技术摘要：
本发明公开了一种通过抑制OsSDM基因表达提高水稻耐盐性的方法。本发明提供了一种培育抗非生物胁迫的植物的方法，包括如下步骤：抑制出发植物中甲基转移酶基因的表达，从而使植物对非生物胁迫的耐逆性增强。本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在出发 全部
背景技术：
在水稻的生长发育过程中会受到各种各样的非生物胁迫，如高盐、高温、干旱及冷 害等。水稻最早起源于淡水沼泽环境，是一种对盐胁迫中度敏感的作物，土壤盐化自然也成 为了影响水稻产量的主要不利因素之一。 盐胁迫是由土壤或溶液中高浓度的盐离子引发而产生的对作物的危害作用，包括 直接的离子毒害作用和间接的渗透胁迫、离子失衡和营养缺乏等。盐胁迫几乎会影响水稻 所有的生长代谢过程。在盐胁迫下，水稻会产生各种生理生化变化，根据前人的研究，盐胁 迫对水稻的伤害机制主要有以下几方面：(1)过多的盐离子破坏水稻细胞质膜的完整性，导 致其选择透过性能下降直至消失，从而使细胞内Na 、Cl-等离子大量积累，K 、Ca2 等营养元 素则大量外渗，引起细胞内离子浓度的动态平衡失调，破坏细胞膜和细胞器的结构，引起叶 片的气孔导度、叶绿素含量以及核酸含量等下降，引发一系列的代谢紊乱，使细胞的功能下 降，加速衰老或死亡；(2)高盐降低土壤溶液的水势，形成水分胁迫，使水稻根部吸水困难， 细胞内盐分浓度提高，从而生理代谢失调，进而影响水稻的出苗和生长发育；(3)盐分胁迫 促使活性氧O -2 、H2O2、OH等的产量增加，破坏或减弱细胞内抗氧化系统如超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POX)、谷胱甘肽(GSH)、抗坏血酸(ASC)等的活性或含 量，从而影响体内活性氧代谢系统的平衡；活性氧含量的增加能加剧膜质过氧化，破坏膜的 完整性，选择透过性丧失，电解质及某些小分子有机物大量渗入，物质交换平衡被破坏，使 水稻收到伤害；(4)盐胁迫降低了光合速率，同化物和能量的供给减少，抑制蛋白质的合成， 此外水稻为了适应高盐环境和维持其生长，需要消耗更多的能量来进行离子的主动吸收和 运输、区域化分配以及渗透调节物质的合成，从而限制水稻的生长发育，大大影响其生产量 和品质。 水稻不同品种、不同时期和不同器官受盐胁迫伤害的程度不同，耐盐性也不同。在 水稻种子萌发阶段，由于吸水收到高盐抑制，种子发芽不齐，发芽率降低，甚至根本不能发 芽而在土内变质腐烂。种子萌发后，对盐胁迫极为敏感，会表现出芽尖枯黄、弯曲，迟迟不能 绿化，直至出苗后的秧苗死亡。出苗后，水稻从异养阶段过渡到自养阶段，此时若遭遇盐害， 则会发生卷叶和枯萎，叶片伸长和新生叶的形成都会受到抑制。水稻分蘖期、幼穗形成期和 抽穗开花期遭受盐胁迫，其分蘖和伸长将受到抑制，无效分蘖增多，抽穗推迟，穗短粒少，籽 粒不饱满，最终导致产量下降。 水稻对盐胁迫的应答适应和耐盐性是近年来研究的一个重点和难点。耐盐性是水 稻能在高盐基质上生长，并忍耐或抵抗盐胁迫并完成整个生命周期的能力。水稻的耐盐性 是多个生理过程综合作用的表现，深入开展水稻对盐胁迫的适应和耐盐性的研究，对培育 耐盐水稻品种，进一步扩大水稻的可种植面积，保证粮食的安全生产和品质具有重要意义。 3 CN 111593064 A 说 明 书 2/6 页
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种通过抑制OsSDM基因表达提高水稻耐盐性的方法。 本发明提供了一种培育抗非生物胁迫的植物的方法，包括如下步骤：抑制出发植 物中甲基转移酶基因的表达，从而使植物对非生物胁迫的耐逆性增强。 “抑制出发植物中甲基转移酶基因的表达”是通过基因编辑实现的。 “抑制出发植物中甲基转移酶基因的表达”是通过CRISPR/Cas9系统实现的。所述 CRISPR/Cas9系统中的sgRNA的靶序列如序列表的序列6所示。所述CRISPR/Cas9系统中的 sgRNA如序列表的序列5所示。 “抑制出发植物中甲基转移酶基因的表达”是通过导入重组质粒实现的；所述重组 质粒表达Cas9蛋白基因和特异sgRNA基因；所述特异sgRNA的靶序列如序列表的序列6所示。 所述特异sgRNA如序列表的序列5所示。 本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在出发植物中导入表 达Cas9蛋白基因的DNA分子和表达特异sgRNA基因的DNA分子，得到对非生物胁迫的耐逆性 增强的转基因植物。