技术摘要：
本发明公开了一种利用番茄雄性不育基因及可见连锁标记创制雄性不育系的方法。本发明克隆了新的番茄育性基因SlNP1，基于基因编辑技术可以快速精确的创制番茄稳定的SlNP1雄性不育系，且败育性彻底无其他不良性状的产生；通过双基因敲除连锁基因SlNP1和SlSGR1，使得雄性不 全部
背景技术：
番茄是全球消费最多的蔬菜之一，2017年产量1.82亿吨，价值超600亿美元。中 国 是世界上番茄栽培面积最大、生产总量最多的国家，年产量5000万吨以上。番茄是 严格的 闭花授粉作物，杂种优势明显，杂种优势是指在植物中两个遗传基础不同的品 种间或相近 物种间进行杂交，其杂交一代在生长势、生活力、适应性和产量等性状上 优于其双亲的现 象。杂种优势利用的关键在于发展和利用可以控制的授粉系统，以防 止自花授粉导致的自 交衰退。为了保证杂交种的纯度，必须使母本丧失雄性功能。目 前主要采取的方法有人工 或机械去雄、化学杀雄和采用雄性不育系做母本。人工去雄 是指在授粉期前人为的去除母 本的雄花，需耗费大量人力物力，对于番茄等严格自花 授粉的作物，则更加困难。机械去雄 和化学去雄对植物的正常生长影响较大。因此创 制雄性不育系可以降低成本、提高杂交种 纯度，对杂交育种有着重要的意义。 雄性不育包括细胞质不育和核不育，细胞质不育不稳定易受环境影响，因此创制 稳定的核不育系是雄性不育系的发展方向。随着分子生物学的发展，越来越多的核育 性基 因被克隆出来，包括Lat52(Twell et al.,1989)、Ps-2(Gorguet et al.,2009)、Style 2.1 (Chen et al.,2007)、Ms10-35(Jeong et al.,2014)、MPK20(Chen et al.,2018)、Ms15 (Cao et al.,2019)、PIF3(CN 109456979 A)、LAP3(CN 109207505 A)等，这些基 因大多数 没有被应用的原因包括：1)败育性不彻底，会导致杂交种不纯；2)没有有 效的保持系或可 区分不育系和保持系的简易方法。 可见标记是指通过肉眼或者简单的处理可以有效的和对照株系进行区分的表型， 包括叶片形状、叶片颜色、茎秆颜色、表皮绒毛、种子大小、种子绒毛等性状。连锁 可见标记 是指该标记与目标基因紧密连锁，后代可以通过可见标记间接的判断目标基 因的基因型。 第三代基因编辑(CRISPR/Cas9)是一项旨在对基因组进行定点修饰的新技术， 通 过人工构建的工程化核酸酶，对基因组目标区间序列特异性的识别与切割，产生双 链断 裂，并通过细胞内源的同源重组或非同源末端连接DNA损伤修复机制，可以在 细胞活体基 因组DNA序列中产生碱基缺失、插入、替换等修饰的技术(Hsuet et al., 2014)。基因编辑 技术理论上可对任意品种的任意基因进行操作，实现对核心亲本目标 性状的快速、精准改 良而不存在传统回交育种常见的连锁累赘等问题，基因编辑技术 还可以实现多基因同时 突变，从而大大提高了多性状聚合的效率。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种利用番茄雄性不育基因及可见连锁标记创制雄性不育 5 CN 111549057 A 说 明 书 2/10 页 系 的方法。 第一方面，本发明保护番茄雄性不育植株的制备方法，为方法A或方法B。 所述方法A包括如下步骤：降低或抑制番茄中SlNP1蛋白的活性和/或含量，得 到 雄性不育植物； 所述方法B包括如下步骤：沉默或抑制番茄中编码SlNP1蛋白的基因的表达或敲 除编码SlNP1蛋白的基因，得到雄性不育植物： 所述SlNP1蛋白是如下(A1)或(A2)或(A3)： (A1)由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (A2)来源于番茄且与(A1)具有98％以上同一性且与植物雄性育性相关的蛋 白 质； (A3)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或 缺失和/或添加且与植物雄性育性相关的蛋白质。 