技术摘要：
本发明公开了一种金团簇或含金团簇的物质在制备预防和/或治疗青光眼药物中的应用。本发明的含金团簇的物质在抑制Aβ聚集的体外实验表现出优异的抑制Aβ聚集效果，在RGC‑5视神经节细胞损伤模型中对改善细胞存活率表现出明显效果，在大鼠青光眼视神经钳夹损伤模型中可显  全部
背景技术：
青光眼是以是视神经损伤、视野缺损及视功能逐渐丧失为特征的一种不可逆性视 神经退行性病变。它是仅次于白内障的全世界第二位不可逆性致盲性眼病。据临床分析数 据预测，到2020年全球青光眼患者的数量将达7600万，尤其以亚洲和非洲更为突出，而我国 到2020年将有2100万青光眼患者。青光眼的发病机制迄今尚未阐明。长期以来，病理性眼内 压升高被认为是引起神经损伤以及青光眼的主要因素之一，临床上治疗青光眼的方法也主 要是基于降低患者眼压。然而众多的临床数据显示仅靠控制眼压并不能达到治疗青光眼的 目的。因为即使眼压控制的很理想，视神经进行性损伤及视网膜神经节细胞(Retinal  ganglion  cells，RGCs)凋亡仍继续加重。因此高眼压可能只是青光眼视神经损伤的早期诱 发因素，而仅靠降低眼压难以阻止视神经功能的进一步丧失。鉴于以上原因，增强视神经功 能、阻断或减缓视神经细胞凋亡和视神经损伤是治疗青光眼的关键。然而，目前尚无临床药 物能有效阻止青光眼相关的视神经损伤。研究发现，多种因素，如氧化应激、机械压力、自身 免疫系统异常、血糖水平、炎症因子以及异常蛋白沉淀等均可以导致视神经损伤。其中越来 越引起关注的是，β淀粉样蛋白(amyloid-β，Aβ)及Tau蛋白的错误折叠以及在细胞内外的异 常聚集及纤维化在视神经退行性病变及RGCs死亡过程中起着至关重要的作用。 Aβ是由淀粉样前体蛋白(amyloid  precursor  protein，APP)经β-分泌酶和γ-分 泌酶水解产生的含39-43个氨基酸残基的蛋白质，是参与神经损伤和神经细胞凋亡的重要 因子。研究认为Aβ的神经毒性是多种神经退行性疾病，如阿尔兹海默症(Alzheimer’s  disease，AD)等，形成和发病的共同机制，并且也长期作为相关药物研发的重要靶点。近年 研究表明，Aβ神经毒性在眼科领域神经退行性疾病—青光眼中也扮演了至关重要的角色。 临床青光眼患者RGCs及房水中Aβ表达明显高于对照组。而在青光眼动物模型中，长期高眼 压导致的RGCs细胞凋亡与Amyloid前体蛋白(APP)、Aβ表达升高及Tau蛋白过度磷酸化密切 相关。同时，临床数据显示AD患者更易患青光眼以及视力丧失。并且AD转基因动物的视网膜 中合成了大量APP并出现Aβ斑块聚集。因此，青光眼与AD可能有类似的Aβ机制。更重要的是， 在青光眼动物模型中，处于凋亡期的RGCs细胞与Aβ共表达，采用Aβ抗体或药物阻断Aβ的过 度产生，可有效抑制RGCs细胞凋亡和改善视神经损伤。这些研究成果均显示Aβ在青光眼发 病过程中扮演重要角色，是基于视神经保护机制治疗青光眼的重要靶点。 3 CN 111588733 A 说　明　书 2/23 页 大鼠视神经钳夹损伤模型是一个广泛应用的非高眼压青光眼动物模型。它保持了 视神经外模完整，模拟青光眼视神经轴浆运输中断和RGCs死亡，接近临床青光眼损伤特征。 同时，该模型制作方式规范，操作简单，可造成明确、定量的视神经损伤，并且误差小、重复 性好，是国内外公认的较精确的青光眼视神经损伤模型，在研究青光眼视神经损伤及RGCs 损害病理机制以及视神经保护药物的筛选中应用广泛。例如，通过该模型已经发现人生皂 苷Rg1、地塞米松、银杏、α-硫辛酸具有一定的是神经保护作用，但保护效果未尽如人意。