技术摘要：
本发明提供了一种检测非小细胞肺癌患者外周血循环肿瘤细胞EGFR基因突变的试剂盒及检测方法，属于分子生物学技术领域。该试剂盒包括稀释液、脱色液、染色液A、染色液B、EGFR（小鼠）一抗、山羊抗小鼠IgG/HRP、0.1%Triton X‑100、0.3%H2O2、试剂A、试剂B、6×PBS缓冲液。  全部
背景技术：
肺癌是导致癌症患者死亡的主要恶性肿瘤之一，在我国，肺癌的发病率和死亡率 均居第一位。非小细胞肺癌（NSCLC）约占全部肺癌的85%，而这其中超过70%的NSCLC患者在 确诊时已为晚期。尽管手术和放化疗等治疗技术不断提高，NSCLC患者5年生存率仍低于 20%，主要死因包括局部复发与远处转移。 循环肿瘤细胞（Circulating  tumor  cell，CTC）是从实体肿瘤脱落进入外周血液 循环的肿瘤细胞，自1989年被发现以来，目前已有多种方法用于外周血循环肿瘤细胞的检 测。近期研究表明，其检测对于评估肿瘤患者尤其是晚期肿瘤患者的预后以及选择合适的 个体化治疗具有重要的临床意义。因CTC检测具有微创、实时检测等特点，被称为肿瘤的“液 态活检”。 随着分子生物学的发展，近年来以表皮生长因子受体（epidermal  growth  factor  receptor，EGFR）为靶点的分子靶向治疗已成为NSCLC一种新的治疗方案，尤其对于晚期（失 去了手术机会）或手术后复发的NSCLC患者。EGFR是一种跨膜蛋白，为非小细胞肺癌患者术 后靶向药物资料等提供了中药的依据以及治疗靶点。针对EGFR的靶向治疗主要包括抗体类 药物和小分子酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine  kinaseinhibitors，TKIs），这两类药物的作用 机制主要在于抑制受体的活性，因此针对不同EGFR受体亚型（野生型和各种突变体），其疗 效显著不一。研究证实，EGFR基因发生突变是NSCLC  患者接受TKIs治疗获益的前提。目前， 国内外NSCLC诊治指南均认为：NSCLC患者EGFR突变检测的时间点包括初诊时及争取在疾病 进展时再次检测，应通过重复检测减少假阳性和假阴性。而目前临床实践中，NSCLC患者 EGFR检测的标本主要为肿瘤组织，来源于手术或穿刺活检，很难做到多次或实时检测。 目前，山东省第一医科大学、山东省药物研究院联合山东祺欣生物科技有限公司、 山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司等 单位，对于循环肿瘤细胞检测鉴定关键技术进行产业化推广的研究，本项目为山东省重大 科技创新工程项目，本项目将以山东第一医科大学济南校区的山东省药物研究院为核心， 落实注册人制度，依托循环肿瘤细胞检测鉴定核心诊断技术，进一步注册鉴定诊断试剂盒， 以包括PD1、PD-L1、ER、PR、Her-2、GPC-3、VEGF、P53、Vimentin、TKI-EGFR、RAS、CK、ALK-D5F3、 CD20、ALK/EML4、Beta-catenin、E-Cadherin、EP-CAM、HPV、IDH-1、PSA、PSMA、VEGF、GFAP、细 胞角蛋白、AE1/AE3、雌激素受体、孕激素受体、BCA-225、CA  125、CEA、EMA、ERCC1、HPV、Ki- 67、P53、TOP2A等作为CTCs表达的示踪剂，注册超灵敏、超快速、高覆盖、低成本、准确特异的 鉴定诊断试剂盒，通过与在济南注册的山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有 限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司合作进行产业化推广。 4 CN 111596057 A 说　明　书 2/6 页
技术实现要素：
为了克服晚期或复发非小细胞肺癌患者无法实时或反复穿刺获取组织标本、进而 不能评估患者EGFR状态的不足，本发明提供了一种非小细胞肺癌患者外周血循环肿瘤细胞 EGFR基因突变非诊断目的的检测方法：利用膜过滤装置分离获得无法获取组织标本的晚期 或复发非小细胞肺癌患者外周血中的CTC，进一步运用免疫组化技术检测CTC的EGFR表达情 况。 本发明采用的技术方案如下： 本发明提供了一种检测非小细胞肺癌患者外周血循环肿瘤细胞EGFR基因突变的试剂 盒，包括稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A  0.5mL、染色液B  1mL、EGFR（小鼠）一抗100μL、山 羊抗小鼠  IgG/HRP  100μL、0.1%  Triton  X-100  100μL、0.3%  H2O2  100μL、试剂A、试剂B、6× PBS缓冲液  60mL；所述PBS缓冲液的pH值为7.4。 