技术摘要：
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种用于人类真菌感染检测的引物探针系统、试剂盒及检测方法。首先，本发明公开了一种可同时检测多种肺部真菌感染的引物探针系统，包括如SEQ ID N0：1‑17所示的核苷酸序列组。还公开了包括该引物探针系统的试剂盒，以及使用该引物探 全部
背景技术：
侵袭性肺部真菌感染(invasivepulmonaryfungal infection，IPFI)指不包括真 菌寄生和过敏所致的支气管肺部真菌感染，占深部真菌感染的首位。引起肺真菌病的真菌 包括曲霉菌、念珠菌、隐球菌、毛霉菌、肺孢子菌等。由于肺部真菌感染临床表现常无特异 性，早期诊断困难，病情易被原发病掩盖，易造成误诊、漏诊。未经及时治疗的IPFI患者的病 死率可高达30％～80％。 肺真菌感染的常见诊断方法有：病理学检查、微生物学检测、血清学检测、影像学 检查、磁共振法等。目前，病理学检查是临床实验室检测真菌感染的“金标准”。但常常由于 它的有创性使其应用受限，且耗时较长(3-7天)，容易延误诊治。 目前，市场上很少有针对肺部真菌感染病例的直接鉴定方法或者试剂盒，且现有 的试剂盒大都基于血培养获得的菌株，再进一步通过PCR、质谱等方法再鉴定，步骤繁琐。而 且针对真菌感染患者的肺泡灌洗液样本直接鉴定的方法中，其检测灵敏度均达不到临床级 别的要求，需要肺泡灌洗液样本预培养。国外虽然有针对特定真菌感染检测的试剂盒，但大 都都是基于qRT-PCR平台，且检测菌种单一，不能同时检测多种真菌。
技术实现要素：
为了解决上述现有的技术问题，本发明公开了一种用于人类肺部真菌感染检测的 引物探针系统、试剂盒及检测方法。 本发明原理在于：利用临床患者肺泡灌洗液样本，获取游离核酸样本，通过特异性 的引物探针对检测模板中的核酸片段，确定临床样本的检测结果，另外根据数字PCR检测平 台的低拷贝量化性能，可有效评估临床样本中菌体核酸的片段拷贝数变化(即随着临床患 者体内菌体含量的变化，菌体核酸片段也随之浮动变化)，对临床治疗方案可以实施评估， 指示临床治疗效果，防止临床过度治疗，也可以阻止超级耐药真菌的产生。 具体的，本发明的技术方案如下： 本发明第一个方面公开了一种可同时检测多种真菌感染的引物探针系统，包括： 用于检测耶氏肺孢子菌的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：1-3 和/ 或SEQ ID N0：4-6所示； 用于检测毛霉属的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：7-8和SEQ ID N0：9-11所示； 用于检测新型隐球菌的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：12-13 和 SEQ ID N0：14所示； 用于检测曲霉属的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：15-16和 SEQ 3 CN 111607658 A 说 明 书 2/5 页 ID N0：17所示。 本发明第二个方面公开了由上述的引物探针系统制备的可同时检测多种真菌感 染的产品。 优选的，所述产品为试剂盒。 本发明第三个方面公开了一种检测真菌感染的方法，所述方法使用引物探针系统 对真菌进行检测。 优选的，所述方法包括： 富集待测样本中的游离核酸片段后，使用引物探针系统，用数字PCR技术进行检 测。 优选的，所述真菌包括耶氏肺孢子菌、曲霉属、新型隐球菌和毛霉属。 应当理解，该检测方法的检测真菌并不限于耶氏肺孢子菌、曲霉属、新型隐球菌和 毛霉属。 优选的，所述数字PCR技术包括以下步骤： (1)提取样本核酸； (2)配置数字PCR反应液； (3)制备液滴芯片； (4)运行液滴芯片扩增程序后，采用生物芯片阅读仪进行分析后报告输出。 需要强调的是，根据本发明的教导，本领域技术人员有能力选择合适的方法，而不 限于如上描述的方案。 更优选的，所述数字PCR技术为多种数字PCR技术。 术语“多重数字PCR”是指在同一数字PCR反应体系里加上两对或两对以上引物，同 时扩增出多个核酸片段的数字PCR反应。将多重PCR技术与数字PCR技术有机结合而形成的 多重数字PCR，根据DNA探针不同荧光度、DNA扩增不同循环数及多种标记荧光同时使用，便 可大幅提高数字PCR多重性，多重性可达 20-50以上，即同时在一个PCR反应单元内进行20- 50个以上的数字PCR反应。 更优选的，所述样本采集于患者的肺泡灌洗液。 更优选的，所述扩增程序包括：95℃预变性5min；95℃变性15秒，60℃退火 30秒， 循环40次。在本发明的一些具体实施例中，扩增程序的反应时间大约为1 小时。 本发明第四个方面公开了上述的引物探针系统、上述的产品或上述的方法在临床 领域中的应用。 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构 思与保护范围。 本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果： 1.本发明创新性地利用临床患者的肺泡灌洗液，检测周期缩短至3-4小时，可快速 鉴定样本的致病菌株，保证临床第一时间获得针对性的治疗方案。 2.本发明利用数字PCR平台对菌体核酸片段拷贝数进行实时定量检测，达到临床 治疗方案效果优劣实时评估，防止临床过度治疗。 3 .本发明利用数字PCR技术，具有高效灵敏、准确快速、操作简便、成本低廉的特 点，可检测低拷贝的核酸样本且能够定量检测。 4 CN 111607658 A 说 明 书 3/5 页