表达Cas9蛋白基因的DNA分子和表达特异sgRNA基因的DNA分子可存在 于同一质粒中也可存在于不同质粒中。所述特异sgRNA的靶序列如序列表的序列6所示。所 述特异sgRNA如序列表的序列5所示。 本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在出发植物中导入特 异质粒，得到对非生物胁迫的耐逆性增强的转基因植物；所述特异质粒表达Cas9蛋白基因 和特异sgRNA基因；所述特异sgRNA的靶序列如序列表的序列6所示。所述特异sgRNA如序列 表的序列5所示。 本发明还保护用于抑制甲基转移酶基因表达的物质在培育对非生物胁迫的耐逆 性增强的植物中的应用。“抑制甲基转移酶基因表达的物质”可为通过基因编辑抑制甲基转 移酶基因表达的物质。“抑制甲基转移酶基因表达的物质”可为通过CRISPR/Cas9系统抑制 甲基转移酶基因表达的物质。所述CRISPR/Cas9系统中的sgRNA的靶序列如序列表的序列6 所示。所述CRISPR/Cas9系统中的sgRNA如序列表的序列5所示。“抑制甲基转移酶基因表达 的物质”可为表达Cas9蛋白基因的DNA分子和表达特异sgRNA基因的DNA分子。“抑制甲基转 移酶基因表达的物质”可为特异质粒；所述特异质粒表达Cas9蛋白基因和特异sgRNA基因。 所述特异sgRNA的靶序列如序列表的序列6所示。所述特异sgRNA如序列表的序列5所示。 本发明还保护一种培育对非生物胁迫的耐逆性增强的植物的方法，包括如下步 骤：降低植物中甲基转移酶的含量和/或抑制植物中甲基转移酶的活性，从而使植物对非生 物胁迫的耐逆性增强。 本发明还保护一种sgRNA,其靶序列如序列表的序列6所示。所述sgRNA如序列表的 序列5所示。 本发明还保护所述sgRNA在制备对非生物胁迫的耐逆性增强的转基因植物中的应 用。本发明还保护所述sgRNA的编码基因和Cas9蛋白的编码基因在制备对非生物胁迫的耐 逆性增强的转基因植物中的应用。 以上任一所述甲基转移酶为SDM蛋白。 以上任一所述甲基转移酶为OsSDM蛋白。 所述OsSDM蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)： 4 CN 111593064 A 说 明 书 3/6 页 (a1)序列表的序列1所示的蛋白质； (a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同 功能的蛋白质； (a3)来源于水稻且与(a1)具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％ 以上同一性且具有相同功能的蛋白质。 所述甲基转移酶基因为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)： (b1)编码区如序列表的序列2所示的DNA分子； (b2)序列表的序列3所示的DNA分子； (b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的DNA分子杂交且编码所述甲基转移酶的 DNA分子； (b4)来源于水稻且与(b1)或(b2)具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或 者80％以上同一性且编码所述甲基转移酶的DNA分子。 术语“同一性”指与天然核苷酸序列或氨基酸序列的序列相似性。“同一性”可以用 肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分 比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的一致性。 以上任一所述植物为禾本科植物。 以上任一所述植物为水稻。 以上任一所述植物为粳稻， 以上任一所述植物为水稻日本晴。 以上任一所述非生物胁迫为盐胁迫。 本发明对于以培育耐逆植物为目的的植物育种，特别是以培育耐盐水稻为目的的 水稻育种，具有重大的应用推广价值。 附图说明 图1为重组质粒pCRISPR-OsSDM的元件示意图。 图2为ossdm-1单株和ossdm-2单株中靶序列及其周边序列。 图3为耐盐性鉴定中的照片。 图4为耐盐性鉴定中的存活率结果。
