国TBS评价系统进行诊断。生成TBS图文报告后，可以将宫颈鳞状 上皮细胞异常分为5类：不能明确意义的不典型鳞状上皮细胞(ASCUS)、鳞状上皮细胞轻度 不典型增生(LSIL)、鳞状上皮细胞重度不典型增生(HSIL)、可疑鳞癌细胞、癌细胞。但其缺 陷在于，TCT检查需要借助妇科检查手段来进行，使用例如阴道窥器等工具提取病人的宫颈 表面细胞样品。该过程往往会使病人产生不适感以及心理上的不良影响。 HPV DNA检测同样也需要使用妇科检查手段辅助取样，通常取宫颈脱落细胞或者 宫颈粘液，利用聚合酶链式反应(PCR)进行HPV分型的检测。同样也会病人产生不适感以及 心理上的不良影响。 而且HPV DNA检查和TCT检查要求检查者三天之内不能进行性生活，同时不适合进 行阴道清洗后的检查者；当检查者月经时期不便于进行HPV和TCT检查；HPV DNA检查和TCT 检查费用高，两项联合更是会对消费者造成经济负担；最主要的是，HPV DNA检查和 TCT检 查只是初步筛查作用，没有预后判断作用。 因此，基于现有技术的缺陷，缺少一种能脱离传统取样方式，提高女性病患的心理 接受程度，同时还兼具高效、准确、特应性强的HPV阳性宫颈癌诊断标志物及其相关应用，其 将具有极大的经济与实用价值。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种血浆外泌体蛋白作为HPV阳性宫颈癌诊断标志物及阐 3 CN 111579785 A 说 明 书 2/10 页 述其应用。 本发明所采取的技术方案是： 本发明的第一个方面，提供： 一种HPV感染致宫颈癌早期诊断标志物，其包括血浆外泌体Mortalin。 HPV感染能够通过招募转录因子CTCF上调宫颈上皮细胞Mortalin蛋白的表达量， 且血浆外泌体Mortalin的表达量与子宫颈上皮内瘤变(CIN)及宫颈癌的进程相关，成正向 关系；宫颈癌组织中的外泌体Mortalin的高表达通过Mortalin-p53-Gadd45A信号通路对癌 旁组织以及宫颈上皮细胞组织有恶性转化作用；可通过对血浆外泌体Mortalin的检测可以 对帮助子宫颈上皮内瘤变(CIN)及宫颈癌的早期诊断，同时为宫颈癌的预后做初步判断。 进一步地，上述宫颈癌为高危型HPV持续感染引发的宫颈癌和/或子宫颈上皮内瘤 变。 进一步地，上述血浆外泌体Mortalin在HPV感染的细胞中表达上调。 进一步地，上述诊断包括以下步骤： 检测受试者样品中Mortalin的表达水平；根据表达水平和对照的差异，预测受试 者是否患有宫颈癌。 其中，检测外泌体Mortalin方法包括Western blot、ELISA、qPCR或其组合。 其中，上述血浆外泌体Mortalin的提取方法包括试剂盒提取法、超高速离心法。 在一些实施例中，上述超高速离心法的步骤如下： (1)用培养基以4:1体积比稀释胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)，160000g离 心16h，去除血清内外泌体；过滤，进行无菌处理；与培养基混合后，配置成10％FBS的无外泌 体培养基； (2)利用无外泌体培养基对宫颈癌细胞进行培养48-72h，收取细胞上清后以2000g 离心去除细胞沉淀，收集上清； (3)取步骤(2)所得上清，10000g离心去除直径大的细胞外囊泡，收集上清； (4)取步骤(3)所得上清，120000g离心以沉淀外泌体，去掉上清后使用磷酸缓冲盐 溶液(Phosphate buffer saline，PBS)重悬沉淀外泌体； (5)再次用120000g离心步骤(4)以洗涤沉淀外泌体，去除上清，即到外泌体。 其中，上述培养基为PRIM1640培养基。 在一些实施例中，上述试剂盒提取法的步骤如下： (1)获取病人血液样本； (2)用PBS润洗分离柱； (3)将500ul外泌体样本(血液样本)上样至分离柱中； (4)每次添加500ul PBS洗脱； (5)按照500ul组份收集外泌体，一般于第7管外泌体含量最高，可收集第7-9管的 液体，即得外泌体Mortalin。 