技术摘要：
本发明提供一种高效率地跳读外显子的药剂。本发明还提供一种2个以上单元低聚物连接而成的反义低聚物，所述单元低聚物以同一外显子内相互不连续或不重复的序列作为目标。
背景技术：
假肥大(Duchenne)型肌肉萎缩症(DMD)是约3,500人新生男孩中1人发病的频率最 高的遗传性进行性肌病。虽然在婴幼儿期显示出与正常人基本上没有差别的运动能力，但 从4～5岁时起可观察到肌力降低。然后肌力降低发展至12岁时变得无法行走，在20多岁时 因心力衰竭或呼吸衰竭导致死亡，是严重疾病。目前，没有针对DMD的有效治疗方法，迫切需 要开发新型治疗药。 已知DMD的原因是抗肌萎缩蛋白基因的变异。抗肌萎缩蛋白基因是存在于X染色体 的、由220万碱基的DNA形成的巨大基因。由DNA转录至mRNA前体，再通过剪接去除内含子，79 个外显子接合而成的mRNA为13,993个碱基。由该mRNA翻译成3,685个氨基酸，生成抗肌萎缩 蛋白。抗肌萎缩蛋白与肌细胞的膜稳定性的保持有关，为了使肌细胞不容易破坏，抗肌萎缩 蛋白是必需的。DMD患者的抗肌萎缩蛋白基因存在变异，因此在肌细胞中基本上无法表达保 持功能的抗肌萎缩蛋白。因此，在DMD患者体内，无法保持肌细胞的结构，大量的钙离子流入 肌细胞内。其结果是发生类似炎症的反应，发生纤维化，从而使肌细胞变得难以再生。 BECKER型肌肉萎缩症(BMD)的原因也是抗肌萎缩蛋白基因的变异，其症状虽然表 现出肌力降低，但通常比DMD轻，肌力降低的发展慢，在多数情况下在成年期发病。可以认为 DMD与BMD的临床症状的不同在于，由于变异，在抗肌萎缩蛋白的mRNA翻译为抗肌萎缩蛋白 时，氨基酸可读框被破坏或保持(非专利文献1)。即，对于DMD而言，由于存在氨基酸可读框 错位的变异，因此基本上不表达保持功能的抗肌萎缩蛋白，但对于BMD而言，由于变异而使 外显子的一部分缺失，但保持了氨基酸可读框，因此可以产生虽然不完全但是有功能的抗 肌萎缩蛋白。 期待着外显子跳读法作为DMD的治疗方法。该方法是通过改变剪接而修复抗肌萎 缩蛋白的mRNA的氨基酸可读框，从而诱导表达部分恢复了功能的抗肌萎缩蛋白的方法(非 专利文献2)。成为外显子跳读的对象的氨基酸序列部分被丢失。因此，在该治疗中表达的抗 肌萎缩蛋白比正常的抗肌萎缩蛋白短，但由于保持了氨基酸可读框，因此部分保持了使肌 细胞稳定的功能。由此期待通过外显子跳读能使DMD表现出与更轻症状的BMD相同的症状。 外显子跳读法经过利用小鼠、狗进行的动物实验，已经在进行对人DMD患者的临床试验。 可以通过以5’或3’剪接点中任一者或两者、或者外显子的内部为目标的反义核酸 的结合来诱导外显子跳读。外显子仅在两个剪接点通过剪接体复合体进行识别的情况下包 5 CN 111575282 A 说　明　书 2/43 页 含在mRNA中。因此，通过利用反义核酸以剪接点为靶向可以诱导外显子跳读。另外可以认 为，由于外显子被剪接机构所识别，因此需要将丝氨酸和精氨酸丰富的SR蛋白质结合于外 显子剪接增强子(ESE)，以ESE为靶向也能够诱导外显子跳读。 抗肌萎缩蛋白基因的变异根据DMD患者而有所不同，因此需要与基因变异的部位、 种类相对应的反义核酸。对于抗肌萎缩蛋白基因的单一外显子，以一个连续的序列作为目 标来诱导外显子跳读的反义核酸已有多个报告(专利文献1～6及非专利文献1和2)。另外， 将以抗肌萎缩蛋白基因的同一外显子作为目标的两种反义核酸进行混合而使其发挥作用 (二重靶向)时，跳读活性比各反义核酸单独使用的情况有所增强，对于这种情况也已有报 告(专利文献7)。 但是，以同一外显子内的2个以上部位为目标的连接的单链反义核酸(连接型)显 示出跳读活性的情况尚未报告(专利文献1)。 现有技术文献 专利文献 专利文献1：国际公开公报第2004/048570号 专利文献2：国际公开公报第2009/139630号 专利文献3：国际公开公报第2010/048586号 专利文献4：美国专利公开公报第2010/0168212号 专利文献5：国际公开公报第2011/057350号 专利文献6：国际公开公报第2006/000057号 专利文献7：国际公开公报第2007/135105号 非专利文献 非专利文献1：Annemieke  Aartsma-Rus  et  al .,(2002)Neuromuscular  Disorders  12：S71-S77 非专利文献2：Wilton  S.D.,et  al.,Molecular  Therapy  2007：15：p.1288-96
技术实现要素：