所述“降低或抑制番茄中SlNP1蛋白的活性和/或含量”为使SlNP1蛋白的氨基酸 残基发生移码突变或氨基酸翻译提前终止。 所述“沉默或抑制番茄中编码SlNP1蛋白的基因的表达或敲除编码SlNP1蛋白的 基因”，为突变目的植物中编码SlNP1蛋白的基因使番茄中编码SlNP1蛋白的基因表 达量降 低或使番茄中编码SlNP1蛋白的基因发生功能缺失；所述突变为纯合突变。 所述突变可采用基因编辑技术实现。所述基因编辑技术具体可为CRISPR/Cas9基 因编辑技术。所述CRISPR/Cas9基因编辑的靶序列具体可位于所述基因的外显子，更 具体 可为SEQ ID NO.1自5’端第966-988位。 所述突变具体可为在SEQ ID NO.1自5’端982位和983位碱基之间插入A。 第二方面，本发明保护番茄雄性不育植株的制备方法，为方法C或方法D。 所述方法C包括如下步骤：同时降低或抑制番茄中SlNP1蛋白和SlSGR1蛋白的 活 性和/或含量，得到雄性不育植物； 所述方法D包括如下步骤：同时沉默或抑制番茄中编码SlNP1蛋白的基因和编码 SlSGR1蛋白的基因的表达，或，同时敲除编码SlNP1蛋白的基因和编码SlSGR1蛋白 的基因， 得到雄性不育植物： 所述SlNP1蛋白为前文所述的SlNP1蛋白。 所述SlSGR1蛋白是如下(C1)或(C2)或(C3)： (C1)由SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (C2)来源于番茄且与(A1)具有98％以上同一性且与具有相同功能的蛋白质； (C3)将SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或 缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。 所述“同时降低或抑制番茄中SlNP1蛋白和SlSGR1蛋白的活性和/或含量”为使 SlNP1蛋白的氨基酸残基发生移码突变或氨基酸翻译提前终止且使SlSGR1蛋白的氨 基酸 残基发生移码突变或氨基酸翻译提前终止。 所述“同时沉默或抑制番茄中编码SlNP1蛋白的基因和编码SlSGR1蛋白的基因 的 表达，或，同时敲除编码SlNP1蛋白的基因和编码SlSGR1蛋白的基因”，为同时突 变番茄中 编码SlNP1蛋白的基因和编码SlSGR1蛋白的基因使番茄中编码SlNP1蛋白 的基因和编码 6 CN 111549057 A 说 明 书 3/10 页 SlSGR1蛋白的基因表达量降低或使番茄中编码编码SlNP1蛋白的基因 和编码SlSGR1蛋白 的基因发生功能缺失；所述突变为纯合突变。 所述突变可采用基因编辑技术实现。所述基因编辑技术具体可为CRISPR/Cas9基 因编辑技术。所述CRISPR/Cas9基因编辑的靶序列具体可位于所述基因的外显子。编 码 SlNP1蛋白的基因的靶序列可为SEQ ID NO.1自5’端第966-988位。编码SlSGR1 蛋白的基因 的靶序列可为SEQ ID NO.5。 所述突变具体可为在SEQ ID NO .1自5’端982位和983位碱基之间插入A且缺 失 SEQ ID NO.6自5’端第504位碱基。 第三方面，本发明保护番茄保持系的制备方法，包括如下步骤：突变目的植物中 编码SlNP1蛋白的基因使番茄中编码SlNP1蛋白的基因表达量降低或使番茄中编码 SlNP1 蛋白的基因发生功能缺失，得到番茄保持系；所述突变为杂合突变； 所述SlNP1蛋白为前文所述的SlNP1蛋白。 所述保持系为第一方面中所述方法制备的不育植株的保持系。 所述突变可采用基因编辑技术实现。所述基因编辑技术具体可为CRISPR/Cas9基 因编辑技术。所述CRISPR/Cas9基因编辑的靶序列具体可位于所述基因的外显子，更 具体 可为SEQ ID NO.1自5’端第966-988位。 所述突变具体可为在SEQ ID NO.1自5’端982位和983位碱基之间插入A。 第四方面，本发明保护番茄保持系的制备方法，包括如下步骤：同时突变番茄中 编码SlNP1蛋白的基因和编码SlSGR1蛋白的基因使番茄中编码SlNP1蛋白的基因和 编码 SlSGR1蛋白的基因表达量降低或使番茄中编码编码SlNP1蛋白的基因和编码 SlSGR1蛋白 的基因发生功能缺失，得到番茄保持系；所述突变为杂合突变； 所述SlNP1蛋白为前文所述的SlNP1蛋白。 