技术摘要：
本发明公开鉴别杜仲性别的引物、片段及方法，所述片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述引物对的核苷酸序列从5’‑3’如SEQ ID NO.2～3所示。本发明提供了一种新的用于杜仲苗期识别其性别的片段MSL4，其长度为479bp；所述MSL4在杜仲两个独立群体中均被发现，表明杜 全部
背景技术：
杜仲是杜仲科的唯一物种，是中国南部和中部特有的一种雌雄异株的重要经济树 种。它是一种著名的第三纪孑遗植物，两千多年来在我国作为药用植物被广泛栽培。近年 来，杜仲胶(反式-1，4-聚异戊二烯)的高产引起了越来越多的关注，这种树种也被称为硬橡 胶树。由于其在亚热带和温带地区的广泛适应性，杜仲有可能取代通常所知的橡胶树(大戟 科)，该树只在热带地区生长。但是，杜仲的生育周期长(最长可达8-10年)，雌雄异株，无法 在早期鉴定其性别，这极大地限制了杜仲的育种效率、产量以及其他研究。 我们都知道雌雄异株代表性别在个体上的分离，包括我们人类在内的绝大多数哺 乳动物均具有雄性和雌性之分。大约6％的开花植物，即175个科的987个属中有15,600个种 是雌雄异株。一般来说，雌雄异株植物有三种通过性染色体确定性别的系统：XY、ZW和XO。XY 型系统中的雄性是异配子(XY)，雌性是同配子(XX) ,例如猕猴桃、芦笋、番木瓜和白花蝇子 草。ZW型系统以雌性异配子(ZW)和雄性同配子(ZZ)为特征，如毛果杨。其他一些物种，如酸 模，进化出XO性别决定系统，其中个体的性别由X所占比率决定。到目前为止，通过可靠的细 胞遗传学或分子证据只找出39种植物为异型染色体。雌雄异株杜仲是二倍体，基本组成为 2n＝34条染色体，基因组大小约为1.2Gb。尽管如此，我们仍然无法确定杜仲性别决定机制 和异型性染色体，利用核型鉴定杜仲苗期的性别既困难又不可靠。此外，随着基因组学的出 现，一些植物中的性别决定基因逐渐被发现。一个雄性特异的MADS-box APETALA3-like基 因被证实可能参与了杜仲的性别决定。然而，杜仲的性别决定机制仍不清楚。 雌雄异株植物的形态和生理差异已被报道。杜仲胶的产量在雌雄株的叶子之间表 现出显著的性二态性。在叶、树皮、根、果实和种子中，果实的杜仲胶含量最高[7]。在杜仲园 中，雄性杜仲树的最佳占比为6-8％。因此，必须开发一种简单、准确的方法来鉴定杜仲的性 别，以便在早期就能实现最佳雌雄配比，获得最高的经济价值。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明的目的是提供一种性别特异性DNA标记，以鉴定杜仲苗期的 性别的方法。 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：用于鉴定杜仲性别的片段，所述片段 的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 本发明通过ddRAD-seq得到了一个新的用于鉴别杜仲性别的特异性片段，所述片 段仅在雄性个体中出现，且在不同群体中高度保守；所述片段命名为MSL4，可用于鉴定杜仲 性别。 本发明还要求保护所述片段在鉴别杜仲性别的应用。 进一步地，本发明还要求保护用于鉴别杜仲性别的引物对，所述引物对为根据如 3 CN 111549162 A 说 明 书 2/4 页 SEQ ID NO.1所述片段的核苷酸序列设计得到。 引物对为根据如SEQ ID NO.1所述片段核苷酸序列设计得到，对应产物大小不大 于所述SEQ ID NO.1片段，并可通过本领域常规手段(包括PCR、电泳、产物序列比对等)即可 快速验证相关的引物特异性；选择特异性高的引物对用于鉴别杜仲性别。 作为本发明的优选实施方式，所述引物对的核苷酸序列从5’-3’如SEQ ID NO.2～ 3所示。 