技术摘要：
本发明提供一种鱼安定半抗原、人工抗原、抗体及其制备与应用。鱼安定半抗原具有式I所示的分子结构（式I），鱼安定人工抗原具有式II所示的分子结构（式II）。目前有关于鱼安定半抗原及人工抗原合成也鲜有报道，与其相关免疫检测方法也较少，而现有的鱼安定检测技术主要 全部
背景技术：
随着人们对食品安全的关注及诉求日益增加，食品中的药物的残留已经成为了一 个社会热点问题。鱼安定作为渔用麻醉剂可使鱼体内代谢强度降低，使鱼行动迟缓，进入类 似休眠状态，从而防止鱼在容器中剧烈运动而造成伤害，降低鱼类在长途运输过程中的死 亡率，减少经济损失。由于具有易溶于水、见效快、复苏时间短等优点，鱼安定目前广泛用作 流通环节的鱼体麻醉剂，也是目前唯一被美国食品药物管理局批准能用于食用鱼的麻醉 剂。除美国，还有欧盟、加拿大等国家也都允许鱼安定作为鱼用麻醉剂，但是美国限定其休 药期为 21d，最大残留量(MRL)为 1 μg/mL，加拿大休药期为5d，都有着严格的使用标准。因 此，建立快速检测准确检测水产品中鱼安定残留水平的分析方法，对规范鱼安定使用，保障 水产品安全意义重大。 目前，鱼安定的监测，主要依赖仪器分析方法，如高效液相色谱法-串联质谱法、液 相色谱-串联质谱法、液相色谱法。这些方法虽然检测结果准确可靠，但是依赖昂贵仪器，不 仅费时费力，且操作要求高，不适宜大批量的快速筛选，因此，需发明一种针对鱼安定的快 速、简便的检测方法。基于抗原-抗体特异性结合的免疫分析法具有样品前处理简便、操作 简单、快速、灵敏、检测成本低等特点，被誉为是21世纪最具竞争和挑战的快速检测技术，在 食品安全领域具有广阔的应用前景。目前尚未见有关鱼安定免疫检测研究报道。
技术实现要素：
本发明针对现有技术中鱼安定检测的不足，提供了一种鱼安定的半抗原及其相应 的人工抗原和抗体及其制备方法。 本发明的另一目的在于提供了所述半抗原、人工抗原和抗体的应用。 本发明的另一目的在于提供一种检测鱼安定的免疫分析方法。 本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。 第一方面，一种鱼安定半抗原，其具有如下式I的分子结构： 4 CN 111592468 A 说 明 书 2/6 页 式I。 上述鱼安定半抗原的制备方法，包括如下步骤：将鱼安定与具对醛基苯甲酸在甲 醇中发生缩合反应后，经硼氢化钠还原后得到如式I分子结构的鱼安定半抗原。 具体地，所述鱼安定半抗原的制备方法，包括如下步骤： S11. 将鱼安定溶于适量的甲醇中； S12. 待S11溶解后加入1~2mL三乙胺； S13. 将与S11等摩尔比的苯醛酸在适量甲醇中溶解后，搅拌条件下缓慢滴加到S1中； S14. 在80℃下冷凝回流反应2-3h； S15. 加入0.12~0.2 g硼氢化钠还原，50℃冷凝回流1-2h； S16. 旋转蒸发干后得到黄色油状物质，水溶后用乙酸乙酯萃取3次，再将乙酸乙酯萃 取液旋干，得到淡黄色粉末； S17. 将上述淡黄色粉末过硅胶柱，石油醚:乙酸乙酯=3:1洗脱，然后蒸干所得即为如 式I所示的鱼安定半抗原。 第二方面，一种鱼安定的人工抗原，其具有如下的分子结构： 式II 其中，载体蛋白为牛血清白蛋白或鸡卵清白蛋白。 本发明保留了鱼安定的空间结构，其半抗原在原有分子的基础上衍生出一个含苯 甲酸结构的手臂，本发明的抗原进行动物免疫后可得到优质、高效的抗体。 由于鱼安定本身的限量标准较少，有关于其半抗原及人工抗原合成也鲜有报道， 与其相关免疫检测方法也较少，而现有的鱼安定检测技术主要以仪器法为主，而仪器法操 作复杂，前处理要求高，成本高。利用本发明的人工抗原免疫动物得到的抗血清的效价可达 4K，最低检测限为28.68 ng/mL，半抑制浓度为337.84ng/mL，所述抗体具有特异性高、灵敏 度好、准确度高等显著优点。 所述鱼安定人工抗原的制备方法为碳二亚胺法，优选地，包括如下步骤： S21 . 分别将100~140 mg的上述鱼安定半抗原溶解于0.2~1mL N ,N-二甲基甲酰胺 （DMF）获得溶液①和溶液②； S22. 将蛋白（50 mg BSA、50 mg OVA）分别溶于10mL的0 .01M PBS缓冲液中获得BSA的 PBS溶液和OVA的PBS溶液；在搅拌下分别将S21制得的溶液①、溶液②滴加到BSA的PBS溶液、 OVA-PBS溶液中，磁力搅拌10min； S23. 