所述SlSGR1蛋白为前文所述的SlSGR1蛋白。 所述保持系为第二方面中所述方法制备的不育植株的保持系。 所述突变可采用基因编辑技术实现。所述基因编辑技术具体可为CRISPR/Cas9基 因编辑技术。所述CRISPR/Cas9基因编辑的靶序列具体可位于所述基因的外显子。编 码 SlNP1蛋白的基因的靶序列可为SEQ ID NO.1自5’端第966-988位。编码SlSGR1 蛋白的基因 的靶序列可为SEQ ID NO.5。 所述突变具体可为在SEQ ID NO .1自5’端982位和983位碱基之间插入A且缺 失 SEQ ID NO.6自5’端第504位碱基。 第五方面，本发明保护番茄雄性不育系扩繁的方法，为方法E或方法F。 所述方法E包括如下步骤：按照第一方面中所述方法制备番茄雄性不育植株，作 为番茄雄性不育系；按照第三方面中所述的方法制备保持系；采用保持系给番茄雄性 不育 系进行授粉，实现番茄雄性不育系扩繁。 所述方法F为包括如下步骤：按照第二方面中所述的方法制备番茄雄性不育植株， 作为番茄雄性不育系；按照第四方面中所述的方法制备保持系；采用保持系给番茄雄 性不 育系进行授粉，实现番茄雄性不育系扩繁。 所述方法F中，采用保持系给番茄雄性不育系进行授粉后，对后代叶片进行乙烯 利处理，通过肉眼观察叶片颜色选择区分不育系和保持系。 7 CN 111549057 A 说 明 书 4/10 页 第六方面，本发明保护SlNP1蛋白或其相关生物材料在调控番茄育性或番茄育种 中的应用； 所述相关生物材料为如下(1)-(3)中的任一种： (1)SlNP1蛋白的编码基因； (2)用于沉默或抑制目的植物中(1)的表达或敲除(1)的物质； (3)用于降低或抑制目的植物中SlNP1蛋白的活性和/或含量的物质； 所述SlNP1蛋白为前文所述的SlNP1蛋白。 所述(2)或(3)具体可为基因编辑载体，具体可为CRISPR/Cas9基因编辑载体。 所 述基因编辑的靶序列为SEQ ID NO.1自5’端第966-988位。 第七方面，本发明保护SlNP1蛋白和SlSGR1蛋白联用或二者相关生物材料在培 育 番茄不育系或番茄育种中的应用； 所述相关生物材料为如下(1)-(3)中的任一种： (1)SlNP1蛋白和SlSGR1蛋白的编码基因； (2)用于沉默或抑制目的植物中(1)的表达或敲除(1)的物质； (3)用于降低或抑制目的植物中SlNP1蛋白和SlSGR1蛋白的活性和/或含量的 物 质； 所述SlNP1蛋白为前文所述的SlNP1蛋白。 所述SlSGR1蛋白为前文所述的SlSGR1蛋白。 所述(2)或(3)具体可为基因编辑载体，具体可为Cas9基因编辑载体。所述基 因编 辑的靶序列为SEQ ID NO.1自5’端第966-988位和SEQ ID NO.5。 以上任一所述纯合突变为两条同源染色体都发生相同突变。 以上任一所述杂合突变为仅一条同源染色体发生所述突变。 以上任一所述编码SlNP1蛋白的基因是如下任一所述的DNA分子： (B1)SEQ ID No.1所示的DNA分子； (B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分 子； (B3)与(B1)或(B2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、 85％以上 或者80％以上同一性且编码所述蛋白的DNA分子。 以上任一所述编码SlSGR1蛋白的基因是如下任一所述的DNA分子： (B1)SEQ ID No.6所示的DNA分子； (B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分 子； (B3)与(B1)或(B2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、 85％以上 或者80％以上同一性且编码所述蛋白的DNA分子。 