由 于Aβ机制在视神经损伤过程中发挥重要作用，因此开发一种能抑制Aβ聚集与纤维化，同时 在动物模型中能保护视神经并改善视觉功能的药物，将对青光眼的预防与治疗有重大意 义。 金纳米粒子是尺寸为纳米级(金核直径通常为3-100nm)的金颗粒，因其具有独特 的光学和电学性质，良好的生物相容性，并易于表面修饰，广泛应用于生物传感器、医学成 像和肿瘤检测等生物及医学相关领域。由于其化学惰性和巨大的比表面，以及具有低浓度 下穿透血脑屏障的能力，金纳米粒子也作为药物载体用于药物定向输运、药物可控释放等 方面的研究。近年来，有研究将金纳米粒子与对纤维化蛋白的聚集有抑制作用的特定配体 (如杂多酸、特定序列的多肽等)结合，在抑制蛋白纤维化变性的体外实验中取得一定效果 (Y .H .Liao ,Y .J .Chang ,Y .Yoshiike ,Y .C .Chang ,Y .R .Chen ,Small  2012 ,8 ,3631 .； Y .D .Alvarez ,J .A .Fauerbach ,J .V .Pellegrotti ,T .M .Jovin ,E .A .Jares-Erijman , F.D.Stefani,Nano  Letters  2013,13,6156；S.Hsieh,C.W.Chang,H.H.Chou,Colloids  and  Surfaces  B:Biointerfaces,2013,112,525)，但细胞模型的结果表明，金纳米粒子的使用 对纤维化蛋白损伤细胞的存活率并无明显作用(N .Gao ,H .Sun ,K .Dong ,J .Ren ,X .Qu , Chemistry-A  European  Journal  2015,21,829)，动物模型层面的实验则未见报道。并且， 在这些研究中，金纳米粒子主要作为药物载体使用，而不是起效成分。 金团簇是一种超微金纳米粒子，金核直径小于3nm。其中仅含有数个至数百个金原 子，导致金纳米粒子中所具有的金原子的面心立方堆积结构坍塌，能级发生分裂，从而表现 出与3nm以上的常规金纳米粒子完全不同的类分子的性质：一方面，由于能级分裂，金团簇 不具备常规金纳米粒子所具有的表面等离子体效应及衍生的光学性质，却表现出与半导体 量子点相似的优异荧光发射性质；另一方面，金团簇的紫外可见吸收光谱中在520±20nm处 的等离子体共振峰消失，而在570nm以上出现一个或多个新的吸收峰，而这类吸收峰在常规 金纳米粒子中观察不到，因此紫外可见吸收光谱中等离子体共振吸收峰(520±20nm)的消 失和570nm以上新吸收峰的出现是判断金团簇是否制备成功的重要标志(H .F .Qian , M.Z.Zhu,Z.K.Wu,R.C.Jin,Accounts  of  Chemical  Research  2012,45,1470)。金团簇还具 有与常规金纳米粒子明显不同的磁学、电学和催化性质，因而在单分子光电、分子催化等领 域具有广阔的应用前景。此外，金团簇由于优异的荧光发射性质在生物探针及医学成像领 域也已获得应用。例如，Sandeep  Verma课题组将嘌呤修饰的金团簇作为绿色荧光探针用于 细胞核成像(V.Venkatesh ,A.Shukla ,S.Sivakumar,S.Verma ,ACS  Applied  Materials& Interfaces  2014,6,2185)，该类文献利用的是金团簇的荧光发射特性，而未涉及其本身的 药用活性。 4 CN 111588733 A 说　明　书 3/23 页
技术实现要素：
