技术摘要：
本发明提供了一种用于检测母体血液中胎儿游离DNA β‑地中海贫血突变的探针及试剂盒；该试剂盒包括检测探针、捕获探针，还包括反应膜条、目的基因扩增试剂、清洗液、孵育液和显色液。该试剂盒利用了斑点杂交法，该方法使用了DNA杂交过程来检测产物，具有操作简单、快速 全部
背景技术：
1997年，研究发现在母体血浆中存在游离胎儿DNA(cffDNA)，这一发现为无创性产 前诊断开辟了新的途径，尤其是在单基因遗传性疾病的诊断中，为预防出生缺陷cffDNA的 检测至关重要。目前文献报道的cffDNA检测β-地中海贫血的突变主要对男性胚胎中Y染色 体上的特异性基因，从而获得cffDNA在母体血浆中的含量，对女性胚胎的cffDNA进行检测， 则通过分析胎儿和父母之间不同的核苷酸序列的遗传多态性来鉴别胎儿DNA，但由于实验 程度复杂且实验条件要求高，难以应用于临床。 表观遗传学进展拓宽了通过母体血浆中存在的胎儿DNA诊断疾病的应用领域。 2015年Lessard等通过胎儿和成人红系祖细胞DNA甲基化谱的比较，发现胎儿细胞的基因区 与母体的该区域基因区存在甲基化差异，这种DNA甲基化差异的存在也使得从母体血浆中 检测源自母系的胎儿等位基因成为现实，因此DNA甲基化作为一种潜在的检测胎儿表观遗 传学标记物，越来越受到重视。 但将斑点杂交和DNA甲基化差异检测相结合用于确定胎儿出生缺陷暂未见文献报 道。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种用于检测母体血液中胎儿游离 DNA β-地中海贫血突变的探针及试剂盒，本发明通过设计针对胎儿DNA甲基化特异性序列 (HBG2启动子区)的探针和突变型β-地中海贫血基因组探针，再通过斑点杂交检测cffDNA的 β-地中海贫血突变位点，从而确定胎儿的出生缺陷，该试剂盒具有操作简单、快速简便，样 品用量少，结果直观可靠的优势，采用该试剂盒可以在无创产前诊断中用于母体血浆中胎 儿游离DNA β-地中海贫血突变的直接检测。 为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 一种用于检测母体血液中胎儿游离DNA β-地中海贫血突变的探针，包括检测探针 和捕获探针； 检测探针的核苷酸序列为： 5'-AACCCATTCAGGTTGATGATTTGACCCCC-3'(SEQ ID NO：1)； 捕获探针的核苷酸序列为： 41-42N位点：5'-GAGGTTTTTTGAGTTT-3'(SEQ ID NO：2)； 41-42M位点：5'-GGTTGAGTTTTTTG-3'(SEQ ID NO：3)； 17N位点：5'-TGTGGGGTAAGGTG-3'(SEQ ID NO：4)； 4 CN 111593119 A 说 明 书 2/7 页 17M位点：5'-TTTGGTTAGGTGAATG-3'(SEQ ID NO：5)； 654N位点：5'-GTTATTGTTTTAAT-3'(SEQ ID NO：6)； 654M位点：5'-GTTATTATTTTAATT-3'(SEQ ID NO：7)； 71-72N位点：5'-GGTGTTTTTAGTGAT-3'(SEQ ID NO：8)； 71-72M位点：5'-TTTAAGTGATGGTT-3'(SEQ ID NO：9)； -28N位点：5'-TTGATTTTTATGTTT-3'(SEQ ID NO：10)； -28M位点：5'-TGATTTTTATGTTT-3'(SEQ ID NO：11)； βeN位点：5'-GGGTTTTATTATTA-3'(SEQ ID NO：12)； βeM位点：5'-GGTGGTAAGGTTTT-3'(SEQ ID NO：13)； 31N位点：5'-TAGGTTGTTGGTGG-3'(SEQ ID NO：14)； 31M位点：5'-TTAGGTGTTGGTG-3'(SEQ ID NO：15)； 43M位点：5'-TTTTTTTAGTTTTTTG-3'(SEQ ID NO：16)； 14-15M位点：5'-TTGGTGGGGTAAGG-3'(SEQ ID NO：17)； IVS1-1N位点：5'-GGGTAGATTGGTAT-3'(SEQ ID NO：18)； IVS1-1M位点：5'-GGGTAGTTTGGTAT-3'(SEQ ID NO：19)； IVS1-5M位点：5'-GGTTGTTATTAAGG-3'(SEQ ID NO：20)； -29M位点：5'-TGATTTTTATGTTT-3'(SEQ ID NO：21)； CAPM位点：5'-TGGTGTTTGAGGTTG-3'(SEQ ID NO：22)； INTM位点：5'-ATGTATTTTGGTGT-3'(SEQ ID NO：23)； 27-28M位点：5'-GGTGAGGTTTTT-3'(SEQ ID NO：24)。 