技术摘要：
本发明提供了用于大肠杆菌和志贺菌甄别的试剂盒，涉及基于质谱的病原体甄别检测技术领域。本发明将生化方法和质谱技术相结合，根据大肠杆菌、志贺菌各自的生化特性，确定两个特征蛋白的质荷比m/z分别为103.12±0.1、89.10±0.1，结合生化试剂盒反应液，通过MALDI‑TOF MS 全部
背景技术：
致病性大肠杆菌共包括5类，分别为肠出血性大肠杆菌（EHEC）、致病性大肠杆菌 （EPEC）、肠产毒性大肠杆菌（ETEC）、肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）和凝聚性大肠杆菌（EAEC）。志 贺菌根据生化反应和O抗原不同，分为4个血清群，即痢疾志贺菌（A群）、福氏志贺菌（B群）、 鲍氏志贺菌（C群）、宋内志贺菌（D群）。大肠杆菌与志贺菌有密切的亲缘关系，在遗传学上非 常接近、遗传信息相似，因此，区分大肠杆菌与志贺菌以及志贺菌的四个种群非常困难，但 意义重大。从传染病防治法的角度，大肠杆菌引起的腹泻属于丙类中的其他感染性腹泻病， 而志贺菌引起的细菌性痢疾属于乙类传染病，报告和处理要求均不相同。因此大肠杆菌与 志贺菌的甄别鉴定十分重要，快速、准确的区分甄别意义重大。宋内志贺菌和福氏志贺菌是 我国分离株的主要菌群，我国6年内的志贺菌分离株中，宋内志贺菌与福氏志贺菌的分离率 为92.3%，这两个种群的快速区分，对我国志贺菌病的诊断与防治具有重要意义。 大肠杆菌与志贺菌区分鉴定主要依靠传统的系统生化方法，志贺菌采用血清学进 行种群的区分。目前，全基因组测序技术、16S rRNA等分子生物学方法也用于大肠杆菌与志 贺菌的区分以及志贺菌各个血清群的甄别鉴定。全球范围内高端技术体系的发展为细菌识 别鉴定提供了有利的工具。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术已经 发展近10余年，在微生物识别鉴定领域的应用已趋于成熟，其快速、准确、易操作、廉价、高 通量的特点已得到全世界范围的认同。但直接采用商业化的MALDI-TOF MS技术无法区分大 肠杆菌与志贺菌是业内公知的常识，研究者采用在商业化系统数据库内大量增加标准参考 菌谱的方式、采用MALDI-TOF MS结合ClinProTools软件的方式以及MALDI-TOF MS 结合人 工神经网络分析的方法进行大肠杆菌与志贺氏菌的区分，识别能力较原商业化系统有所提 高，达到90-94%的区分能力。但这些方法还是基于菌株本身的核糖体蛋白，采用的与商业化 系统相同的样本处理方式，只是在分析方法上进行的改进。志贺氏菌种内仍无法用MALDI- TOF MS区分。也有研究者通过宋内志贺的四个特征蛋白峰（5612.81±8.7、4871.12±45.9、 4164.03±26、3247.05±6.9）来区分宋内志贺和大肠杆菌，该方法采用24株宋内志贺菌，采 集了480张图，构建了标准参考谱，并将标准参考谱中与大肠杆菌的标准谱相比较得到的四 个特异峰作为两者鉴定判别的标准。然而采用该方法存在两个问题，一是该方法是基于宋 内志贺菌本身的核糖体蛋白采用MALDI-TOF MS 的常规手段进行手动操作进行区分，工作 量繁琐且复杂，采用现行的MALDI-TOF MS结合ClinProTools软件方法完全可以更高效地筛 选获得宋内志贺的特征蛋白峰，并替代该技术，且对宋内志贺菌核糖体蛋白筛选的覆盖面 更广，另一个问题是，特征蛋白峰以5612.81±8.7等来表征，这种表征方式在本领域内是不 正确的，例如5612.81是质荷比峰值，8.7是信噪比，两个不同的单位数值进行加减是不合理 的，且由于信噪比不是定值，每一张谱图都不完全相同，不能将质荷比（质量的大小）加减信 4 CN 111735871 A 说 明 书 2/8 页 噪比（信号强度的比值）；用这四个蛋白也无法区分宋内志贺和大肠杆菌，更无从谈及志贺 菌种群的区分。 