所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4和 1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃， 在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在 7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中 杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗； 还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC， 0.1％SDS中漂洗；还可为： 50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在 65℃，0.1×SSC， 0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交， 8 CN 111549057 A 说 明 书 5/10 页 然后 用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。 以上任一所述番茄具体可为番茄材料Ailsa Craig。 本发明具有以下明显的效果：1)克隆了新的番茄育性基因SlNP1，基于基因编辑 技术可以快速精确的创制番茄稳定的SlNP1雄性不育系，且败育性彻底无其他不良性 状的 产生；2)通过双基因敲除连锁基因SlNP1和SlSGR1，使得雄性不育和滞绿两个 表型连锁同 步，通过观察乙烯利处理的叶片快速的筛选出雄性不育系，该方法方便、 快捷、有效。 本发明对于番茄雄性不育系的培育及番茄育种有重要意义。 附图说明 图1为SlNP1基因的组织表达模式。 图2为育性基因验证载体和双基因敲除载体示意图。 图3为slnp1突变体基因型鉴定。 图4为slnp1突变体表型鉴定。 图5为双基因突变体基因型鉴定。 图6为可见标记表型鉴定。 图7为可见标记不育系扩繁策略示意图。
本发明公开了一种利用番茄雄性不育基因及可见连锁标记创制雄性不育系的方法。本发明克隆了新的番茄育性基因SlNP1，基于基因编辑技术可以快速精确的创制番茄稳定的SlNP1雄性不育系，且败育性彻底无其他不良性状的产生；通过双基因敲除连锁基因SlNP1和SlSGR1，使得雄性不 全部
背景技术：
番茄是全球消费最多的蔬菜之一，2017年产量1.82亿吨，价值超600亿美元。中 国 是世界上番茄栽培面积最大、生产总量最多的国家，年产量5000万吨以上。番茄是 严格的 闭花授粉作物，杂种优势明显，杂种优势是指在植物中两个遗传基础不同的品 种间或相近 物种间进行杂交，其杂交一代在生长势、生活力、适应性和产量等性状上 优于其双亲的现 象。杂种优势利用的关键在于发展和利用可以控制的授粉系统，以防 止自花授粉导致的自 交衰退。为了保证杂交种的纯度，必须使母本丧失雄性功能。目 前主要采取的方法有人工 或机械去雄、化学杀雄和采用雄性不育系做母本。人工去雄 是指在授粉期前人为的去除母 本的雄花，需耗费大量人力物力，对于番茄等严格自花 授粉的作物，则更加困难。机械去雄 和化学去雄对植物的正常生长影响较大。因此创 制雄性不育系可以降低成本、提高杂交种 纯度，对杂交育种有着重要的意义。 雄性不育包括细胞质不育和核不育，细胞质不育不稳定易受环境影响，因此创制 稳定的核不育系是雄性不育系的发展方向。随着分子生物学的发展，越来越多的核育 性基 因被克隆出来，包括Lat52(Twell et al.,1989)、Ps-2(Gorguet et al.,2009)、Style 2.1 (Chen et al.,2007)、Ms10-35(Jeong et al.,2014)、MPK20(Chen et al.,2018)、Ms15 (Cao et al.,2019)、PIF3(CN 109456979 A)、LAP3(CN 109207505 A)等，这些基 因大多数 没有被应用的原因包括：1)败育性不彻底，会导致杂交种不纯；2)没有有 效的保持系或可 区分不育系和保持系的简易方法。 