一种用于检测母体血液中胎儿游离DNA β-地中海贫血突变的试剂盒，包括：上述 检测探针、捕获探针，还包括反应膜条、目的基因扩增试剂、清洗液、孵育液和显色液。 进一步地，目的基因扩增试剂包括Taq DNA聚合酶、10*PCR Buffer、dNTP Mixture、水、引物。 进一步地，上述引物序列为： F：5'-AACTACTATTATTTTATAAACATTTTTGTTTTTTTTTT-3'(SEQ ID NO：25)； R：5'-TTTCAATTAAAATAAATTTTTTTTATTTTTCATAATC-3'(SEQ ID NO：26)。 进一步地，清洗液为SSC溶液、SDS溶液和蒸馏水混合的混合溶液。 进一步地，1L清洗液中含有25mL的20×SSC溶液和10mL的10％SDS溶液。 进一步地，孵育液为SSC溶液、SDS溶液、蒸馏水和POD混合的混合溶液。 进一步地，孵育液通过以下方法配制：将100mL的20×SSC溶液和10mL的10％SDS溶 液混合，再用蒸馏水定容至1000mL，制得A液，将A液和POD按体积比为2000:1混合，制得孵育 液。 进一步地，显色液为柠檬酸钠缓冲溶液、TMB和H2O2混合的混合溶液。 进一步地，显色液为将pH 5.4，0.1M柠檬酸钠缓冲溶液、TMB和30％H2O2按体积比为 19:1:0.002混合的混合液。 本发明提供的用于检测母体血液中胎儿游离DNA β-地中海贫血突变的试剂盒，具 有以下有益效果： 本发明试剂盒中的捕获探针是一种针对中国人最常见的19中突变型β-地中海贫 5 CN 111593119 A 说 明 书 3/7 页 血，反向斑点杂交检测结果显示该探针能同时检测95％中国人群的β-地中海贫血突变类 型，而且检测探针是针对cffDNA与母体cfDNA HBG2启动子区的甲基化差异而设计的，能特 异性结合cffDNA，因此此检测方法不受胎儿性别的影响，从而保证了此检测方法应用的广 泛性。该试剂盒利用了斑点杂交，该方法使用了DNA杂交过程来检测产物，具有操作简单、快 速简便、样品用量少、结果直观可靠等优点，可在无创产前诊断中广泛用于母体血浆中胎儿 游离DNAβ-地中海贫血突变的检测。
本发明提供了一种用于检测母体血液中胎儿游离DNA β‑地中海贫血突变的探针及试剂盒；该试剂盒包括检测探针、捕获探针，还包括反应膜条、目的基因扩增试剂、清洗液、孵育液和显色液。该试剂盒利用了斑点杂交法，该方法使用了DNA杂交过程来检测产物，具有操作简单、快速 全部
背景技术：
1997年，研究发现在母体血浆中存在游离胎儿DNA(cffDNA)，这一发现为无创性产 前诊断开辟了新的途径，尤其是在单基因遗传性疾病的诊断中，为预防出生缺陷cffDNA的 检测至关重要。目前文献报道的cffDNA检测β-地中海贫血的突变主要对男性胚胎中Y染色 体上的特异性基因，从而获得cffDNA在母体血浆中的含量，对女性胚胎的cffDNA进行检测， 则通过分析胎儿和父母之间不同的核苷酸序列的遗传多态性来鉴别胎儿DNA，但由于实验 程度复杂且实验条件要求高，难以应用于临床。 表观遗传学进展拓宽了通过母体血浆中存在的胎儿DNA诊断疾病的应用领域。 2015年Lessard等通过胎儿和成人红系祖细胞DNA甲基化谱的比较，发现胎儿细胞的基因区 与母体的该区域基因区存在甲基化差异，这种DNA甲基化差异的存在也使得从母体血浆中 检测源自母系的胎儿等位基因成为现实，因此DNA甲基化作为一种潜在的检测胎儿表观遗 传学标记物，越来越受到重视。 但将斑点杂交和DNA甲基化差异检测相结合用于确定胎儿出生缺陷暂未见文献报 道。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种用于检测母体血液中胎儿游离 DNA β-地中海贫血突变的探针及试剂盒，本发明通过设计针对胎儿DNA甲基化特异性序列 (HBG2启动子区)的探针和突变型β-地中海贫血基因组探针，再通过斑点杂交检测cffDNA的 β-地中海贫血突变位点，从而确定胎儿的出生缺陷，该试剂盒具有操作简单、快速简便，样 品用量少，结果直观可靠的优势，采用该试剂盒可以在无创产前诊断中用于母体血浆中胎 儿游离DNA β-地中海贫血突变的直接检测。 