本发明目的在于提出金团簇的一种医药用途，具体提供其在制备预防及治疗青光 眼的药物中的新应用。为此， 第一方面，提供一种含金团簇的物质在制备预防和/或治疗青光眼药物中的应用。 所述含金团簇的物质包括金团簇及其外部包覆的配体Y。 所述含金团簇的物质为溶液、粉末或絮状物。 所述金团簇的金核直径小于3nm，优选0.5-2.6nm或1.1-2.6nm。 所述配体Y包括但不局限于L(D)-半胱氨酸及其衍生物、含半胱氨酸的寡肽及其衍 生物、其它含巯基的化合物中的一种或几种。 所述L(D)-半胱氨酸及其衍生物选自L(D)-半胱氨酸、N-异丁酰基-L(D)-半胱氨酸 (L(D)-NIBC)或N-乙酰基-L(D)-半胱氨酸(L(D)-NAC)。 所述含半胱氨酸的寡肽及其衍生物选自L-精氨酸-L-半胱氨酸(RC)、L-半胱氨酸- L-精氨酸(CR)、L-半胱氨酸-L-组氨酸二肽(CH)、L-组氨酸-L-半胱氨酸二肽(HC)、L-谷胱甘 肽(GSH)、L-赖氨酸-L-半胱氨酸-L-脯氨酸三肽(KCP)、L-脯氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨酸三 肽(PCR)、甘氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨酸三肽(GCR)、甘氨酸-L-丝氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨 酸四肽(GSCR)或甘氨酸-L-半胱氨酸-L-丝氨酸-L-精氨酸四肽(GCSR)。 所述其它含巯基的化合物选自1-[(2S)-2-甲基-3-巯基-1-氧代丙基]-L-脯氨酸 (Cap)、巯基乙酸、巯基乙醇、苯硫酚、D-3-巯基缬氨酸、N-(2-巯基丙酰基)-甘氨酸或十二硫 醇等。 制备所述含金团簇的物质的方法，包括以下步骤： (1)把HAuCl4溶于甲醇、水、乙醇、正丙醇、乙酸乙酯中的一种配成HAuCl4浓度为 0.01～0.03M的溶液A； (2)把配体Y溶于溶剂中配成浓度为0.01～0.18M的溶液B； (3)将步骤(1)的溶液A和步骤(2)的溶液B混合，HAuCl4和配体Y的摩尔比为1:0.01 ～1:100(优选1：(0.1-10)，更优选1：(1-10))，在冰浴下搅拌反应0.1～12h(优选0.1-2h，更 优选0.5-2h)，滴加0.025～0.8M的NaBH4溶液(优选NaBH4水溶液、NaBH4乙醇溶液、NaBH4甲醇 溶液)后，在冰水浴中继续搅拌反应0.1～12h(优选0.1-2h，更优选1-2h)，NaBH4与配体Y的 摩尔比为1:0.01～1:100(优选1：(0.1-8)，更优选1：(1-8))，得到溶液状的含金团簇的物 质。 步骤(2)中的所述溶剂为甲醇、乙酸乙酯、水、乙醇、正丙醇、戊烷、甲酸、乙酸、乙 醚、丙酮、苯甲醚、1－丙醇、2－丙醇、1－丁醇、2－丁醇、戊醇、乙醇、乙酸丁酯、三丁甲基乙 醚、乙酸异丙酯、二甲亚砜、乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸甲酯、2－甲基－1－丙 醇、乙酸丙酯中的一种或多种。 第二方面，本发明提供了金团簇在制备预防和/或治疗青光眼药物中的应用，所述 金团簇金核直径小于3nm；所述金团簇可经不同配体修饰，配体可为对青光眼有效或无效的 成分。 第三方面，本发明提供了由L-NIBC、D-NIBC、CR、RC、N-乙酰基-L-半胱氨酸(L- NAC)、N-乙酰基-D-半胱氨酸(D-NAC)、GSH、1-[(2S)-2-甲基-3-巯基-1-氧代丙基]-L-脯氨 酸(Cap)、L-半胱氨酸或D-半胱氨酸配体修饰的金团簇(金核直径小于3nm，优选0.5-2.6nm) 5 CN 111588733 A 说　明　书 4/23 页 在制备预防和/或治疗青光眼药物中的应用。 