进一步的，所述稀释液是由1mmol/L  EDTA 0.1%  BSA 0.1%海藻糖 0.2%聚氧乙烯 聚氧丙烯醚嵌段共聚物组成，所述基础液为Tris-HCl缓冲剂。 进一步的，所述脱色液是由95%酒精与100%二甲苯按容积比1:1组成。 进一步的，所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。 进一步的，所述试剂A为0.6%的羟丙基甲基纤维素水溶液；所述试剂B为乙醇和1， 2-丙二醇按照体积比3：1组成。 本发明还提供了一种利用上述试剂盒非诊断目的检测非小细胞肺癌患者外周血 循环肿瘤细胞EGFR基因突变的方法，包括以下步骤： （1）利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的晚期或复发非小细胞肺癌患者外周 血中的CTC：采集无法获取组织标本的晚期或复发非小细胞肺癌患者外周血：肘正中静脉外 周血5ml； （2）外周血样预处理：将采集的外周血样采用稀释液进行10倍稀释，稀释后加多聚甲醛 固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%； （3）利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血CTC：将预处理的外 周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤； （4）过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器，将循环肿瘤细胞染色液A液 0.5ml加入到滤器中，染色3min，PBS缓冲液冲洗干净；滤液过滤完全后加入染色液B液1ml， 染色2min，纯水1ml冲洗2次，取下滤膜，放置在载玻片上，干燥后在显微镜下观察，确定是否 存在CTC； （5）运用免疫组化技术检测CTC的EGFR表达情况。 本发明检测CTC的EGFR表达的具体方法如下：  （1）脱色：将带有CTC的滤膜从载玻片上取下，置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染 色液； （2）滴加100μl  0.1%  Triton  X-100，室温孵育15min，DI水洗2min×3次； （3）滴加100μl  0.3%  H2O2，室温孵育10min，PBS洗2min×3次；（4）滴加100μl  EGFR（小 鼠）一抗，室温孵育2h或4℃过夜，PBS洗2min×3次； （5）滴加100μl山羊抗小鼠  IgG/HRP，18～26℃温度下孵育20min，PBS洗2min×3次； （6）滴加100μl  DAB显色液，18～26℃孵育并随时在显微镜下观察显色情况，观察时间 5 CN 111596057 A 说　明　书 3/6 页 为3～10min； （7）显色完成后，弃掉DAB显色液，流水冲洗5min，苏木素染色5min； （8）盐酸酒精分化8秒，自来水返蓝5min； （9）将返蓝后的CTC采用75%乙醇（1min），95%乙醇（1min），100%乙醇（1min）梯度乙醇脱 水，然后加入0.5mL试剂A，振荡均匀后，加入1mL试剂B，摇动混合均匀后，离心沉淀，将沉淀 物采用中性树脂封固； （10）光学显微镜下镜检。 本发明所使用的膜过滤分离肿瘤细胞装置，包括滤器、血样容器、废液缸和铁架 台，所述铁架台设有底座、立架和支架，所述血样容器通过支架设置于铁架台上部，血样容 器的下方为滤器，滤器通过输液器联通至废液缸，废液缸设置于底座上。 所述滤器包括滤器上口、滤膜、载滤膜平台和滤器下口，滤膜置于载滤膜平台上； 滤器上口接血样容器，滤器下口通过输液器接废液缸。 所述滤膜为疏水材料制成，其上均匀布满口径为8微米的滤孔。 本发明的有益效果是： （1）本发明提供的检测方法，不用穿刺活检获取组织标本即可检测到晚期或复发非小 细胞肺癌患者EGFR表达情况。该技术属于微创，并能够实时检测。 （2）本发明提供的方法，能够避免染色过程中可能产生的边缘效应导致的假阳性 结果，稳定性好，降低细胞的损失，提高检测的准确性。 附图说明 图1为本发明的膜过滤装置结构示意图； 图2为本发明膜过滤装置的滤器的结构示意剖视图； 图3为本发明膜过滤装置的滤器滤膜的结构示意图； 图4为肺癌患者外周血分离获取的循环肿瘤细胞影像图；  图5 为晚期非小细胞肺癌患者外周血循环肿瘤细胞染色效果图。