本发明的第二个方面，提供： 定量检测上述的宫颈癌诊断标志物表达量的宫颈癌辅助诊断试剂；其中，上述宫 颈癌诊断标志物为血浆外泌体Mortalin。 HPV感染能够上调宫颈细胞Mortalin的表达量，且血浆外泌体Mortalin的表达量 4 CN 111579785 A 说 明 书 3/10 页 与CIN 及宫颈癌的进程相关，成正向关系；宫颈癌组织中的外泌体Mortalin的高表达对癌 旁组织以及上皮组织有恶性转化作用；可通过对血浆外泌体Mortalin的检测可以对帮助子 宫颈上皮内瘤变(CIN)及宫颈癌的早期诊断，同时为宫颈癌的预后做初步判断。 其中，检测外泌体Mortalin方法包括Weatern blot、ELISA、qPCR或其组合。 进一步地，通过上述宫颈癌辅助诊断试剂检测受试者样品中Mortalin的表达水 平；根据表达水平和对照的差异，预测受试者是否患有宫颈癌。 进一步地，上述宫颈癌为HPV阳性宫颈癌。 更进一步地，上述宫颈癌还包括子宫颈上皮内瘤变(CIN)； 本发明的第三个方面，提供： 一种宫颈癌诊断试剂盒，其包括上述的宫颈癌辅助诊断试剂。 HPV感染能够上调宫颈上皮细胞Mortalin的表达量，且血浆外泌体Mortalin的表 达量与 CIN及宫颈癌的进程相关，成正向关系；宫颈癌组织中的外泌体Mortalin的高表达 对癌旁组织以及上皮组织有恶性转化作用；可通过对血浆外泌体Mortalin的检测可以对帮 助子宫颈上皮内瘤变(CIN)及宫颈癌的早期诊断，同时为宫颈癌的预后做初步判断。 进一步地，通过上述宫颈癌辅助诊断试剂盒检测受试者样品中Mortalin的表达水 平；根据表达水平和对照的差异，预测受试者是否患有宫颈癌。 其中，检测外泌体Mortalin方法包括Weatern blot、ELISA、qPCR或其组合。 本发明的第四个方面，提供： 上述的宫颈癌诊断标志物、宫颈癌诊断试剂或宫颈癌诊断试剂盒在诊断或辅助诊 断HPV 阳性宫颈癌中的应用； 其中，上述应用不包括疾病的诊断。 HPV感染能够上调宫颈细胞Mortalin的表达量，且血浆外泌体Mortalin的表达量 与CIN 及宫颈癌的进程相关，成正向关系；宫颈癌组织中的外泌体Mortalin的高表达对癌 旁组织以及上皮组织有恶性转化作用；可通过对血浆外泌体Mortalin的检测可以对帮助子 宫颈上皮内瘤变(CIN)及宫颈癌的早期诊断，同时为宫颈癌的预后做初步判断。 其中，检测外泌体Mortalin方法包括Weatern blot、ELISA、qPCR或其组合。 本发明的第五个方面，提供： 定量检测外泌体Mortalin表达量的试剂在制备诊断或辅助诊断宫颈疾病试剂盒 中的应用。 其中，上述宫颈疾病为HPV阳性宫颈癌； 上述宫颈疾病还包括子宫颈上皮内瘤变； 上述诊断或辅助诊断包括：通过上述检测外泌体Mortalin的试剂，检测受试者样 品中Mortalin的表达水平；根据表达水平和对照的差异，确定受试者是否患有宫颈癌； 其中，检测外泌体Mortalin方法包括Weatern blot、ELISA、qPCR或其组合。 上述应用不包括疾病的诊断。 本发明的第六个方面，提供： 上述的宫颈癌诊断标志物在制备药物中的应用，该药物用于抑制Mortalin表达 和/或用于下列用途中的至少一种： (1)抑制永生化宫颈上皮细胞H8的恶性转化； 5 CN 111579785 A 说 明 书 4/10 页 (2)抑制宫颈癌肿瘤体积增大； (3)抑制瘤旁组织转化。 本发明的有益效果是： 本发明中的血浆外泌体mortalin作为宫颈癌的分子标志物，通过对检查者血浆外 泌体 Mortalin检测，能够对HPV阳性宫颈癌和CIN进行初步筛查，同时也可以作为其早期诊 断依据。血液样本抽提便捷、快速、成本低，并且在检查者不方便做妇检或者有大量检查者 筛查时，相比传统检测更容易操作，能够作为未来宫颈癌和CIN初步筛查的主要技术手段。 