针对大肠杆菌与志贺菌的区分鉴定、志贺菌种群的区分鉴定，目前采用传统的生 化方法及血清学分方法，操作复杂、耗时长、成本高。基于MALDI-TOF MS的大肠杆菌与志贺 菌鉴定结果混淆不清，文章中发表的改进的技术方法也只能达到最高94%的甄别能力；基于 MALDI-TOF MS技术无法进行志贺菌种群的区分鉴定，特别是容易将志贺菌误检为大肠杆 菌，从而导致用MALDI-TOF MS技术无法将大肠杆菌与志贺菌准确区分，更无法进一步鉴定 志贺菌是否为宋内志贺菌，给食品安全检验、传染病病原鉴定和传染病的防治防控工作带 来了不便和误诊风险。 因此，当一个未知菌通过MALDI-TOF质谱鉴定得出鉴定结果是大肠杆菌或志贺菌 或大肠杆菌 志贺菌时，目前的MALDI-TOF质谱方法无法进一步区分大肠杆菌和志贺菌，更 无法精确鉴定到是否为宋内志贺菌，迫切需要一种高通量、准确、操作简便的针对大肠杆菌 与志贺菌、以及志贺菌我国分离株的型别区分方法，以开发我国自主知识产权的质谱甄别 技术，为传染病防控提供新型技术支撑。
技术实现要素：
本发明的目的是提供基于MALDI-TOF MS技术的，快速、灵敏、准确、高通量的甄别 大肠杆菌和志贺菌以及确定是否为宋内志贺的方法。 本发明从微生物生化特性方面着手，考察大肠杆菌与志贺菌的生化特性差异，发 现在生化特性方面，大肠杆菌、志贺菌在生长过程中会分泌多种生物酶，本发明经过仔细梳 理、甄别和筛选，发现所有类型的大肠杆菌在生长过程中都产赖氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧 酶，A、B、C、D四个群的志贺菌在生长过程中只有宋内志贺产鸟氨酸脱羧酶（不产赖氨酸脱羧 酶），其他三种群的志贺菌既不产赖氨酸脱羧酶也不产鸟氨酸脱羧酶。赖氨酸脱羧酶将赖氨 酸分解为尸胺和二氧化碳、鸟氨酸脱羧酶可将鸟氨酸分解为腐胺和二氧化碳。 基于申请人的上述分析和归纳，对于已知待测菌属于大肠杆菌或志贺菌，要想进 一步确定是大肠杆菌还是志贺菌，只要检测待测菌带电尸胺特征峰m/z 103.12±0.1, 无 论是否有特征峰m/z 89.10±0.1，就可以确定待测菌是大肠杆菌（包括所有型别）；若没有 检测到m/z 103.12±0.1，则待测菌可以确定是志贺菌，因此，将带电尸胺103.12±0.1确定 为大肠杆菌和志贺菌甄别的特征峰。 申请人进一步发现，若检测结果特征峰没有m/z 103.12±0.1，且检测到了特征峰 m/z 89.10±0.1, 说明该菌只产鸟氨酸脱羧酶，即可判定为宋内志贺菌，因此，将带电腐胺 m/z 89.10±0.1确定为宋内志贺菌甄别特征峰。 本发明根据大肠杆菌与志贺菌的生化特性，即大肠杆菌产赖氨酸脱羧酶及鸟氨酸 脱羧酶，宋内志贺菌仅产鸟氨酸脱羧酶，确定赖氨酸和鸟氨酸的相应脱羧峰特征峰分别为 带电尸胺m/z 103 .12±0 .1（尸胺的摩尔质量为 103 .19，质谱检测到的精确分子量为 103.12，由于不同设备采集数据存在误差，故本发明限定带电尸胺m/z为 103.12±0.1）、带 电腐胺m/z 89.10±0.1（腐胺的摩尔质量为89.16, 质谱检测到的精确分子量为89.10，由 于不同设备采集数据存在误差，故本发明限定带电腐胺m/z为89.10±0.1），通过MALDI-TOF MS检测这两个特征峰判断待检测的样本是大肠杆菌还是志贺菌，并进一步确定是否为宋内 5 CN 111735871 A 说 明 书 3/8 页 志贺菌。 第一方面，本发明首先提供了一种甄别大肠杆菌和志贺菌的特征蛋白，所述特征 蛋白组合为带电尸胺，所述带电尸胺的特征峰质荷比m/z为：103.12±0.1。 