本发明还公开了用于鉴别杜仲性别的方法，包括如下步骤：使用设计的引物对对 待测样本基因组DNA进行PCR扩增，并检测扩增产物；若PCR产物电泳结果与预测一致，则待 测样本为雄株，否则为雌株。 作为本发明的优选实施方式，所述PCR扩增的反应体系为：12.5μL PCR反应液，25M 引物2.0μL，50ng基因组DNA，ddH2O补足25μL。 作为本发明的优选实施方式，使用如SEQ ID NO.2～3所示的引物对进行PCR扩增， 所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min， 变性、退火、延伸共进行30个循环；72℃终延伸5min。 PCR的扩增反应程序按照本领域常规手段，根据设计的引物，对退火温度、延伸时 间等进行调整。 所述PCR扩增，所述检测扩增产物的方法为电泳。 使用如SEQ ID NO.2～3所示的引物对进行PCR扩增，产物大小为479bp。 本发明还要求保护所述引物对在鉴别杜仲性别的应用。 本发明还提供了一种用于检测鉴别杜仲性别的试剂盒，所述试剂盒包括所述引物 对。 本发明提供了一种新的用于杜仲苗期识别其性别的片段MSL4，其长度为479bp；所 述MSL4在杜仲两个独立群体中均被发现，表明杜仲的性别可能是由基因决定的；这个479bp 的雄性特异性位点似乎暗示其在性染色体上的位置，这表明杜仲可能有一个XX/XY性别决 定系统。进一步地，本发明还提供了用于快速识别杜仲苗期性别的相关PCR引物对及鉴别方 法，所述方法简单、快速，对杜仲性别的识别具有重要的应用前景，对缩短杜仲的育种周期、 加快其杜仲胶商业生产有重要价值。 附图说明 图1为杜仲雄株(♂)和雌株(♀)花部特征。 图2为使用MSL1、MSL2、MSL3和MSL5对应引物对进行PCR扩增的产物电泳结果。 图3为使用MSL4对应引物对进行PCR扩增的产物电泳结果。 图4为使用MSL4对应引物对进行PCR扩增的产物sanger测序结果。
本发明公开鉴别杜仲性别的引物、片段及方法，所述片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述引物对的核苷酸序列从5’‑3’如SEQ ID NO.2～3所示。本发明提供了一种新的用于杜仲苗期识别其性别的片段MSL4，其长度为479bp；所述MSL4在杜仲两个独立群体中均被发现，表明杜 全部
背景技术：
杜仲是杜仲科的唯一物种，是中国南部和中部特有的一种雌雄异株的重要经济树 种。它是一种著名的第三纪孑遗植物，两千多年来在我国作为药用植物被广泛栽培。近年 来，杜仲胶(反式-1，4-聚异戊二烯)的高产引起了越来越多的关注，这种树种也被称为硬橡 胶树。由于其在亚热带和温带地区的广泛适应性，杜仲有可能取代通常所知的橡胶树(大戟 科)，该树只在热带地区生长。但是，杜仲的生育周期长(最长可达8-10年)，雌雄异株，无法 在早期鉴定其性别，这极大地限制了杜仲的育种效率、产量以及其他研究。 我们都知道雌雄异株代表性别在个体上的分离，包括我们人类在内的绝大多数哺 乳动物均具有雄性和雌性之分。大约6％的开花植物，即175个科的987个属中有15,600个种 是雌雄异株。一般来说，雌雄异株植物有三种通过性染色体确定性别的系统：XY、ZW和XO。XY 型系统中的雄性是异配子(XY)，雌性是同配子(XX) ,例如猕猴桃、芦笋、番木瓜和白花蝇子 草。ZW型系统以雌性异配子(ZW)和雄性同配子(ZZ)为特征，如毛果杨。其他一些物种，如酸 模，进化出XO性别决定系统，其中个体的性别由X所占比率决定。到目前为止，通过可靠的细 胞遗传学或分子证据只找出39种植物为异型染色体。雌雄异株杜仲是二倍体，基本组成为 2n＝34条染色体，基因组大小约为1.2Gb。尽管如此，我们仍然无法确定杜仲性别决定机制 和异型性染色体，利用核型鉴定杜仲苗期的性别既困难又不可靠。此外，随着基因组学的出 现，一些植物中的性别决定基因逐渐被发现。