技术摘要：
本发明公开了一种基于脂质组学表征早期阿尔茨海默病不同阶段鼠血浆和脑脂类生物标志物方法，该脂质组学分析方法包括如下步骤：将早期阿尔茨海默病鼠血浆和脑组织匀浆液经特定溶剂提取、超声、离心、真空干燥、乙腈‑水溶液复溶，进样，经UPLC色谱柱(C18)分离，利用由乙  全部
背景技术：
阿尔茨海默病(Alzheimer’s  disease，AD)是一种脑神经退行性慢性致死性疾病。 据2018年阿尔茨海默国际组织报道，全球老年痴呆患者约有5000万人，到2050年将达到 1.52亿人。我国AD患者人数已超千万人，居世界之首。 AD病理机制仍不清楚，主要假说有β-淀粉样蛋白异常沉积，Tau蛋白纠缠，炎症级 联反应，病毒、细菌和真菌侵入脑部导致炎症和神经毒性。AD后期无法治愈，也很难阻止，因 此早期AD生物标志物的挖掘，为AD早期诊断和干预提供可能。 临床上AD生物标志物主要是蛋白质类，小分子的生物标志物不多，且目前对AD早 期的生物标志物认识不足，特别是AD早期阶段脂类生物标志物的研究缺少关注，也没有用 于临床的早期的AD诊断生物标志物。脂质组学是一种新兴的组学技术，在生物学研究中发 挥着越来越重要的作用，因为它能够揭示机体细胞代谢的独特脂类化学指纹特征。脂质组 学作为一种脂类小分子代谢物研究方法，为发掘更多的AD生物标志物提供了可能。越来越 多的证据表明AD发生和发展过程导致脂质的异常。
技术实现要素：
本发明的目的在于基于超高效液相串联高分辨质谱的早期阿尔茨海默病鼠脂质 组学分析方法,该方法不需要标准品可对早期阿尔茨海默病鼠脂类潜在生物标志物实现灵 敏、准确、高通量分析。 为实现上述目的，本发明提供了一种基于超高效液相串联高分辨质谱的早期阿尔 茨海默病鼠脂质组学分析方法，包括以下步骤：步骤1，对收集到的鼠血浆/血清和脑组织用 丁醇-甲醇、正庚烷-乙酸乙酯和水进行提取，得到上层有机溶液；步骤2，将所述的上层有机 溶液，真空干燥有机溶剂，浓缩样品，进而用乙腈-水溶液去复溶浓缩后的样品，高速离心后 得到待测上清进样；步骤3，将所述待测样品通过UPLC色谱柱中的流动相洗脱进行分离后， 然后分别在正、负离子模式下使用四极杆飞行时间高分辨质谱仪进行检测，根据目标磷脂 类分子的化学式、精确分子量、二级碎片、丰度比，将检测数据与之比对，鉴定得到阿尔茨海 默病早期不同阶段鼠血浆和脑多种磷脂分子。步骤4，运用脂质组学相关数据库和分析软 件，构建生物标志物的代谢通路并进行分析。 在一优先的实施中，步骤1中，对2、3和7月龄APP/PS1小鼠和对应的健康鼠收集到 的鼠血浆/血清和脑组织(10只/组)用丁醇-甲醇、正庚烷-乙酸乙酯和水进行提取，得到上 层有机溶液。 在一优先的实施中，步骤1中，所述的丁醇-甲醇和正庚烷-乙酸乙酯提取液中的丁 4 CN 111721859 A 说　明　书 2/5 页 醇：甲醇：正庚烷：乙酸乙酯：乙酸铵水溶液体积比为(0.1-0.3):(0.05-0.2):(0.15-0.3): (0.05-0.2):(0.2-0.5)。其中，乙酸铵水的浓度为40-60mM。所述的超声功率为200W，60Hz, 超声10min；涡流60秒，频率200Hz。 在一优先的实施中，步骤2中，在步骤2中，所述离心机转速为12000-15000rpm。 在一优先的实施中，步骤2中，所述复溶浓缩后的样品的乙腈-水溶液中乙腈：水体 积比为(3-4):(2-3)，使用体积为45-55μL。 在一优先的实施中，步骤3中，所述UPLC色谱柱为C18色谱柱，该C18色谱柱的内径 为2.1mm，长度为100mm，其内的固定相颗粒粒径为1.7μm。其中，所述UPLC色谱柱为ACQUITY  UPLC  CSH  C18色谱柱。 在一优先的实施中，步骤3中，所述待测样品通过色谱柱中的流动相洗脱的方式是 利用流动相A和流动相B进行洗脱；其中，所述流动相A包括乙腈和乙酸铵，所述乙腈为 100％，乙酸铵的浓度为4.0-6.0mM；所述流动相B包括异丙醇、乙腈以及乙酸铵，其中异丙 醇：乙腈的体积比为(8-15)：(85-92)，所述乙酸铵的浓度为4.0-6.0mM。 在一优先的实施中，色谱柱的使用条件为：将所述待测样品的进样体积设置为5μ l，柱温55℃，流速0.4mL/min；梯度洗脱程序具体如下：0-2min，40％-43％流动相B；2- 4.1min，43％-45％流动相B；4.1-12min，45％-48％流动相B；12-12.1min，48％-60％流动相 B；12.1-18min,60％-100％流动相B；18-18.1min,80％-40％流动相B；18.1-20min,40％流 动相B。 在一优先的实施中，使用四极杆飞行时间高分辨质谱仪进行测定的质谱条件为： 电喷雾离子源先后采用正负离子化模式采集数据，负离子模式下：毛细管电压为-3.5kV，去 簇电压-2 .0kV，离子源温度为250℃，喷雾压力为2.0bar，干燥气流速6L/min，碰撞能量 70eV；正离子模式下：毛细管电压为4.5kV，去簇电压2.0kV，离子源温度为250℃，喷雾压力 为2.0bar，干燥气流速7L/min，碰撞能量70eV。 本发明还提供了上述基于超高效液相串联高分辨质谱的早期阿尔茨海默病鼠脂 质组学分析方法在高通量检测鼠不同脂类分子中的应用。 与现有技术相比，本发明有如下优势： (1)本发明首次将高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱检测方法应用于早期阿 尔茨海默病鼠脂类分子的鉴定，可完成对鼠快速、灵敏、准确的脂质组学分析； (2)本方法不需要标准化合物，样品测定及分析效率高，重复性好，适用于大批样 品的高通量分析，可对早期阶段阿尔茨海默病鼠脂质组进行区分。 附图说明 构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实 施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中： 图1显示AD鼠血浆和脑在质谱仪正、负离子模式下的总离子流图。 图2展示2、3和7月龄AD组和相应的健康组鼠血浆脂质提取物分别在质谱仪负(A) 和正(B)离子模式下检测获得的数据进行主成分分析(PCA)的轮廓图。 图3展示2、3和7月龄AD组和相应的健康组鼠脑组织脂质提取物分别在质谱仪负 (A)和正(B)离子模式下检测获得的数据进行主成分分析轮廓图。 5 CN 111721859 A 说　明　书 3/5 页 图4显示2、3和7月龄AD鼠血浆中潜在脂类生物标志物的波动变化。 图5显示2、3和7月龄AD鼠脑中潜在脂类生物标志物的波动变化。