本发明提供了上述特征蛋白在构建甄别大肠杆菌和志贺菌试剂盒中的应用。 本发明还提供了一种从志贺菌或大肠杆菌中鉴定宋内志贺菌的特征蛋白组合，所 述特征蛋白组合为带电尸胺和带电腐胺，所述带电尸胺和带电腐胺的特征峰质荷比m/z分 别为：103.12±0.1、89.10±0.1。 本发明提供了上述特征蛋白组合在构建甄别大肠杆菌和志贺菌以及宋内志贺菌 试剂盒中的应用。 上述应用，是通过MALDI-TOF MS检测方法结合生化方法检测待测细菌是否具有特 征蛋白的两个特征峰。 第二方面，本发明提供一种甄别大肠杆菌和志贺菌以及鉴定宋内志贺菌的试剂 盒：所述试剂盒含有生化试剂、反应液、标准校正液，所述生化试剂中含有赖氨酸和鸟氨酸， 二者质量比为1:1-5；所述反应液为 5-10 mg/L磷酸吡哆醛的PBS溶液；所述试剂盒基于 MALDI-TOF MS对待测细菌进行检测，检测结果以待测细菌是否具有带电尸胺的特征峰质荷 比m/z为103.12±0.1或带电腐胺特征峰质荷比m/z 为89.10±0.1作为判断标准；所述待测 细菌为已知属于大肠杆菌或志贺菌，但不确定具体种属。 当检测到待测细菌具有带电尸胺特征峰m/z 103.12±0.1时，待测细菌为大肠杆 菌； 当没有检测到带电尸胺特征峰m/z 103.12±0.1，待测细菌为志贺菌； 当没有检测到带电尸胺特征峰m/z 103.12±0.1，但检测到带电腐胺特征峰m/z 89.10 ±0.1时，则待测细菌为宋内志贺菌； 当没有检测到带电尸胺特征峰m/z 103.12±0.1，也没有检测到带电腐胺特征峰m/z 89.10±0.1时，则待测细菌为志贺菌的A群、B群或C群。 本发明的试剂盒含有说明书，说明书记载上述判断标准，或记录含有所述特征蛋 白组合的质谱图和对应的峰图，以供试剂盒操作者对比和判断。 第三方面，本发明提供了一种大肠杆菌和志贺菌的非疾病诊断目的的鉴别方法， 包括以下步骤： （1）待测菌接种到反应液中，再加入生化试剂，孵育；所述待测菌为已知属于大肠杆菌 或志贺菌，但不确定是大肠杆菌还是志贺菌； （2）离心，取上清液点到质谱仪样本靶上，自然干燥后在样本上覆盖基质饱和溶液； 所述基质饱和溶液为α-氢基-4-羟基肉桂酸在48.75%乙腈、2.5% 三氟乙酸中的饱和 液。 （3）采用MALDI-TOF 质谱仪采集数据，根据带电尸胺特征峰m/z 103.12±0.1的出 峰情况给出待测细菌的鉴别结果； 当检测到待测细菌具有带电尸胺特征峰m/z 103.12±0.1时，待测细菌为大肠杆菌； 当没有检测到带电尸胺特征峰m/z 103.12±0.1，待测细菌为志贺菌。 优选地，本发明提供了一种大肠杆菌和宋内志贺菌的非疾病诊断目的的鉴别方 法，包括以下步骤： 6 CN 111735871 A 说 明 书 4/8 页 （1）待测菌接种到反应液中，再加入生化试剂，孵育；所述待测菌为已知属于大肠杆菌 或志贺菌，但不确定是大肠杆菌还是志贺菌； （2）离心，取上清液点到质谱仪样本靶上，自然干燥后在样本上覆盖基质饱和溶液； 所述基质饱和溶液为α-氢基-4-羟基肉桂酸在48.75%乙腈、2.5% 三氟乙酸中的饱和 液。 （3）采用MALDI-TOF 质谱仪采集数据，根据带电尸胺和带电腐胺的相应特征峰m/z 103.12±0.1、89.10±0.1的出峰情况给出待测细菌的鉴别结果； 当没有检测到带电尸胺特征峰m/z 103.12±0.1，但检测到带电腐胺特征峰m/z 89.10 ±0.1时，则待测细菌为宋内志贺菌； 当没有检测到带电尸胺特征峰m/z 103.12±0.1，也没有检测到带电腐胺特征峰m/z 89.10±0.1时，则待测细菌为志贺菌的A群、B群或C群。 本发明的鉴别方法中，步骤（1）中，待测细菌样品优选为液体培养基培养的细菌， 更优选液体培养基培养的对数生长期的细菌。 