本发明公开了一种通过抑制OsSDM基因表达提高水稻耐盐性的方法。本发明提供了一种培育抗非生物胁迫的植物的方法，包括如下步骤：抑制出发植物中甲基转移酶基因的表达，从而使植物对非生物胁迫的耐逆性增强。本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在出发 全部
背景技术：
在水稻的生长发育过程中会受到各种各样的非生物胁迫，如高盐、高温、干旱及冷 害等。水稻最早起源于淡水沼泽环境，是一种对盐胁迫中度敏感的作物，土壤盐化自然也成 为了影响水稻产量的主要不利因素之一。 盐胁迫是由土壤或溶液中高浓度的盐离子引发而产生的对作物的危害作用，包括 直接的离子毒害作用和间接的渗透胁迫、离子失衡和营养缺乏等。盐胁迫几乎会影响水稻 所有的生长代谢过程。在盐胁迫下，水稻会产生各种生理生化变化，根据前人的研究，盐胁 迫对水稻的伤害机制主要有以下几方面：(1)过多的盐离子破坏水稻细胞质膜的完整性，导 致其选择透过性能下降直至消失，从而使细胞内Na 、Cl-等离子大量积累，K 、Ca2 等营养元 素则大量外渗，引起细胞内离子浓度的动态平衡失调，破坏细胞膜和细胞器的结构，引起叶 片的气孔导度、叶绿素含量以及核酸含量等下降，引发一系列的代谢紊乱，使细胞的功能下 降，加速衰老或死亡；(2)高盐降低土壤溶液的水势，形成水分胁迫，使水稻根部吸水困难， 细胞内盐分浓度提高，从而生理代谢失调，进而影响水稻的出苗和生长发育；(3)盐分胁迫 促使活性氧O -2 、H2O2、OH等的产量增加，破坏或减弱细胞内抗氧化系统如超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POX)、谷胱甘肽(GSH)、抗坏血酸(ASC)等的活性或含 量，从而影响体内活性氧代谢系统的平衡；活性氧含量的增加能加剧膜质过氧化，破坏膜的 完整性，选择透过性丧失，电解质及某些小分子有机物大量渗入，物质交换平衡被破坏，使 水稻收到伤害；(4)盐胁迫降低了光合速率，同化物和能量的供给减少，抑制蛋白质的合成， 此外水稻为了适应高盐环境和维持其生长，需要消耗更多的能量来进行离子的主动吸收和 运输、区域化分配以及渗透调节物质的合成，从而限制水稻的生长发育，大大影响其生产量 和品质。 水稻不同品种、不同时期和不同器官受盐胁迫伤害的程度不同，耐盐性也不同。在 水稻种子萌发阶段，由于吸水收到高盐抑制，种子发芽不齐，发芽率降低，甚至根本不能发 芽而在土内变质腐烂。种子萌发后，对盐胁迫极为敏感，会表现出芽尖枯黄、弯曲，迟迟不能 绿化，直至出苗后的秧苗死亡。出苗后，水稻从异养阶段过渡到自养阶段，此时若遭遇盐害， 则会发生卷叶和枯萎，叶片伸长和新生叶的形成都会受到抑制。水稻分蘖期、幼穗形成期和 抽穗开花期遭受盐胁迫，其分蘖和伸长将受到抑制，无效分蘖增多，抽穗推迟，穗短粒少，籽 粒不饱满，最终导致产量下降。 水稻对盐胁迫的应答适应和耐盐性是近年来研究的一个重点和难点。耐盐性是水 稻能在高盐基质上生长，并忍耐或抵抗盐胁迫并完成整个生命周期的能力。水稻的耐盐性 是多个生理过程综合作用的表现，深入开展水稻对盐胁迫的适应和耐盐性的研究，对培育 耐盐水稻品种，进一步扩大水稻的可种植面积，保证粮食的安全生产和品质具有重要意义。 3 CN 111593064 A 说 明 书 2/6 页
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种通过抑制OsSDM基因表达提高水稻耐盐性的方法。 本发明提供了一种培育抗非生物胁迫的植物的方法，包括如下步骤：抑制出发植 物中甲基转移酶基因的表达，从而使植物对非生物胁迫的耐逆性增强。 “抑制出发植物中甲基转移酶基因的表达”是通过基因编辑实现的。 “抑制出发植物中甲基转移酶基因的表达”是通过CRISPR/Cas9系统实现的。所述 CRISPR/Cas9系统中的sgRNA的靶序列如序列表的序列6所示。所述CRISPR/Cas9系统中的 sgRNA如序列表的序列5所示。 “抑制出发植物中甲基转移酶基因的表达”是通过导入重组质粒实现的；所述重组 质粒表达Cas9蛋白基因和特异sgRNA基因；所述特异sgRNA的靶序列如序列表的序列6所示。 所述特异sgRNA如序列表的序列5所示。 本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在出发植物中导入表 达Cas9蛋白基因的DNA分子和表达特异sgRNA基因的DNA分子，得到对非生物胁迫的耐逆性 增强的转基因植物。