附图说明 图1为癌前病变组(子宫上皮内瘤变，CIN，A组)、癌症组(宫颈癌，B组)及健康对照 组(C组)的Venn图； 图2为SiHa、C-33A及H8细胞的Mortalin、HPV E6、GAPDH的表达情况(2a)和SiHa、 C-33A细胞上清外泌体(Exos)中Mortalin、CD63、CD9的表达情况(2b)； 图3为敲除HPV E6/E7(Ko E6/E7)后，SiHa细胞的Mortalin、HPV E6、HPV E7、GAPDH 的表达情况(3a)和SiHa细胞上清外泌体(Exos)中Mortalin、CD63、CD9的表达情况(3b)； 图4为H8细胞与SiHa(4a)和Caski(4b)细胞不加入和加入外泌体抑制剂GW4869 共 培养后的Mortalin、GAPDH的表达情况以及细胞迁移图(4c)； 图5为激光共聚焦显微镜下的外泌体(呈绿色(PKH67))、细胞膜(呈红色(Dil))，细 胞核(呈蓝色(Hoechst33342))； 图6为与SiHa和Caski外泌体共培养后的H8细胞染色情况(a)和克隆效率(b)； 图7为注射SiHa和KdMorSiHa外泌体的肿瘤大小比较(a)和质量对比(b)； 图8为注射SiHa和KdMorSiHa外泌体的Mortalin、CD63、CD9、GAPDH的表达情况。
本发明公开了一种血浆外泌体蛋白Mortalin作为HPV阳性宫颈癌诊断标志物及其应用。通过蛋白质组学比较宫颈癌肿瘤组病人、癌前病变病人(CIN)及健康人血浆外泌体的差异蛋白，以及敲除HPV关键分子HPVE6/E7后的mortalin表达情况，发现外泌体mortalin能够作为宫颈癌的分子标志 全部
背景技术：
宫颈癌是危害我国女性的第二大恶性肿瘤，其危险程度仅次于乳腺癌，发病率排 在女性肿瘤的第四位，死亡率为第二位，是女性肿瘤相关疾病死亡的主要原因。宫颈癌严重 降低了女性生活质量，并威胁着女性的生命健康。因此，对宫颈癌发病的早诊早治，并有效 控制宫颈癌发病率、死亡率变成了当务之急。 HPV的感染是宫颈癌发生的主要原因之一，其相关率高达99.7％。HPV感染诱发宫 颈癌的两个必要条件，一是高危型HPV(high risk HPV，hrHPV)感染，二是HPV持续性感染。 HPV分为低中高危型，高危型HPV包含16、18、31、33、39、45、52亚型等，其中HPV16 和HPV18是 最常见的高危型亚型，占宫颈癌发病原因的75％。 现如今宫颈癌的筛查手段分为TCT液基细胞检测以及HPV DNA检测。这两项检测可 分别进行宫颈细胞不典型增生和癌变的检测以及判断是否感染HPV，但这两项检测都需要 专门的妇科学检查来辅助确诊。通常情况下，在这两项检查结果表明高度怀疑宫颈癌后，再 进行阴道镜和组织活检进行病理学诊断来确诊。 TCT检查是利用美国TBS评价系统进行诊断。生成TBS图文报告后，可以将宫颈鳞状 上皮细胞异常分为5类：不能明确意义的不典型鳞状上皮细胞(ASCUS)、鳞状上皮细胞轻度 不典型增生(LSIL)、鳞状上皮细胞重度不典型增生(HSIL)、可疑鳞癌细胞、癌细胞。但其缺 陷在于，TCT检查需要借助妇科检查手段来进行，使用例如阴道窥器等工具提取病人的宫颈 表面细胞样品。该过程往往会使病人产生不适感以及心理上的不良影响。 HPV DNA检测同样也需要使用妇科检查手段辅助取样，通常取宫颈脱落细胞或者 宫颈粘液，利用聚合酶链式反应(PCR)进行HPV分型的检测。同样也会病人产生不适感以及 心理上的不良影响。 而且HPV DNA检查和TCT检查要求检查者三天之内不能进行性生活，同时不适合进 行阴道清洗后的检查者；当检查者月经时期不便于进行HPV和TCT检查；HPV DNA检查和TCT 检查费用高，两项联合更是会对消费者造成经济负担；最主要的是，HPV DNA检查和 TCT检 查只是初步筛查作用，没有预后判断作用。 因此，基于现有技术的缺陷，缺少一种能脱离传统取样方式，提高女性病患的心理 接受程度，同时还兼具高效、准确、特应性强的HPV阳性宫颈癌诊断标志物及其相关应用，其 将具有极大的经济与实用价值。