采用固体培养基培养的细菌用于检测，也能实现是否为大肠杆菌或志贺菌以及是 否为宋内志贺的检测，但目标峰峰强度低于液体培养，对MALDI-TOF MS质谱的性能有一定 的要求。 所述反应液为5-10 mg/L磷酸吡哆醛的PBS溶液；所述生化试剂含有质量比为1:1- 5的赖氨酸和鸟氨酸；待测细菌样品接种到反应液的接种量为接种后的反应液浊度为0.2- 1.0麦氏单位，生化试剂与反应液的质量体积比为4-12:1（mg/ml）。 本发明的鉴别系统中，步骤（1）所述孵育为28-42℃下孵育1-8小时，优选37℃下4 小时。 步骤（2）所述质谱仪为MALDI-TOF MS质谱仪，采用反射模式或线性模式采集数据， 采集范围为0-200 Da，调整总采集频次使谱图总强度大于10000；采用标准校正液（Bruker 公司）质控校正仪器，使质量偏差小于300ppm。 基于本领域技术人员的理解，鉴别或鉴定大肠杆菌与志贺菌这类肠道常见致病 菌，还可应用于食品安全检测领域与环境检测等领域，因此本发明提供了一种鉴别大肠杆 菌与宋内志贺菌的方法还有非疾病诊断方面的应用。 因此，本发明还提供了一种鉴别宋内志贺菌的方法，包括以下步骤： （1）待测细菌样品接种到反应液中，再加入生化试剂，孵育； （2）离心，取上清液点到质谱仪样本靶上，自然干燥后在样本上覆盖基质饱和溶液； （3）采用质谱仪采集数据，根据赖氨酸和鸟氨酸的相应脱羧特征峰m/z 103.12±0.1、 89 .10±0 .1的出峰情况给出待测细菌的鉴别结果，当没有检测到带电尸胺特征峰m/z 103.12±0.1，但检测到带电腐胺特征峰m/z 89.10±0.1时，则待测细菌为宋内志贺菌。 采用本发明的试剂盒对109株菌进行了甄别鉴定，包括79株大肠杆菌，涵盖了肠出 血性大肠杆菌、致病性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌和凝聚性大肠杆 菌；30株志贺菌，包括痢疾志贺菌、福氏志贺菌、鲍氏志贺菌、宋内志贺菌。培养方式为液体 培养，反应中培养时间为2-4小时，数据采集模式为反射模式。结果显示，99株大肠杆菌都被 正确鉴定，30株志贺菌中的宋内志贺全部被正确甄别检出，检测试剂盒的灵敏度、准确度均 为100%。由于我国的志贺菌种群主要为宋内志贺与福氏志贺，因此，在我国分离的菌株，若 7 CN 111735871 A 说 明 书 5/8 页 采用本发明的方法鉴定不是宋内志贺，则提示可能为福氏志贺菌，只要进一步确认即可。 本发明采用生化方法与质谱技术相结合的方法，确定大肠杆菌与志贺菌甄别鉴定 的特征峰、宋内志贺菌与其他志贺菌区分的特征峰，构建了采用MALDI-TOF MS快速、高通 量、准确甄别大肠杆菌与志贺菌、鉴定宋内志贺菌的检测试剂盒和鉴别方法，鉴定准确性为 100%，并且一次检测实现两种菌株以及菌株内具体菌群的鉴别检测。鉴别过程耗时短，准确 度高，易操作，成本低，且在制备样本过程中无生物安全风险，符合高通量、快速、经济的理 想病原检测标准，适用于临床确诊、疾病监测、流行病学调查、公共卫生应急处理，食品安全 评价、环境污染检测具有十分重要的现实意义。本发明开发的一种可以进行大肠杆菌与志 贺菌以及志贺菌我国分离株的型别区分方法，旨在开发我国自主知识产权的质谱甄别技 术，为传染病防控提供新型技术支撑。 附图说明 图1 为液体培养与固体培养大肠杆菌菌株在反应液中培养后的特征峰强度。A1、 A2为同一株菌分别在液体、固体培养后的特征峰图； B1、B2为同一株菌在液体、固体培养后 的特征峰图。 图2为不同大肠杆菌菌株在反应液中培养时间优化。 图3为数据采集模式对特征峰的影响。A1、A2为同一株菌的反射模式、线性模式采 集数据； B1、B2为同一株菌反射模式、线性模式采集数据。