可见标记是指通过肉眼或者简单的处理可以有效的和对照株系进行区分的表型， 包括叶片形状、叶片颜色、茎秆颜色、表皮绒毛、种子大小、种子绒毛等性状。连锁 可见标记 是指该标记与目标基因紧密连锁，后代可以通过可见标记间接的判断目标基 因的基因型。 第三代基因编辑(CRISPR/Cas9)是一项旨在对基因组进行定点修饰的新技术， 通 过人工构建的工程化核酸酶，对基因组目标区间序列特异性的识别与切割，产生双 链断 裂，并通过细胞内源的同源重组或非同源末端连接DNA损伤修复机制，可以在 细胞活体基 因组DNA序列中产生碱基缺失、插入、替换等修饰的技术(Hsuet et al., 2014)。基因编辑 技术理论上可对任意品种的任意基因进行操作，实现对核心亲本目标 性状的快速、精准改 良而不存在传统回交育种常见的连锁累赘等问题，基因编辑技术 还可以实现多基因同时 突变，从而大大提高了多性状聚合的效率。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种利用番茄雄性不育基因及可见连锁标记创制雄性不育 5 CN 111549057 A 说 明 书 2/10 页 系 的方法。 第一方面，本发明保护番茄雄性不育植株的制备方法，为方法A或方法B。 所述方法A包括如下步骤：降低或抑制番茄中SlNP1蛋白的活性和/或含量，得 到 雄性不育植物； 所述方法B包括如下步骤：沉默或抑制番茄中编码SlNP1蛋白的基因的表达或敲 除编码SlNP1蛋白的基因，得到雄性不育植物： 所述SlNP1蛋白是如下(A1)或(A2)或(A3)： (A1)由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (A2)来源于番茄且与(A1)具有98％以上同一性且与植物雄性育性相关的蛋 白 质； (A3)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或 缺失和/或添加且与植物雄性育性相关的蛋白质。 所述“降低或抑制番茄中SlNP1蛋白的活性和/或含量”为使SlNP1蛋白的氨基酸 残基发生移码突变或氨基酸翻译提前终止。 所述“沉默或抑制番茄中编码SlNP1蛋白的基因的表达或敲除编码SlNP1蛋白的 基因”，为突变目的植物中编码SlNP1蛋白的基因使番茄中编码SlNP1蛋白的基因表 达量降 低或使番茄中编码SlNP1蛋白的基因发生功能缺失；所述突变为纯合突变。 所述突变可采用基因编辑技术实现。所述基因编辑技术具体可为CRISPR/Cas9基 因编辑技术。所述CRISPR/Cas9基因编辑的靶序列具体可位于所述基因的外显子，更 具体 可为SEQ ID NO.1自5’端第966-988位。 所述突变具体可为在SEQ ID NO.1自5’端982位和983位碱基之间插入A。 第二方面，本发明保护番茄雄性不育植株的制备方法，为方法C或方法D。 所述方法C包括如下步骤：同时降低或抑制番茄中SlNP1蛋白和SlSGR1蛋白的 活 性和/或含量，得到雄性不育植物； 所述方法D包括如下步骤：同时沉默或抑制番茄中编码SlNP1蛋白的基因和编码 SlSGR1蛋白的基因的表达，或，同时敲除编码SlNP1蛋白的基因和编码SlSGR1蛋白 的基因， 得到雄性不育植物： 所述SlNP1蛋白为前文所述的SlNP1蛋白。 所述SlSGR1蛋白是如下(C1)或(C2)或(C3)： (C1)由SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (C2)来源于番茄且与(A1)具有98％以上同一性且与具有相同功能的蛋白质； (C3)将SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或 缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。 所述“同时降低或抑制番茄中SlNP1蛋白和SlSGR1蛋白的活性和/或含量”为使 SlNP1蛋白的氨基酸残基发生移码突变或氨基酸翻译提前终止且使SlSGR1蛋白的氨 基酸 残基发生移码突变或氨基酸翻译提前终止。 