发明要解决的课题 鉴于上述情况，本发明的主要目的在于提供一种以抗肌萎缩蛋白基因的同一外显 子内2个不同部位的碱基序列为目标来诱导外显子跳读的新型连接型反义低聚物及包含该 低聚物的肌肉萎缩症治疗药。 解决课题的方法 本发明人等对上述文献中记载的技术内容和抗肌萎缩蛋白基因的结构等进行了 深入研究，结果发现将以人抗肌萎缩蛋白基因的外显子44中不同的2个部位作为目标的低 聚物进行连接而得到的反义低聚物能够诱导该外显子的跳读。本发明人等基于该见解而完 成了本发明。 即，本发明如下所述。 [1] 一种反义低聚物或者其医药上能够允许的盐或水合物，其诱导目标外显子的跳 读，是由下述(a)和(b)连接而成的15～30碱基长度的反义低聚物： 6 CN 111575282 A 说　明　书 3/43 页 (a)第1单元低聚物，其包含与目标外显子内连续的7～15碱基的第1核苷酸序列互 补的碱基序列， (b)第2单元低聚物，其包含与所述目标外显子内连续的7～15碱基的第2核苷酸序 列互补的碱基序列， 其中， 所述第1核苷酸序列和第2核苷酸序列不连续或不相互重复。 [2] 根据上述[1]所述的反义低聚物或者其医药上能够允许的盐或水合物，其中，所述 第1和/或第2单元低聚物包含与跟所述目标外显子邻接的内含子的部分核苷酸序列互补的 碱基序列。 [3] 根据上述[1]或[2]所述的反义低聚物或者其医药上能够允许的盐或水合物，其 中，所述目标外显子为人抗肌萎缩蛋白基因的外显子。 [4] 根据上述[1]或[2]所述的反义低聚物或者其医药上能够允许的盐或水合物，其 中，所述第1核苷酸序列为选自序列号1所示的核苷酸序列的连续7～15碱基的核苷酸序列。 [5] 根据上述[1]～[3]中任一项所述的反义低聚物或者其医药上能够允许的盐或水 合物，其中，所述第2核苷酸序列为选自序列号2所示的核苷酸序列的连续7～15碱基的核苷 酸序列。 [6] 根据上述[1]或[2]所述的反义低聚物或者其医药上能够允许的盐或水合物，其 中，所述反义低聚物由选自以下(c)～(e)中的2个单元低聚物连接而成： (c)由与选自序列号3所示的核苷酸序列的连续7～15碱基的核苷酸序列互补的碱 基序列构成的单元低聚物， (d)由与选自序列号4所示的核苷酸序列的连续7～15碱基的核苷酸序列互补的碱 基序列构成的单元低聚物，以及 (e)由与选自序列号5所示的核苷酸序列的连续7～15碱基的核苷酸序列互补的碱 基序列构成的单元低聚物，或者其医药上能够允许的盐或水合物。 [7] 根据上述[1]或[2]所述的反义低聚物或者其医药上能够允许的盐或水合物，其由 选自序列号6～9中的任一个碱基序列构成。 [8] 根据上述[1]～[7]中任一项所述的反义低聚物或者其医药上能够允许的盐或水 合物，其是寡核苷酸。 [9] 根据上述[8]所述的反义低聚物或者其医药上能够允许的盐或水合物，其中，构成 所述寡核苷酸的至少1个核苷酸的糖部分和/或磷酸键部分经过修饰。 [10] 7 CN 111575282 A 说　明　书 4/43 页 根据上述[8]或[9]所述的反义低聚物或者其医药上能够允许的盐或水合物，其 中，构成所述寡核苷酸的至少1个核苷酸的糖部分是2’位的-OH基被选自OR、R、R’OR、SH、SR、 NH2、NHR、NR2、N3、CN、F、Cl、Br及I中的任一基团取代而得到的核糖。 (所述R表示烷基或芳基，所述R’表示亚烷基。) [11] 根据上述[8]～[10]中任一项所述的反义低聚物或者其医药上能够允许的盐或水 合物，其中，构成所述寡核苷酸的至少1个核苷酸的磷酸键部分为选自硫代磷酸酯键、二硫 代磷酸酯键、膦酸烷基酯键、氨基磷酸酯键及硼磷酸酯键中的1种。 [12] 根据上述[1]～[7]中任一项所述的反义低聚物或者其医药上能够允许的盐或水 合物，其是吗啉基低聚物。 [13] 根据上述[12]所述的反义低聚物或者其医药上能够允许的盐或水合物，其是二氨 基磷酸酯吗啉基低聚物。 [14] 根据上述[12]或[13]所述的反义低聚物或者其医药上能够允许的盐或水合物，其 中，5’末端为下述化学式(1)～(3)中任一基团。 [化学式1] [15] 一种肌肉萎缩症治疗用医药组合物，其以所述[1]～[14]中任一项所述的反义低 聚物或者其医药上能够允许的盐或水合物作为有效成分。 [16] 根据上述[15]所述的医药组合物，其还包含医药上能够允许的载体。 [17] 一种肌肉萎缩症的治疗方法，该方法包括下述工序： 对肌肉萎缩症患者给药所述[1]～[12]中任一项所述的反义低聚物或者其医药上 能够允许的盐或水合物、或者所述[1]或[16]所述的所述医药组合物。 [18] 根据上述[17]所述的治疗方法，其中，所述肌肉萎缩症患者是在抗肌萎缩蛋白基 因中具有成为外显子44跳读对象的变异的患者。 [19] 8 CN 111575282 A 说　明　书 5/43 页 根据上述[17]或[18]所述的治疗方法，其中，所述患者是人。 [20] 上述[1]～[14]中任一项所述的反义低聚物或者其医药上能够允许的盐或水合物 在制造肌肉萎缩症治疗用医药组合物中的用途。 [21] 根据上述[1]～[14]中任一项所述的反义低聚物或者其医药上能够允许的盐或水 合物，其用于肌肉萎缩症治疗。 [22] 根据上述[21]所述的反义低聚物或者其医药上能够允许的盐或水合物，其中，在 所述治疗中，肌肉萎缩症患者是在抗肌萎缩蛋白基因中具有成为外显子44跳读对象的变异 的患者。 [23] 根据上述[21]或[22]所述的反义低聚物或者其医药上能够允许的盐或水合物，其 中，所述患者是人。 [24] 一种反义低聚物的制造方法，所述反义低聚物是上述[1]所述的反义低聚物，该方 法包括：通过将下述(a)和(b)连接来制造15～30碱基长度的反义低聚物的工序， (a)第1单元低聚物，其包含与目标外显子内连续的7～15碱基的第1核苷酸序列互 补的碱基序列， (b)第2单元低聚物，其包含与所述目标外显子内连续的7～15碱基的第2核苷酸序 列互补的碱基序列， 其中，所述第1核苷酸序列和第2核苷酸序列不连续或不相互重复。 [25] 根据上述[24]所述的方法，该方法还包括： 对所述工序中得到的反义低聚物的跳读效率进行测定的工序、以及 对具有超过基准值的跳读效率的反义低聚物进行选择的工序。 [26] 一种反义低聚物的筛选方法，该方法包括： (a)对下述(i)和(ii)进行选择的工序； (i)第1单元低聚物，其包含与目标外显子内连续的7～15碱基的第1核苷酸序列互 补的碱基序列， (ii)第2单元低聚物，其包含与所述目标外显子内连续的7～15碱基的第2核苷酸 序列互补的碱基序列， 其中，第1核苷酸序列和第2核苷酸序列不连续或不相互重复， (b)通过连接所述第1和第2单元低聚物来制作15～30碱基长度的反义低聚物的工 序； (c)对所述工序(b)中得到的反义低聚物的跳读效率进行测定的工序；以及 (d)对具有超过基准值的跳读效率的反义低聚物进行选择的工序。 发明的效果 9 CN 111575282 A 说　明　书 6/43 页 利用本发明的反义低聚物能够高效率地诱导人抗肌萎缩蛋白基因的外显子44的 跳读。另外，通过给药本发明的医药组合物，能够有效地减轻假肥大型肌肉萎缩症的症状。 附图说明 图1是示出人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)中人抗肌萎缩蛋白基因的外显子44的跳读 效率的图。 图2是示出人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)中人抗肌萎缩蛋白基因的外显子44的跳读 效率(按照低聚物浓度)的图。 图3是示出人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)中人抗肌萎缩蛋白基因的外显子44的跳读 效率(按照低聚物浓度)的图。 图4是示出人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)中人抗肌萎缩蛋白基因的外显子44的跳读 效率(按照低聚物浓度)的图。 图5是示出人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)中人抗肌萎缩蛋白基因的外显子44的跳读 效率(按照低聚物浓度)的图。 图6是示出人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)中人抗肌萎缩蛋白基因的外显子44的跳读 效率(按照低聚物浓度)的图。 图7是示出人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)中人抗肌萎缩蛋白基因的外显子44的跳读 效率(按照低聚物浓度)的图。 图8是示出人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)中人抗肌萎缩蛋白基因的外显子44的跳读 效率(按照低聚物浓度)的图。 图9是示出人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)中人抗肌萎缩蛋白基因的外显子44的跳读 效率(按照低聚物浓度)的图。 图10是示出人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)中人抗肌萎缩蛋白基因的外显子44的跳 读效率(按照低聚物浓度)的图。 图11是示出人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)中人抗肌萎缩蛋白基因的外显子44的跳 读效率(按照低聚物浓度)的图。 图12是示出人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)中人抗肌萎缩蛋白基因的外显子44的跳 读效率(按照低聚物浓度)的图。 