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种用于人类真菌感染检测的引物探针系统、试剂盒及检测方法。首先，本发明公开了一种可同时检测多种肺部真菌感染的引物探针系统，包括如SEQ ID N0：1‑17所示的核苷酸序列组。还公开了包括该引物探针系统的试剂盒，以及使用该引物探 全部
背景技术：
侵袭性肺部真菌感染(invasivepulmonaryfungal infection，IPFI)指不包括真 菌寄生和过敏所致的支气管肺部真菌感染，占深部真菌感染的首位。引起肺真菌病的真菌 包括曲霉菌、念珠菌、隐球菌、毛霉菌、肺孢子菌等。由于肺部真菌感染临床表现常无特异 性，早期诊断困难，病情易被原发病掩盖，易造成误诊、漏诊。未经及时治疗的IPFI患者的病 死率可高达30％～80％。 肺真菌感染的常见诊断方法有：病理学检查、微生物学检测、血清学检测、影像学 检查、磁共振法等。目前，病理学检查是临床实验室检测真菌感染的“金标准”。但常常由于 它的有创性使其应用受限，且耗时较长(3-7天)，容易延误诊治。 目前，市场上很少有针对肺部真菌感染病例的直接鉴定方法或者试剂盒，且现有 的试剂盒大都基于血培养获得的菌株，再进一步通过PCR、质谱等方法再鉴定，步骤繁琐。而 且针对真菌感染患者的肺泡灌洗液样本直接鉴定的方法中，其检测灵敏度均达不到临床级 别的要求，需要肺泡灌洗液样本预培养。国外虽然有针对特定真菌感染检测的试剂盒，但大 都都是基于qRT-PCR平台，且检测菌种单一，不能同时检测多种真菌。
技术实现要素：
为了解决上述现有的技术问题，本发明公开了一种用于人类肺部真菌感染检测的 引物探针系统、试剂盒及检测方法。 本发明原理在于：利用临床患者肺泡灌洗液样本，获取游离核酸样本，通过特异性 的引物探针对检测模板中的核酸片段，确定临床样本的检测结果，另外根据数字PCR检测平 台的低拷贝量化性能，可有效评估临床样本中菌体核酸的片段拷贝数变化(即随着临床患 者体内菌体含量的变化，菌体核酸片段也随之浮动变化)，对临床治疗方案可以实施评估， 指示临床治疗效果，防止临床过度治疗，也可以阻止超级耐药真菌的产生。 具体的，本发明的技术方案如下： 本发明第一个方面公开了一种可同时检测多种真菌感染的引物探针系统，包括： 用于检测耶氏肺孢子菌的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：1-3 和/ 或SEQ ID N0：4-6所示； 用于检测毛霉属的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：7-8和SEQ ID N0：9-11所示； 用于检测新型隐球菌的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：12-13 和 SEQ ID N0：14所示； 用于检测曲霉属的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：15-16和 SEQ 3 CN 111607658 A 说 明 书 2/5 页 ID N0：17所示。 本发明第二个方面公开了由上述的引物探针系统制备的可同时检测多种真菌感 染的产品。 优选的，所述产品为试剂盒。 本发明第三个方面公开了一种检测真菌感染的方法，所述方法使用引物探针系统 对真菌进行检测。 优选的，所述方法包括： 富集待测样本中的游离核酸片段后，使用引物探针系统，用数字PCR技术进行检 测。 优选的，所述真菌包括耶氏肺孢子菌、曲霉属、新型隐球菌和毛霉属。 应当理解，该检测方法的检测真菌并不限于耶氏肺孢子菌、曲霉属、新型隐球菌和 毛霉属。 优选的，所述数字PCR技术包括以下步骤： (1)提取样本核酸； (2)配置数字PCR反应液； (3)制备液滴芯片； (4)运行液滴芯片扩增程序后，采用生物芯片阅读仪进行分析后报告输出。 需要强调的是，根据本发明的教导，本领域技术人员有能力选择合适的方法，而不 限于如上描述的方案。 更优选的，所述数字PCR技术为多种数字PCR技术。 术语“多重数字PCR”是指在同一数字PCR反应体系里加上两对或两对以上引物，同 时扩增出多个核酸片段的数字PCR反应。将多重PCR技术与数字PCR技术有机结合而形成的 多重数字PCR，根据DNA探针不同荧光度、DNA扩增不同循环数及多种标记荧光同时使用，便 可大幅提高数字PCR多重性，多重性可达 20-50以上，即同时在一个PCR反应单元内进行20- 50个以上的数字PCR反应。 更优选的，所述样本采集于患者的肺泡灌洗液。 更优选的，所述扩增程序包括：95℃预变性5min；95℃变性15秒，60℃退火 30秒， 循环40次。在本发明的一些具体实施例中，扩增程序的反应时间大约为1 小时。 本发明第四个方面公开了上述的引物探针系统、上述的产品或上述的方法在临床 领域中的应用。 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构 思与保护范围。 本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果： 1.本发明创新性地利用临床患者的肺泡灌洗液，检测周期缩短至3-4小时，可快速 鉴定样本的致病菌株，保证临床第一时间获得针对性的治疗方案。 2.本发明利用数字PCR平台对菌体核酸片段拷贝数进行实时定量检测，达到临床 治疗方案效果优劣实时评估，防止临床过度治疗。 3 .本发明利用数字PCR技术，具有高效灵敏、准确快速、操作简便、成本低廉的特 点，可检测低拷贝的核酸样本且能够定量检测。 4 CN 111607658 A 说 明 书 3/5 页