所述“同时沉默或抑制番茄中编码SlNP1蛋白的基因和编码SlSGR1蛋白的基因 的 表达，或，同时敲除编码SlNP1蛋白的基因和编码SlSGR1蛋白的基因”，为同时突 变番茄中 编码SlNP1蛋白的基因和编码SlSGR1蛋白的基因使番茄中编码SlNP1蛋白 的基因和编码 6 CN 111549057 A 说 明 书 3/10 页 SlSGR1蛋白的基因表达量降低或使番茄中编码编码SlNP1蛋白的基因 和编码SlSGR1蛋白 的基因发生功能缺失；所述突变为纯合突变。 所述突变可采用基因编辑技术实现。所述基因编辑技术具体可为CRISPR/Cas9基 因编辑技术。所述CRISPR/Cas9基因编辑的靶序列具体可位于所述基因的外显子。编 码 SlNP1蛋白的基因的靶序列可为SEQ ID NO.1自5’端第966-988位。编码SlSGR1 蛋白的基因 的靶序列可为SEQ ID NO.5。 所述突变具体可为在SEQ ID NO .1自5’端982位和983位碱基之间插入A且缺 失 SEQ ID NO.6自5’端第504位碱基。 第三方面，本发明保护番茄保持系的制备方法，包括如下步骤：突变目的植物中 编码SlNP1蛋白的基因使番茄中编码SlNP1蛋白的基因表达量降低或使番茄中编码 SlNP1 蛋白的基因发生功能缺失，得到番茄保持系；所述突变为杂合突变； 所述SlNP1蛋白为前文所述的SlNP1蛋白。 所述保持系为第一方面中所述方法制备的不育植株的保持系。 所述突变可采用基因编辑技术实现。所述基因编辑技术具体可为CRISPR/Cas9基 因编辑技术。所述CRISPR/Cas9基因编辑的靶序列具体可位于所述基因的外显子，更 具体 可为SEQ ID NO.1自5’端第966-988位。 所述突变具体可为在SEQ ID NO.1自5’端982位和983位碱基之间插入A。 第四方面，本发明保护番茄保持系的制备方法，包括如下步骤：同时突变番茄中 编码SlNP1蛋白的基因和编码SlSGR1蛋白的基因使番茄中编码SlNP1蛋白的基因和 编码 SlSGR1蛋白的基因表达量降低或使番茄中编码编码SlNP1蛋白的基因和编码 SlSGR1蛋白 的基因发生功能缺失，得到番茄保持系；所述突变为杂合突变； 所述SlNP1蛋白为前文所述的SlNP1蛋白。 所述SlSGR1蛋白为前文所述的SlSGR1蛋白。 所述保持系为第二方面中所述方法制备的不育植株的保持系。 所述突变可采用基因编辑技术实现。所述基因编辑技术具体可为CRISPR/Cas9基 因编辑技术。所述CRISPR/Cas9基因编辑的靶序列具体可位于所述基因的外显子。编 码 SlNP1蛋白的基因的靶序列可为SEQ ID NO.1自5’端第966-988位。编码SlSGR1 蛋白的基因 的靶序列可为SEQ ID NO.5。 所述突变具体可为在SEQ ID NO .1自5’端982位和983位碱基之间插入A且缺 失 SEQ ID NO.6自5’端第504位碱基。 第五方面，本发明保护番茄雄性不育系扩繁的方法，为方法E或方法F。 所述方法E包括如下步骤：按照第一方面中所述方法制备番茄雄性不育植株，作 为番茄雄性不育系；按照第三方面中所述的方法制备保持系；采用保持系给番茄雄性 不育 系进行授粉，实现番茄雄性不育系扩繁。 所述方法F为包括如下步骤：按照第二方面中所述的方法制备番茄雄性不育植株， 作为番茄雄性不育系；按照第四方面中所述的方法制备保持系；采用保持系给番茄雄 性不 育系进行授粉，实现番茄雄性不育系扩繁。 所述方法F中，采用保持系给番茄雄性不育系进行授粉后，对后代叶片进行乙烯 利处理，通过肉眼观察叶片颜色选择区分不育系和保持系。 7 CN 111549057 A 说 明 书 4/10 页 第六方面，本发明保护SlNP1蛋白或其相关生物材料在调控番茄育性或番茄育种 中的应用； 所述相关生物材料为如下(1)-(3)中的任一种： (1)SlNP1蛋白的编码基因； (2)用于沉默或抑制目的植物中(1)的表达或敲除(1)的物质； (3)用于降低或抑制目的植物中SlNP1蛋白的活性和/或含量的物质； 所述SlNP1蛋白为前文所述的SlNP1蛋白。 所述(2)或(3)具体可为基因编辑载体，具体可为CRISPR/Cas9基因编辑载体。 