本发明提供了用于大肠杆菌和志贺菌甄别的试剂盒，涉及基于质谱的病原体甄别检测技术领域。本发明将生化方法和质谱技术相结合，根据大肠杆菌、志贺菌各自的生化特性，确定两个特征蛋白的质荷比m/z分别为103.12±0.1、89.10±0.1，结合生化试剂盒反应液，通过MALDI‑TOF MS 全部
背景技术：
致病性大肠杆菌共包括5类，分别为肠出血性大肠杆菌（EHEC）、致病性大肠杆菌 （EPEC）、肠产毒性大肠杆菌（ETEC）、肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）和凝聚性大肠杆菌（EAEC）。志 贺菌根据生化反应和O抗原不同，分为4个血清群，即痢疾志贺菌（A群）、福氏志贺菌（B群）、 鲍氏志贺菌（C群）、宋内志贺菌（D群）。大肠杆菌与志贺菌有密切的亲缘关系，在遗传学上非 常接近、遗传信息相似，因此，区分大肠杆菌与志贺菌以及志贺菌的四个种群非常困难，但 意义重大。从传染病防治法的角度，大肠杆菌引起的腹泻属于丙类中的其他感染性腹泻病， 而志贺菌引起的细菌性痢疾属于乙类传染病，报告和处理要求均不相同。因此大肠杆菌与 志贺菌的甄别鉴定十分重要，快速、准确的区分甄别意义重大。宋内志贺菌和福氏志贺菌是 我国分离株的主要菌群，我国6年内的志贺菌分离株中，宋内志贺菌与福氏志贺菌的分离率 为92.3%，这两个种群的快速区分，对我国志贺菌病的诊断与防治具有重要意义。 大肠杆菌与志贺菌区分鉴定主要依靠传统的系统生化方法，志贺菌采用血清学进 行种群的区分。目前，全基因组测序技术、16S rRNA等分子生物学方法也用于大肠杆菌与志 贺菌的区分以及志贺菌各个血清群的甄别鉴定。全球范围内高端技术体系的发展为细菌识 别鉴定提供了有利的工具。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术已经 发展近10余年，在微生物识别鉴定领域的应用已趋于成熟，其快速、准确、易操作、廉价、高 通量的特点已得到全世界范围的认同。但直接采用商业化的MALDI-TOF MS技术无法区分大 肠杆菌与志贺菌是业内公知的常识，研究者采用在商业化系统数据库内大量增加标准参考 菌谱的方式、采用MALDI-TOF MS结合ClinProTools软件的方式以及MALDI-TOF MS 结合人 工神经网络分析的方法进行大肠杆菌与志贺氏菌的区分，识别能力较原商业化系统有所提 高，达到90-94%的区分能力。但这些方法还是基于菌株本身的核糖体蛋白，采用的与商业化 系统相同的样本处理方式，只是在分析方法上进行的改进。志贺氏菌种内仍无法用MALDI- TOF MS区分。也有研究者通过宋内志贺的四个特征蛋白峰（5612.81±8.7、4871.12±45.9、 4164.03±26、3247.05±6.9）来区分宋内志贺和大肠杆菌，该方法采用24株宋内志贺菌，采 集了480张图，构建了标准参考谱，并将标准参考谱中与大肠杆菌的标准谱相比较得到的四 个特异峰作为两者鉴定判别的标准。然而采用该方法存在两个问题，一是该方法是基于宋 内志贺菌本身的核糖体蛋白采用MALDI-TOF MS 的常规手段进行手动操作进行区分，工作 量繁琐且复杂，采用现行的MALDI-TOF MS结合ClinProTools软件方法完全可以更高效地筛 选获得宋内志贺的特征蛋白峰，并替代该技术，且对宋内志贺菌核糖体蛋白筛选的覆盖面 更广，另一个问题是，特征蛋白峰以5612.81±8.7等来表征，这种表征方式在本领域内是不 正确的，例如5612.81是质荷比峰值，8.7是信噪比，两个不同的单位数值进行加减是不合理 的，且由于信噪比不是定值，每一张谱图都不完全相同，不能将质荷比（质量的大小）加减信 4 CN 111735871 A 说 明 书 2/8 页 噪比（信号强度的比值）；用这四个蛋白也无法区分宋内志贺和大肠杆菌，更无从谈及志贺 菌种群的区分。 