图13是示出人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)中人抗肌萎缩蛋白基因的外显子44的跳 读效率(按照低聚物浓度)的图。 图14是示出人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)中人抗肌萎缩蛋白基因的外显子44的跳 读效率(按照低聚物浓度)的图。 图15是示出人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)中人抗肌萎缩蛋白基因的外显子44的跳 读效率(按照低聚物浓度)的图。 图16是示出人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)中人抗肌萎缩蛋白基因的外显子44的跳 读效率(按照低聚物浓度)的图。 图17是示出人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)中人抗肌萎缩蛋白基因的外显子44的跳 读效率(按照低聚物浓度)的图。 图18是示出人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)中人抗肌萎缩蛋白基因的外显子44的跳 10 CN 111575282 A 说　明　书 7/43 页 读效率(按照低聚物浓度)的图。 图19是示出人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)中人抗肌萎缩蛋白基因的外显子44的跳 读效率(按照低聚物浓度)的图。 图20是示出人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)中人抗肌萎缩蛋白基因的外显子44的跳 读效率(按照低聚物浓度)的图。 图21是示出人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)中人抗肌萎缩蛋白基因的外显子44的跳 读效率(按照低聚物浓度)的图。 图22是示出人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)中人抗肌萎缩蛋白基因的外显子44的跳 读效率(按照低聚物浓度)的图。 图23是示出人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)中人抗肌萎缩蛋白基因的外显子44的跳 读效率(按照低聚物浓度)的图。 图24是示出人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)中人抗肌萎缩蛋白基因的外显子44的跳 读效率(按照低聚物浓度)的图。 图25是示出人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)中人抗肌萎缩蛋白基因的外显子44的跳 读效率(按照低聚物浓度)的图。 图26是示出人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)中人抗肌萎缩蛋白基因的外显子44的跳 读效率(按照低聚物浓度)的图。 图27是对以不同部位作为目标的2种单元低聚物连接而成的低聚物与混合后的低 聚物比较人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)中人抗肌萎缩蛋白基因的外显子44的跳读效率的图。 图28是对以不同部位作为目标的2种单元低聚物连接而成的低聚物与混合后的低 聚物比较人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)中人抗肌萎缩蛋白基因的外显子44的跳读效率的图。 图29是对以不同部位作为目标的2种单元低聚物连接而成的低聚物与混合后的低 聚物比较人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)中人抗肌萎缩蛋白基因的外显子44的跳读效率的图。 图30是对以不同部位作为目标的2种单元低聚物连接而成的低聚物、其混合后的 低聚物及其各自单独的低聚物比较人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)中人抗肌萎缩蛋白基因的 外显子44的跳读效率的图。 图31是对以不同部位作为目标的2种单元低聚物连接而成的低聚物、其混合后的 低聚物及其各自单独的低聚物比较人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)中人抗肌萎缩蛋白基因的 外显子44的跳读效率的图。 图32是示出源自外显子45缺失的人DMD患者的成纤维细胞中人抗肌萎缩蛋白基因 的外显子44的跳读效率的图。