在S22得到的溶液中分别加入1.2~1.5倍于鱼安定半抗原摩尔质量的1-(3-二甲 氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），室温避光反应过夜； S24. 待S23溶液反应完成后，用PBS透析，得到如式II所示的鱼安定人工抗原。 作为本发明提供的所述鱼安定人工抗原的制备方法的一种实施改进方式，所述 5 CN 111592468 A 说 明 书 3/6 页 PBS缓冲液的pH值为7.4～8.0。 作为本发明提供的所述鱼安定人工抗原的制备方法的一种实施改进方式，所述蛋 白为牛血清白蛋白或鸡卵清白蛋白。 第三方面，一种抗体，其由所述鱼安定人工抗原制备得到。所述抗体可以是单克隆 抗体、多克隆抗体或基因工程抗体。 第四方面，所述人工抗原或所述抗体在鱼安定免疫检测分析中的应用。 优选地，免疫原用载体蛋白为牛血清白蛋白的人工抗原，包被原用载体蛋白为鸡 卵清白蛋白的人工抗原。 第五方面，一种直接检测鱼安定的免疫分析方法，其包括如下步骤： S31.将上述鱼安定人工抗原免疫动物制备鱼安定的多克隆抗体，其中载体蛋白为牛血 清白蛋白； S32.将鱼安定人工抗原作为包被原包被在微孔板上，其中载体蛋白为鸡卵清白蛋白， 然后将步骤S31制备得到鱼安定的多克隆抗体加入微孔板中； S33.加入待测样品，采用竞争ELISA测定待测样品中鱼安定的含量。 与现有技术相比，本发明有益效果在于： 利用本发明的人工抗原免疫动物得到的抗血清的效价可达1:4000，最低检测为 8.68ng/mL，半抑制浓度为337.84ng/mL，所述抗体具有特异性高、灵敏度好、准确度高、检测 速度快等显著优点，因此本发明提供的抗原和抗体，可用于建立鱼安定的酶联免疫吸附分 析技术，从而用于快速检测食品中残留的鱼安定，具有广阔的应用前景。 附图说明 图1为鱼安定半抗原质谱鉴定图。 图2为鱼安定半抗原及其免疫抗原、载体蛋白紫外扫描图。 图3为半抗原所制备抗体对鱼安定的抑制曲线。
本发明提供一种鱼安定半抗原、人工抗原、抗体及其制备与应用。鱼安定半抗原具有式I所示的分子结构（式I），鱼安定人工抗原具有式II所示的分子结构（式II）。目前有关于鱼安定半抗原及人工抗原合成也鲜有报道，与其相关免疫检测方法也较少，而现有的鱼安定检测技术主要 全部
背景技术：
随着人们对食品安全的关注及诉求日益增加，食品中的药物的残留已经成为了一 个社会热点问题。鱼安定作为渔用麻醉剂可使鱼体内代谢强度降低，使鱼行动迟缓，进入类 似休眠状态，从而防止鱼在容器中剧烈运动而造成伤害，降低鱼类在长途运输过程中的死 亡率，减少经济损失。由于具有易溶于水、见效快、复苏时间短等优点，鱼安定目前广泛用作 流通环节的鱼体麻醉剂，也是目前唯一被美国食品药物管理局批准能用于食用鱼的麻醉 剂。除美国，还有欧盟、加拿大等国家也都允许鱼安定作为鱼用麻醉剂，但是美国限定其休 药期为 21d，最大残留量(MRL)为 1 μg/mL，加拿大休药期为5d，都有着严格的使用标准。因 此，建立快速检测准确检测水产品中鱼安定残留水平的分析方法，对规范鱼安定使用，保障 水产品安全意义重大。 目前，鱼安定的监测，主要依赖仪器分析方法，如高效液相色谱法-串联质谱法、液 相色谱-串联质谱法、液相色谱法。这些方法虽然检测结果准确可靠，但是依赖昂贵仪器，不 仅费时费力，且操作要求高，不适宜大批量的快速筛选，因此，需发明一种针对鱼安定的快 速、简便的检测方法。基于抗原-抗体特异性结合的免疫分析法具有样品前处理简便、操作 简单、快速、灵敏、检测成本低等特点，被誉为是21世纪最具竞争和挑战的快速检测技术，在 食品安全领域具有广阔的应用前景。目前尚未见有关鱼安定免疫检测研究报道。
技术实现要素：