针对大肠杆菌与志贺菌的区分鉴定、志贺菌种群的区分鉴定，目前采用传统的生 化方法及血清学分方法，操作复杂、耗时长、成本高。基于MALDI-TOF MS的大肠杆菌与志贺 菌鉴定结果混淆不清，文章中发表的改进的技术方法也只能达到最高94%的甄别能力；基于 MALDI-TOF MS技术无法进行志贺菌种群的区分鉴定，特别是容易将志贺菌误检为大肠杆 菌，从而导致用MALDI-TOF MS技术无法将大肠杆菌与志贺菌准确区分，更无法进一步鉴定 志贺菌是否为宋内志贺菌，给食品安全检验、传染病病原鉴定和传染病的防治防控工作带 来了不便和误诊风险。 因此，当一个未知菌通过MALDI-TOF质谱鉴定得出鉴定结果是大肠杆菌或志贺菌 或大肠杆菌 志贺菌时，目前的MALDI-TOF质谱方法无法进一步区分大肠杆菌和志贺菌，更 无法精确鉴定到是否为宋内志贺菌，迫切需要一种高通量、准确、操作简便的针对大肠杆菌 与志贺菌、以及志贺菌我国分离株的型别区分方法，以开发我国自主知识产权的质谱甄别 技术，为传染病防控提供新型技术支撑。
技术实现要素：
本发明的目的是提供基于MALDI-TOF MS技术的，快速、灵敏、准确、高通量的甄别 大肠杆菌和志贺菌以及确定是否为宋内志贺的方法。 本发明从微生物生化特性方面着手，考察大肠杆菌与志贺菌的生化特性差异，发 现在生化特性方面，大肠杆菌、志贺菌在生长过程中会分泌多种生物酶，本发明经过仔细梳 理、甄别和筛选，发现所有类型的大肠杆菌在生长过程中都产赖氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧 酶，A、B、C、D四个群的志贺菌在生长过程中只有宋内志贺产鸟氨酸脱羧酶（不产赖氨酸脱羧 酶），其他三种群的志贺菌既不产赖氨酸脱羧酶也不产鸟氨酸脱羧酶。赖氨酸脱羧酶将赖氨 酸分解为尸胺和二氧化碳、鸟氨酸脱羧酶可将鸟氨酸分解为腐胺和二氧化碳。 基于申请人的上述分析和归纳，对于已知待测菌属于大肠杆菌或志贺菌，要想进 一步确定是大肠杆菌还是志贺菌，只要检测待测菌带电尸胺特征峰m/z 103.12±0.1, 无 论是否有特征峰m/z 89.10±0.1，就可以确定待测菌是大肠杆菌（包括所有型别）；若没有 检测到m/z 103.12±0.1，则待测菌可以确定是志贺菌，因此，将带电尸胺103.12±0.1确定 为大肠杆菌和志贺菌甄别的特征峰。 申请人进一步发现，若检测结果特征峰没有m/z 103.12±0.1，且检测到了特征峰 m/z 89.10±0.1, 说明该菌只产鸟氨酸脱羧酶，即可判定为宋内志贺菌，因此，将带电腐胺 m/z 89.10±0.1确定为宋内志贺菌甄别特征峰。 本发明根据大肠杆菌与志贺菌的生化特性，即大肠杆菌产赖氨酸脱羧酶及鸟氨酸 脱羧酶，宋内志贺菌仅产鸟氨酸脱羧酶，确定赖氨酸和鸟氨酸的相应脱羧峰特征峰分别为 带电尸胺m/z 103 .12±0 .1（尸胺的摩尔质量为 103 .19，质谱检测到的精确分子量为 103.12，由于不同设备采集数据存在误差，故本发明限定带电尸胺m/z为 103.12±0.1）、带 电腐胺m/z 89.10±0.1（腐胺的摩尔质量为89.16, 质谱检测到的精确分子量为89.10，由 于不同设备采集数据存在误差，故本发明限定带电腐胺m/z为89.10±0.1），通过MALDI-TOF MS检测这两个特征峰判断待检测的样本是大肠杆菌还是志贺菌，并进一步确定是否为宋内 5 CN 111735871 A 说 明 书 3/8 页 志贺菌。 第一方面，本发明首先提供了一种甄别大肠杆菌和志贺菌的特征蛋白，所述特征 蛋白组合为带电尸胺，所述带电尸胺的特征峰质荷比m/z为：103.12±0.1。 