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种血浆外泌体蛋白作为HPV阳性宫颈癌诊断标志物及阐 3 CN 111579785 A 说 明 书 2/10 页 述其应用。 本发明所采取的技术方案是： 本发明的第一个方面，提供： 一种HPV感染致宫颈癌早期诊断标志物，其包括血浆外泌体Mortalin。 HPV感染能够通过招募转录因子CTCF上调宫颈上皮细胞Mortalin蛋白的表达量， 且血浆外泌体Mortalin的表达量与子宫颈上皮内瘤变(CIN)及宫颈癌的进程相关，成正向 关系；宫颈癌组织中的外泌体Mortalin的高表达通过Mortalin-p53-Gadd45A信号通路对癌 旁组织以及宫颈上皮细胞组织有恶性转化作用；可通过对血浆外泌体Mortalin的检测可以 对帮助子宫颈上皮内瘤变(CIN)及宫颈癌的早期诊断，同时为宫颈癌的预后做初步判断。 进一步地，上述宫颈癌为高危型HPV持续感染引发的宫颈癌和/或子宫颈上皮内瘤 变。 进一步地，上述血浆外泌体Mortalin在HPV感染的细胞中表达上调。 进一步地，上述诊断包括以下步骤： 检测受试者样品中Mortalin的表达水平；根据表达水平和对照的差异，预测受试 者是否患有宫颈癌。 其中，检测外泌体Mortalin方法包括Western blot、ELISA、qPCR或其组合。 其中，上述血浆外泌体Mortalin的提取方法包括试剂盒提取法、超高速离心法。 在一些实施例中，上述超高速离心法的步骤如下： (1)用培养基以4:1体积比稀释胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)，160000g离 心16h，去除血清内外泌体；过滤，进行无菌处理；与培养基混合后，配置成10％FBS的无外泌 体培养基； (2)利用无外泌体培养基对宫颈癌细胞进行培养48-72h，收取细胞上清后以2000g 离心去除细胞沉淀，收集上清； (3)取步骤(2)所得上清，10000g离心去除直径大的细胞外囊泡，收集上清； (4)取步骤(3)所得上清，120000g离心以沉淀外泌体，去掉上清后使用磷酸缓冲盐 溶液(Phosphate buffer saline，PBS)重悬沉淀外泌体； (5)再次用120000g离心步骤(4)以洗涤沉淀外泌体，去除上清，即到外泌体。 其中，上述培养基为PRIM1640培养基。 在一些实施例中，上述试剂盒提取法的步骤如下： (1)获取病人血液样本； (2)用PBS润洗分离柱； (3)将500ul外泌体样本(血液样本)上样至分离柱中； (4)每次添加500ul PBS洗脱； (5)按照500ul组份收集外泌体，一般于第7管外泌体含量最高，可收集第7-9管的 液体，即得外泌体Mortalin。 本发明的第二个方面，提供： 定量检测上述的宫颈癌诊断标志物表达量的宫颈癌辅助诊断试剂；其中，上述宫 颈癌诊断标志物为血浆外泌体Mortalin。 HPV感染能够上调宫颈细胞Mortalin的表达量，且血浆外泌体Mortalin的表达量 4 CN 111579785 A 说 明 书 3/10 页 与CIN 及宫颈癌的进程相关，成正向关系；宫颈癌组织中的外泌体Mortalin的高表达对癌 旁组织以及上皮组织有恶性转化作用；可通过对血浆外泌体Mortalin的检测可以对帮助子 宫颈上皮内瘤变(CIN)及宫颈癌的早期诊断，同时为宫颈癌的预后做初步判断。 其中，检测外泌体Mortalin方法包括Weatern blot、ELISA、qPCR或其组合。 进一步地，通过上述宫颈癌辅助诊断试剂检测受试者样品中Mortalin的表达水 平；根据表达水平和对照的差异，预测受试者是否患有宫颈癌。 进一步地，上述宫颈癌为HPV阳性宫颈癌。 更进一步地，上述宫颈癌还包括子宫颈上皮内瘤变(CIN)； 本发明的第三个方面，提供： 一种宫颈癌诊断试剂盒，其包括上述的宫颈癌辅助诊断试剂。 