一个雄性特异的MADS-box APETALA3-like基 因被证实可能参与了杜仲的性别决定。然而，杜仲的性别决定机制仍不清楚。 雌雄异株植物的形态和生理差异已被报道。杜仲胶的产量在雌雄株的叶子之间表 现出显著的性二态性。在叶、树皮、根、果实和种子中，果实的杜仲胶含量最高[7]。在杜仲园 中，雄性杜仲树的最佳占比为6-8％。因此，必须开发一种简单、准确的方法来鉴定杜仲的性 别，以便在早期就能实现最佳雌雄配比，获得最高的经济价值。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明的目的是提供一种性别特异性DNA标记，以鉴定杜仲苗期的 性别的方法。 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：用于鉴定杜仲性别的片段，所述片段 的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 本发明通过ddRAD-seq得到了一个新的用于鉴别杜仲性别的特异性片段，所述片 段仅在雄性个体中出现，且在不同群体中高度保守；所述片段命名为MSL4，可用于鉴定杜仲 性别。 本发明还要求保护所述片段在鉴别杜仲性别的应用。 进一步地，本发明还要求保护用于鉴别杜仲性别的引物对，所述引物对为根据如 3 CN 111549162 A 说 明 书 2/4 页 SEQ ID NO.1所述片段的核苷酸序列设计得到。 引物对为根据如SEQ ID NO.1所述片段核苷酸序列设计得到，对应产物大小不大 于所述SEQ ID NO.1片段，并可通过本领域常规手段(包括PCR、电泳、产物序列比对等)即可 快速验证相关的引物特异性；选择特异性高的引物对用于鉴别杜仲性别。 作为本发明的优选实施方式，所述引物对的核苷酸序列从5’-3’如SEQ ID NO.2～ 3所示。 本发明还公开了用于鉴别杜仲性别的方法，包括如下步骤：使用设计的引物对对 待测样本基因组DNA进行PCR扩增，并检测扩增产物；若PCR产物电泳结果与预测一致，则待 测样本为雄株，否则为雌株。 作为本发明的优选实施方式，所述PCR扩增的反应体系为：12.5μL PCR反应液，25M 引物2.0μL，50ng基因组DNA，ddH2O补足25μL。 作为本发明的优选实施方式，使用如SEQ ID NO.2～3所示的引物对进行PCR扩增， 所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min， 变性、退火、延伸共进行30个循环；72℃终延伸5min。 PCR的扩增反应程序按照本领域常规手段，根据设计的引物，对退火温度、延伸时 间等进行调整。 所述PCR扩增，所述检测扩增产物的方法为电泳。 使用如SEQ ID NO.2～3所示的引物对进行PCR扩增，产物大小为479bp。 本发明还要求保护所述引物对在鉴别杜仲性别的应用。 本发明还提供了一种用于检测鉴别杜仲性别的试剂盒，所述试剂盒包括所述引物 对。 本发明提供了一种新的用于杜仲苗期识别其性别的片段MSL4，其长度为479bp；所 述MSL4在杜仲两个独立群体中均被发现，表明杜仲的性别可能是由基因决定的；这个479bp 的雄性特异性位点似乎暗示其在性染色体上的位置，这表明杜仲可能有一个XX/XY性别决 定系统。进一步地，本发明还提供了用于快速识别杜仲苗期性别的相关PCR引物对及鉴别方 法，所述方法简单、快速，对杜仲性别的识别具有重要的应用前景，对缩短杜仲的育种周期、 加快其杜仲胶商业生产有重要价值。 附图说明 图1为杜仲雄株(♂)和雌株(♀)花部特征。 图2为使用MSL1、MSL2、MSL3和MSL5对应引物对进行PCR扩增的产物电泳结果。 图3为使用MSL4对应引物对进行PCR扩增的产物电泳结果。 图4为使用MSL4对应引物对进行PCR扩增的产物sanger测序结果。