本发明提出的金团簇或含金团簇的物质(指配体修饰的金团簇)可以使用口服、注 射(肌肉注射或静脉注射)或局部点眼方式给药，给药量及给药频率可根据细胞模型实验、 动物模型实验及药物体内分布及代谢实验结果计算获得。 功效方面，本发明的金团簇或含金团簇的物质在抑制Aβ聚集的体外实验中表现出 优异的抑制Aβ聚集效果，在RGC-5视神经节细胞损伤模型中对改善细胞存活率表现出明显 效果，在大鼠青光眼视神经钳夹损伤模型中可显著提升视神经钳夹损伤模型大鼠的闪光视 觉诱发电位的N2-P2振幅，并显著减少视网膜神经节细胞的丢失，对视神经损伤有明显保护 作用，可缩小视野缺损，降低RGCs细胞凋亡，对改善视网膜和视神经组织结构以及缓解视功 能障碍有显著作用，并且在动物层面也具有良好的生物相容性。因此，对预防与治疗青光眼 的新药研发有重要意义。 同时，本发明还证明配体分子本身在体外抑制Aβ聚集的动力学实验、RGC-5细胞损 伤的青光眼细胞模型中均未表现出明显作用，这表明对青光眼的药效来自于金团簇本身， 而不是配体。金团簇本身新的医药用途是本发明的重要贡献。基于金团簇本身对青光眼的 药用活性再进一步组配已知有活性(包括但不限于对青光眼的活性)的物质或其它没有活 性的物质如载体、助溶剂等，将形成更具竞争力的新药。 附图说明 图1为不同粒径的配体L-NIBC修饰的金纳米粒子的紫外可见光光谱、透射电镜照 片和粒径分布图； 图2为不同粒径的配体L-NIBC修饰的金团簇的紫外可见光光谱、透射电镜照片和 粒径分布图； 图3为不同粒径的配体L-NIBC修饰的金团簇的红外光谱图； 图4为平均直径为1.8nm的L-NIBC修饰的金团簇的激发光谱图和近红外荧光发射 光谱图； 图5为Aβ(1-40)与均为配体L-NIBC修饰的金纳米粒子或金团簇共同孵育48h后的 AFM形貌图； 图6为不同粒径、不同浓度的均为配体L-NIBC修饰的金纳米粒子和金团簇的Aβ纤 维化动力学曲线图； 图7为配体CR修饰的金团簇(CR-AuNCs)的紫外、红外、透射电镜和粒径分布图； 图8为配体RC修饰的金团簇(RC-AuNCs)的紫外、红外、透射电镜和粒径分布图； 图9为配体1-[(2S)-2-甲基-3-巯基-1-氧代丙基]-L-脯氨酸(即Cap)修饰的金团 簇(Cap-AuNCs)的紫外、红外、透射电镜和粒径分布图； 图10为配体GSH修饰的金团簇(GSH-AuNCs)的紫外、红外、透射电镜和粒径分布图； 图11为配体D-NIBC修饰的金团簇(D-NIBC-AuNCs)的紫外、红外、透射电镜和粒径 分布图； 图12为不同配体修饰金团簇对Aβ(1-40)聚集及纤维化的抑制效果图； 图13为配体L-NIBC修饰的金团簇或金纳米粒子对H2O2诱导的氧化应激青光眼RGC- 5细胞模型细胞存活率影响图； 6 CN 111588733 A 说　明　书 5/23 页 图14为配体L-NIBC修饰的金团簇或金纳米粒子对硝普钠诱导的细胞凋亡青光眼 RGC-5细胞模型细胞存活率影响图； 图15为含金团簇的物质对青光眼模型大鼠模型眼睛fVEP  N2潜伏期的影响图； 图16为含金团簇的物质对青光眼模型大鼠眼睛fVEP  P2潜伏期的影响图； 图17为含金团簇的物质对青光眼模型大鼠眼睛fVEP  N2-P2振幅的影响； 图18为连续14天含金团簇的物质给药后，动物视网膜铺片Brn3a染色图例及染色 阳性细胞个数统计分析图； 图19为连续14天含金团簇的物质给药后，动物视网膜病理切片HE染色图例及RGCs 个数统计分析图； 图20为不同粒径、不同浓度的L-NIBC修饰的金团簇对SH-sy5y神经母瘤细胞存活 率的影响图。