为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 一种用于检测母体血液中胎儿游离DNA β-地中海贫血突变的探针，包括检测探针 和捕获探针； 检测探针的核苷酸序列为： 5'-AACCCATTCAGGTTGATGATTTGACCCCC-3'(SEQ ID NO：1)； 捕获探针的核苷酸序列为： 41-42N位点：5'-GAGGTTTTTTGAGTTT-3'(SEQ ID NO：2)； 41-42M位点：5'-GGTTGAGTTTTTTG-3'(SEQ ID NO：3)； 17N位点：5'-TGTGGGGTAAGGTG-3'(SEQ ID NO：4)； 4 CN 111593119 A 说 明 书 2/7 页 17M位点：5'-TTTGGTTAGGTGAATG-3'(SEQ ID NO：5)； 654N位点：5'-GTTATTGTTTTAAT-3'(SEQ ID NO：6)； 654M位点：5'-GTTATTATTTTAATT-3'(SEQ ID NO：7)； 71-72N位点：5'-GGTGTTTTTAGTGAT-3'(SEQ ID NO：8)； 71-72M位点：5'-TTTAAGTGATGGTT-3'(SEQ ID NO：9)； -28N位点：5'-TTGATTTTTATGTTT-3'(SEQ ID NO：10)； -28M位点：5'-TGATTTTTATGTTT-3'(SEQ ID NO：11)； βeN位点：5'-GGGTTTTATTATTA-3'(SEQ ID NO：12)； βeM位点：5'-GGTGGTAAGGTTTT-3'(SEQ ID NO：13)； 31N位点：5'-TAGGTTGTTGGTGG-3'(SEQ ID NO：14)； 31M位点：5'-TTAGGTGTTGGTG-3'(SEQ ID NO：15)； 43M位点：5'-TTTTTTTAGTTTTTTG-3'(SEQ ID NO：16)； 14-15M位点：5'-TTGGTGGGGTAAGG-3'(SEQ ID NO：17)； IVS1-1N位点：5'-GGGTAGATTGGTAT-3'(SEQ ID NO：18)； IVS1-1M位点：5'-GGGTAGTTTGGTAT-3'(SEQ ID NO：19)； IVS1-5M位点：5'-GGTTGTTATTAAGG-3'(SEQ ID NO：20)； -29M位点：5'-TGATTTTTATGTTT-3'(SEQ ID NO：21)； CAPM位点：5'-TGGTGTTTGAGGTTG-3'(SEQ ID NO：22)； INTM位点：5'-ATGTATTTTGGTGT-3'(SEQ ID NO：23)； 27-28M位点：5'-GGTGAGGTTTTT-3'(SEQ ID NO：24)。 一种用于检测母体血液中胎儿游离DNA β-地中海贫血突变的试剂盒，包括：上述 检测探针、捕获探针，还包括反应膜条、目的基因扩增试剂、清洗液、孵育液和显色液。 进一步地，目的基因扩增试剂包括Taq DNA聚合酶、10*PCR Buffer、dNTP Mixture、水、引物。 进一步地，上述引物序列为： F：5'-AACTACTATTATTTTATAAACATTTTTGTTTTTTTTTT-3'(SEQ ID NO：25)； R：5'-TTTCAATTAAAATAAATTTTTTTTATTTTTCATAATC-3'(SEQ ID NO：26)。 进一步地，清洗液为SSC溶液、SDS溶液和蒸馏水混合的混合溶液。 进一步地，1L清洗液中含有25mL的20×SSC溶液和10mL的10％SDS溶液。 进一步地，孵育液为SSC溶液、SDS溶液、蒸馏水和POD混合的混合溶液。 进一步地，孵育液通过以下方法配制：将100mL的20×SSC溶液和10mL的10％SDS溶 液混合，再用蒸馏水定容至1000mL，制得A液，将A液和POD按体积比为2000:1混合，制得孵育 液。 进一步地，显色液为柠檬酸钠缓冲溶液、TMB和H2O2混合的混合溶液。 进一步地，显色液为将pH 5.4，0.1M柠檬酸钠缓冲溶液、TMB和30％H2O2按体积比为 19:1:0.002混合的混合液。 本发明提供的用于检测母体血液中胎儿游离DNA β-地中海贫血突变的试剂盒，具 有以下有益效果： 本发明试剂盒中的捕获探针是一种针对中国人最常见的19中突变型β-地中海贫 5 CN 111593119 A 说 明 书 3/7 页 血，反向斑点杂交检测结果显示该探针能同时检测95％中国人群的β-地中海贫血突变类 型，而且检测探针是针对cffDNA与母体cfDNA HBG2启动子区的甲基化差异而设计的，能特 异性结合cffDNA，因此此检测方法不受胎儿性别的影响，从而保证了此检测方法应用的广 泛性。该试剂盒利用了斑点杂交，该方法使用了DNA杂交过程来检测产物，具有操作简单、快 速简便、样品用量少、结果直观可靠等优点，可在无创产前诊断中广泛用于母体血浆中胎儿 游离DNAβ-地中海贫血突变的检测。