本发明针对现有技术中鱼安定检测的不足，提供了一种鱼安定的半抗原及其相应 的人工抗原和抗体及其制备方法。 本发明的另一目的在于提供了所述半抗原、人工抗原和抗体的应用。 本发明的另一目的在于提供一种检测鱼安定的免疫分析方法。 本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。 第一方面，一种鱼安定半抗原，其具有如下式I的分子结构： 4 CN 111592468 A 说 明 书 2/6 页 式I。 上述鱼安定半抗原的制备方法，包括如下步骤：将鱼安定与具对醛基苯甲酸在甲 醇中发生缩合反应后，经硼氢化钠还原后得到如式I分子结构的鱼安定半抗原。 具体地，所述鱼安定半抗原的制备方法，包括如下步骤： S11. 将鱼安定溶于适量的甲醇中； S12. 待S11溶解后加入1~2mL三乙胺； S13. 将与S11等摩尔比的苯醛酸在适量甲醇中溶解后，搅拌条件下缓慢滴加到S1中； S14. 在80℃下冷凝回流反应2-3h； S15. 加入0.12~0.2 g硼氢化钠还原，50℃冷凝回流1-2h； S16. 旋转蒸发干后得到黄色油状物质，水溶后用乙酸乙酯萃取3次，再将乙酸乙酯萃 取液旋干，得到淡黄色粉末； S17. 将上述淡黄色粉末过硅胶柱，石油醚:乙酸乙酯=3:1洗脱，然后蒸干所得即为如 式I所示的鱼安定半抗原。 第二方面，一种鱼安定的人工抗原，其具有如下的分子结构： 式II 其中，载体蛋白为牛血清白蛋白或鸡卵清白蛋白。 本发明保留了鱼安定的空间结构，其半抗原在原有分子的基础上衍生出一个含苯 甲酸结构的手臂，本发明的抗原进行动物免疫后可得到优质、高效的抗体。 由于鱼安定本身的限量标准较少，有关于其半抗原及人工抗原合成也鲜有报道， 与其相关免疫检测方法也较少，而现有的鱼安定检测技术主要以仪器法为主，而仪器法操 作复杂，前处理要求高，成本高。利用本发明的人工抗原免疫动物得到的抗血清的效价可达 4K，最低检测限为28.68 ng/mL，半抑制浓度为337.84ng/mL，所述抗体具有特异性高、灵敏 度好、准确度高等显著优点。 所述鱼安定人工抗原的制备方法为碳二亚胺法，优选地，包括如下步骤： S21 . 分别将100~140 mg的上述鱼安定半抗原溶解于0.2~1mL N ,N-二甲基甲酰胺 （DMF）获得溶液①和溶液②； S22. 将蛋白（50 mg BSA、50 mg OVA）分别溶于10mL的0 .01M PBS缓冲液中获得BSA的 PBS溶液和OVA的PBS溶液；在搅拌下分别将S21制得的溶液①、溶液②滴加到BSA的PBS溶液、 OVA-PBS溶液中，磁力搅拌10min； S23. 在S22得到的溶液中分别加入1.2~1.5倍于鱼安定半抗原摩尔质量的1-(3-二甲 氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），室温避光反应过夜； S24. 待S23溶液反应完成后，用PBS透析，得到如式II所示的鱼安定人工抗原。 作为本发明提供的所述鱼安定人工抗原的制备方法的一种实施改进方式，所述 5 CN 111592468 A 说 明 书 3/6 页 PBS缓冲液的pH值为7.4～8.0。 作为本发明提供的所述鱼安定人工抗原的制备方法的一种实施改进方式，所述蛋 白为牛血清白蛋白或鸡卵清白蛋白。 第三方面，一种抗体，其由所述鱼安定人工抗原制备得到。所述抗体可以是单克隆 抗体、多克隆抗体或基因工程抗体。 第四方面，所述人工抗原或所述抗体在鱼安定免疫检测分析中的应用。 优选地，免疫原用载体蛋白为牛血清白蛋白的人工抗原，包被原用载体蛋白为鸡 卵清白蛋白的人工抗原。 第五方面，一种直接检测鱼安定的免疫分析方法，其包括如下步骤： S31.将上述鱼安定人工抗原免疫动物制备鱼安定的多克隆抗体，其中载体蛋白为牛血 清白蛋白； S32.将鱼安定人工抗原作为包被原包被在微孔板上，其中载体蛋白为鸡卵清白蛋白， 然后将步骤S31制备得到鱼安定的多克隆抗体加入微孔板中； S33.加入待测样品，采用竞争ELISA测定待测样品中鱼安定的含量。 与现有技术相比，本发明有益效果在于： 利用本发明的人工抗原免疫动物得到的抗血清的效价可达1:4000，最低检测为 8.68ng/mL，半抑制浓度为337.84ng/mL，所述抗体具有特异性高、灵敏度好、准确度高、检测 速度快等显著优点，因此本发明提供的抗原和抗体，可用于建立鱼安定的酶联免疫吸附分 析技术，从而用于快速检测食品中残留的鱼安定，具有广阔的应用前景。 附图说明 图1为鱼安定半抗原质谱鉴定图。 图2为鱼安定半抗原及其免疫抗原、载体蛋白紫外扫描图。 图3为半抗原所制备抗体对鱼安定的抑制曲线。