HPV感染能够上调宫颈上皮细胞Mortalin的表达量，且血浆外泌体Mortalin的表 达量与 CIN及宫颈癌的进程相关，成正向关系；宫颈癌组织中的外泌体Mortalin的高表达 对癌旁组织以及上皮组织有恶性转化作用；可通过对血浆外泌体Mortalin的检测可以对帮 助子宫颈上皮内瘤变(CIN)及宫颈癌的早期诊断，同时为宫颈癌的预后做初步判断。 进一步地，通过上述宫颈癌辅助诊断试剂盒检测受试者样品中Mortalin的表达水 平；根据表达水平和对照的差异，预测受试者是否患有宫颈癌。 其中，检测外泌体Mortalin方法包括Weatern blot、ELISA、qPCR或其组合。 本发明的第四个方面，提供： 上述的宫颈癌诊断标志物、宫颈癌诊断试剂或宫颈癌诊断试剂盒在诊断或辅助诊 断HPV 阳性宫颈癌中的应用； 其中，上述应用不包括疾病的诊断。 HPV感染能够上调宫颈细胞Mortalin的表达量，且血浆外泌体Mortalin的表达量 与CIN 及宫颈癌的进程相关，成正向关系；宫颈癌组织中的外泌体Mortalin的高表达对癌 旁组织以及上皮组织有恶性转化作用；可通过对血浆外泌体Mortalin的检测可以对帮助子 宫颈上皮内瘤变(CIN)及宫颈癌的早期诊断，同时为宫颈癌的预后做初步判断。 其中，检测外泌体Mortalin方法包括Weatern blot、ELISA、qPCR或其组合。 本发明的第五个方面，提供： 定量检测外泌体Mortalin表达量的试剂在制备诊断或辅助诊断宫颈疾病试剂盒 中的应用。 其中，上述宫颈疾病为HPV阳性宫颈癌； 上述宫颈疾病还包括子宫颈上皮内瘤变； 上述诊断或辅助诊断包括：通过上述检测外泌体Mortalin的试剂，检测受试者样 品中Mortalin的表达水平；根据表达水平和对照的差异，确定受试者是否患有宫颈癌； 其中，检测外泌体Mortalin方法包括Weatern blot、ELISA、qPCR或其组合。 上述应用不包括疾病的诊断。 本发明的第六个方面，提供： 上述的宫颈癌诊断标志物在制备药物中的应用，该药物用于抑制Mortalin表达 和/或用于下列用途中的至少一种： (1)抑制永生化宫颈上皮细胞H8的恶性转化； 5 CN 111579785 A 说 明 书 4/10 页 (2)抑制宫颈癌肿瘤体积增大； (3)抑制瘤旁组织转化。 本发明的有益效果是： 本发明中的血浆外泌体mortalin作为宫颈癌的分子标志物，通过对检查者血浆外 泌体 Mortalin检测，能够对HPV阳性宫颈癌和CIN进行初步筛查，同时也可以作为其早期诊 断依据。血液样本抽提便捷、快速、成本低，并且在检查者不方便做妇检或者有大量检查者 筛查时，相比传统检测更容易操作，能够作为未来宫颈癌和CIN初步筛查的主要技术手段。 附图说明 图1为癌前病变组(子宫上皮内瘤变，CIN，A组)、癌症组(宫颈癌，B组)及健康对照 组(C组)的Venn图； 图2为SiHa、C-33A及H8细胞的Mortalin、HPV E6、GAPDH的表达情况(2a)和SiHa、 C-33A细胞上清外泌体(Exos)中Mortalin、CD63、CD9的表达情况(2b)； 图3为敲除HPV E6/E7(Ko E6/E7)后，SiHa细胞的Mortalin、HPV E6、HPV E7、GAPDH 的表达情况(3a)和SiHa细胞上清外泌体(Exos)中Mortalin、CD63、CD9的表达情况(3b)； 图4为H8细胞与SiHa(4a)和Caski(4b)细胞不加入和加入外泌体抑制剂GW4869 共 培养后的Mortalin、GAPDH的表达情况以及细胞迁移图(4c)； 图5为激光共聚焦显微镜下的外泌体(呈绿色(PKH67))、细胞膜(呈红色(Dil))，细 胞核(呈蓝色(Hoechst33342))； 图6为与SiHa和Caski外泌体共培养后的H8细胞染色情况(a)和克隆效率(b)； 图7为注射SiHa和KdMorSiHa外泌体的肿瘤大小比较(a)和质量对比(b)； 图8为注射SiHa和KdMorSiHa外泌体的Mortalin、CD63、CD9、GAPDH的表达情况。