本发明提供了上述特征蛋白在构建甄别大肠杆菌和志贺菌试剂盒中的应用。 本发明还提供了一种从志贺菌或大肠杆菌中鉴定宋内志贺菌的特征蛋白组合，所 述特征蛋白组合为带电尸胺和带电腐胺，所述带电尸胺和带电腐胺的特征峰质荷比m/z分 别为：103.12±0.1、89.10±0.1。 本发明提供了上述特征蛋白组合在构建甄别大肠杆菌和志贺菌以及宋内志贺菌 试剂盒中的应用。 上述应用，是通过MALDI-TOF MS检测方法结合生化方法检测待测细菌是否具有特 征蛋白的两个特征峰。 第二方面，本发明提供一种甄别大肠杆菌和志贺菌以及鉴定宋内志贺菌的试剂 盒：所述试剂盒含有生化试剂、反应液、标准校正液，所述生化试剂中含有赖氨酸和鸟氨酸， 二者质量比为1:1-5；所述反应液为 5-10 mg/L磷酸吡哆醛的PBS溶液；所述试剂盒基于 MALDI-TOF MS对待测细菌进行检测，检测结果以待测细菌是否具有带电尸胺的特征峰质荷 比m/z为103.12±0.1或带电腐胺特征峰质荷比m/z 为89.10±0.1作为判断标准；所述待测 细菌为已知属于大肠杆菌或志贺菌，但不确定具体种属。 当检测到待测细菌具有带电尸胺特征峰m/z 103.12±0.1时，待测细菌为大肠杆 菌； 当没有检测到带电尸胺特征峰m/z 103.12±0.1，待测细菌为志贺菌； 当没有检测到带电尸胺特征峰m/z 103.12±0.1，但检测到带电腐胺特征峰m/z 89.10 ±0.1时，则待测细菌为宋内志贺菌； 当没有检测到带电尸胺特征峰m/z 103.12±0.1，也没有检测到带电腐胺特征峰m/z 89.10±0.1时，则待测细菌为志贺菌的A群、B群或C群。 本发明的试剂盒含有说明书，说明书记载上述判断标准，或记录含有所述特征蛋 白组合的质谱图和对应的峰图，以供试剂盒操作者对比和判断。 第三方面，本发明提供了一种大肠杆菌和志贺菌的非疾病诊断目的的鉴别方法， 包括以下步骤： （1）待测菌接种到反应液中，再加入生化试剂，孵育；所述待测菌为已知属于大肠杆菌 或志贺菌，但不确定是大肠杆菌还是志贺菌； （2）离心，取上清液点到质谱仪样本靶上，自然干燥后在样本上覆盖基质饱和溶液； 所述基质饱和溶液为α-氢基-4-羟基肉桂酸在48.75%乙腈、2.5% 三氟乙酸中的饱和 液。 （3）采用MALDI-TOF 质谱仪采集数据，根据带电尸胺特征峰m/z 103.12±0.1的出 峰情况给出待测细菌的鉴别结果； 当检测到待测细菌具有带电尸胺特征峰m/z 103.12±0.1时，待测细菌为大肠杆菌； 当没有检测到带电尸胺特征峰m/z 103.12±0.1，待测细菌为志贺菌。 优选地，本发明提供了一种大肠杆菌和宋内志贺菌的非疾病诊断目的的鉴别方 法，包括以下步骤： 6 CN 111735871 A 说 明 书 4/8 页 （1）待测菌接种到反应液中，再加入生化试剂，孵育；所述待测菌为已知属于大肠杆菌 或志贺菌，但不确定是大肠杆菌还是志贺菌； （2）离心，取上清液点到质谱仪样本靶上，自然干燥后在样本上覆盖基质饱和溶液； 所述基质饱和溶液为α-氢基-4-羟基肉桂酸在48.75%乙腈、2.5% 三氟乙酸中的饱和 液。 （3）采用MALDI-TOF 质谱仪采集数据，根据带电尸胺和带电腐胺的相应特征峰m/z 103.12±0.1、89.10±0.1的出峰情况给出待测细菌的鉴别结果； 当没有检测到带电尸胺特征峰m/z 103.12±0.1，但检测到带电腐胺特征峰m/z 89.10 ±0.1时，则待测细菌为宋内志贺菌； 当没有检测到带电尸胺特征峰m/z 103.12±0.1，也没有检测到带电腐胺特征峰m/z 89.10±0.1时，则待测细菌为志贺菌的A群、B群或C群。 本发明的鉴别方法中，步骤（1）中，待测细菌样品优选为液体培养基培养的细菌， 更优选液体培养基培养的对数生长期的细菌。 