表达Cas9蛋白基因的DNA分子和表达特异sgRNA基因的DNA分子可存在 于同一质粒中也可存在于不同质粒中。所述特异sgRNA的靶序列如序列表的序列6所示。所 述特异sgRNA如序列表的序列5所示。 本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在出发植物中导入特 异质粒，得到对非生物胁迫的耐逆性增强的转基因植物；所述特异质粒表达Cas9蛋白基因 和特异sgRNA基因；所述特异sgRNA的靶序列如序列表的序列6所示。所述特异sgRNA如序列 表的序列5所示。 本发明还保护用于抑制甲基转移酶基因表达的物质在培育对非生物胁迫的耐逆 性增强的植物中的应用。“抑制甲基转移酶基因表达的物质”可为通过基因编辑抑制甲基转 移酶基因表达的物质。“抑制甲基转移酶基因表达的物质”可为通过CRISPR/Cas9系统抑制 甲基转移酶基因表达的物质。所述CRISPR/Cas9系统中的sgRNA的靶序列如序列表的序列6 所示。所述CRISPR/Cas9系统中的sgRNA如序列表的序列5所示。“抑制甲基转移酶基因表达 的物质”可为表达Cas9蛋白基因的DNA分子和表达特异sgRNA基因的DNA分子。“抑制甲基转 移酶基因表达的物质”可为特异质粒；所述特异质粒表达Cas9蛋白基因和特异sgRNA基因。 所述特异sgRNA的靶序列如序列表的序列6所示。所述特异sgRNA如序列表的序列5所示。 本发明还保护一种培育对非生物胁迫的耐逆性增强的植物的方法，包括如下步 骤：降低植物中甲基转移酶的含量和/或抑制植物中甲基转移酶的活性，从而使植物对非生 物胁迫的耐逆性增强。 本发明还保护一种sgRNA,其靶序列如序列表的序列6所示。所述sgRNA如序列表的 序列5所示。 本发明还保护所述sgRNA在制备对非生物胁迫的耐逆性增强的转基因植物中的应 用。本发明还保护所述sgRNA的编码基因和Cas9蛋白的编码基因在制备对非生物胁迫的耐 逆性增强的转基因植物中的应用。 以上任一所述甲基转移酶为SDM蛋白。 以上任一所述甲基转移酶为OsSDM蛋白。 所述OsSDM蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)： 4 CN 111593064 A 说 明 书 3/6 页 (a1)序列表的序列1所示的蛋白质； (a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同 功能的蛋白质； (a3)来源于水稻且与(a1)具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％ 以上同一性且具有相同功能的蛋白质。 所述甲基转移酶基因为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)： (b1)编码区如序列表的序列2所示的DNA分子； (b2)序列表的序列3所示的DNA分子； (b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的DNA分子杂交且编码所述甲基转移酶的 DNA分子； (b4)来源于水稻且与(b1)或(b2)具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或 者80％以上同一性且编码所述甲基转移酶的DNA分子。 术语“同一性”指与天然核苷酸序列或氨基酸序列的序列相似性。“同一性”可以用 肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分 比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的一致性。 以上任一所述植物为禾本科植物。 以上任一所述植物为水稻。 以上任一所述植物为粳稻， 以上任一所述植物为水稻日本晴。 以上任一所述非生物胁迫为盐胁迫。 本发明对于以培育耐逆植物为目的的植物育种，特别是以培育耐盐水稻为目的的 水稻育种，具有重大的应用推广价值。 附图说明 图1为重组质粒pCRISPR-OsSDM的元件示意图。 图2为ossdm-1单株和ossdm-2单株中靶序列及其周边序列。 图3为耐盐性鉴定中的照片。 图4为耐盐性鉴定中的存活率结果。