所 述基因编辑的靶序列为SEQ ID NO.1自5’端第966-988位。 第七方面，本发明保护SlNP1蛋白和SlSGR1蛋白联用或二者相关生物材料在培 育 番茄不育系或番茄育种中的应用； 所述相关生物材料为如下(1)-(3)中的任一种： (1)SlNP1蛋白和SlSGR1蛋白的编码基因； (2)用于沉默或抑制目的植物中(1)的表达或敲除(1)的物质； (3)用于降低或抑制目的植物中SlNP1蛋白和SlSGR1蛋白的活性和/或含量的 物 质； 所述SlNP1蛋白为前文所述的SlNP1蛋白。 所述SlSGR1蛋白为前文所述的SlSGR1蛋白。 所述(2)或(3)具体可为基因编辑载体，具体可为Cas9基因编辑载体。所述基 因编 辑的靶序列为SEQ ID NO.1自5’端第966-988位和SEQ ID NO.5。 以上任一所述纯合突变为两条同源染色体都发生相同突变。 以上任一所述杂合突变为仅一条同源染色体发生所述突变。 以上任一所述编码SlNP1蛋白的基因是如下任一所述的DNA分子： (B1)SEQ ID No.1所示的DNA分子； (B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分 子； (B3)与(B1)或(B2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、 85％以上 或者80％以上同一性且编码所述蛋白的DNA分子。 以上任一所述编码SlSGR1蛋白的基因是如下任一所述的DNA分子： (B1)SEQ ID No.6所示的DNA分子； (B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分 子； (B3)与(B1)或(B2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、 85％以上 或者80％以上同一性且编码所述蛋白的DNA分子。 所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4和 1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃， 在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在 7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中 杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗； 还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC， 0.1％SDS中漂洗；还可为： 50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在 65℃，0.1×SSC， 0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交， 8 CN 111549057 A 说 明 书 5/10 页 然后 用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。 以上任一所述番茄具体可为番茄材料Ailsa Craig。 本发明具有以下明显的效果：1)克隆了新的番茄育性基因SlNP1，基于基因编辑 技术可以快速精确的创制番茄稳定的SlNP1雄性不育系，且败育性彻底无其他不良性 状的 产生；2)通过双基因敲除连锁基因SlNP1和SlSGR1，使得雄性不育和滞绿两个 表型连锁同 步，通过观察乙烯利处理的叶片快速的筛选出雄性不育系，该方法方便、 快捷、有效。 本发明对于番茄雄性不育系的培育及番茄育种有重要意义。 附图说明 图1为SlNP1基因的组织表达模式。 图2为育性基因验证载体和双基因敲除载体示意图。 图3为slnp1突变体基因型鉴定。 图4为slnp1突变体表型鉴定。 图5为双基因突变体基因型鉴定。 图6为可见标记表型鉴定。 图7为可见标记不育系扩繁策略示意图。