采用固体培养基培养的细菌用于检测，也能实现是否为大肠杆菌或志贺菌以及是 否为宋内志贺的检测，但目标峰峰强度低于液体培养，对MALDI-TOF MS质谱的性能有一定 的要求。 所述反应液为5-10 mg/L磷酸吡哆醛的PBS溶液；所述生化试剂含有质量比为1:1- 5的赖氨酸和鸟氨酸；待测细菌样品接种到反应液的接种量为接种后的反应液浊度为0.2- 1.0麦氏单位，生化试剂与反应液的质量体积比为4-12:1（mg/ml）。 本发明的鉴别系统中，步骤（1）所述孵育为28-42℃下孵育1-8小时，优选37℃下4 小时。 步骤（2）所述质谱仪为MALDI-TOF MS质谱仪，采用反射模式或线性模式采集数据， 采集范围为0-200 Da，调整总采集频次使谱图总强度大于10000；采用标准校正液（Bruker 公司）质控校正仪器，使质量偏差小于300ppm。 基于本领域技术人员的理解，鉴别或鉴定大肠杆菌与志贺菌这类肠道常见致病 菌，还可应用于食品安全检测领域与环境检测等领域，因此本发明提供了一种鉴别大肠杆 菌与宋内志贺菌的方法还有非疾病诊断方面的应用。 因此，本发明还提供了一种鉴别宋内志贺菌的方法，包括以下步骤： （1）待测细菌样品接种到反应液中，再加入生化试剂，孵育； （2）离心，取上清液点到质谱仪样本靶上，自然干燥后在样本上覆盖基质饱和溶液； （3）采用质谱仪采集数据，根据赖氨酸和鸟氨酸的相应脱羧特征峰m/z 103.12±0.1、 89 .10±0 .1的出峰情况给出待测细菌的鉴别结果，当没有检测到带电尸胺特征峰m/z 103.12±0.1，但检测到带电腐胺特征峰m/z 89.10±0.1时，则待测细菌为宋内志贺菌。 采用本发明的试剂盒对109株菌进行了甄别鉴定，包括79株大肠杆菌，涵盖了肠出 血性大肠杆菌、致病性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌和凝聚性大肠杆 菌；30株志贺菌，包括痢疾志贺菌、福氏志贺菌、鲍氏志贺菌、宋内志贺菌。培养方式为液体 培养，反应中培养时间为2-4小时，数据采集模式为反射模式。结果显示，99株大肠杆菌都被 正确鉴定，30株志贺菌中的宋内志贺全部被正确甄别检出，检测试剂盒的灵敏度、准确度均 为100%。由于我国的志贺菌种群主要为宋内志贺与福氏志贺，因此，在我国分离的菌株，若 7 CN 111735871 A 说 明 书 5/8 页 采用本发明的方法鉴定不是宋内志贺，则提示可能为福氏志贺菌，只要进一步确认即可。 本发明采用生化方法与质谱技术相结合的方法，确定大肠杆菌与志贺菌甄别鉴定 的特征峰、宋内志贺菌与其他志贺菌区分的特征峰，构建了采用MALDI-TOF MS快速、高通 量、准确甄别大肠杆菌与志贺菌、鉴定宋内志贺菌的检测试剂盒和鉴别方法，鉴定准确性为 100%，并且一次检测实现两种菌株以及菌株内具体菌群的鉴别检测。鉴别过程耗时短，准确 度高，易操作，成本低，且在制备样本过程中无生物安全风险，符合高通量、快速、经济的理 想病原检测标准，适用于临床确诊、疾病监测、流行病学调查、公共卫生应急处理，食品安全 评价、环境污染检测具有十分重要的现实意义。本发明开发的一种可以进行大肠杆菌与志 贺菌以及志贺菌我国分离株的型别区分方法，旨在开发我国自主知识产权的质谱甄别技 术，为传染病防控提供新型技术支撑。 附图说明 图1 为液体培养与固体培养大肠杆菌菌株在反应液中培养后的特征峰强度。A1、 A2为同一株菌分别在液体、固体培养后的特征峰图； B1、B2为同一株菌在液体、固体培养后 的特征峰图。 图2为不同大肠杆菌菌株在反应液中培养时间优化。 图3为数据采集模式对特征峰的影响。A1、A2为同一株菌的反射模式、线性模式采 集数据； B1、B2为同一株菌反射模式、线性模式采集数据。
