技术摘要：
本发明公开了一种Hangtaimycin生物合成基因簇及其应用。其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第1‑91594位所示，包含21个基因。本发明所提供的hangtaimycin生物合成簇所有基因和蛋白信息，有助于人们理解hangtaimycin家族天然产物的生物合成机制，以及在此基础上为通过遗传改造  全部
背景技术：
Hangtaimycin是一个具有独特δ不饱和六元环内酯以及末端环二肽单元的新颖聚 酮聚肽类杂合化合物(图1)。虽然hangtaimycin最初于2016年从链霉菌Streptomyces  spectabilis  CPCC200148中分离获得，却只进行了初步的抗肿瘤及抗白色念珠菌的活性测 试。我们在对链霉菌Streptomyces  spectabilis  CCTCC  M2017417的活性次生代谢产物研 究中分离鉴定出hangtaimycin，并对hangtaimycin及其衍生物进行了更广泛的生物活性考 察和生物合成机制研究。 生物学活性测试结果显示，hangtaimycin的甲醇水解产物hangtaimycinA具有优 于一线临床保肝药品水飞蓟宾的降谷丙转氨酶和谷草转氨酶的活性，同时还表现出比抗炎 药物雷帕霉素更显著的抗炎活性，具有开发成新一代保肝护肝药品的重要前景。 Hangtaimycin及其醇解产物hangtaimycinA的生物合成基因簇和生物合成机制迄今国内外 尚未见报道。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种Hangtaimycin生物合成基因簇及 其应用。 为实现上述目的，本发明的技术方案如下： 第一方面，本发明的第一个目的是提供hangtiamycin生物合成基因簇(图2)。 本发明在链霉菌Streptomycesspectabilis  CCTCC  M2017417基因组测序和生物 信息学分析的基础上，发现可能负责hangtaimycin生物合成的基因簇，通过基因簇敲除及 发酵产物检测(图3-13)，证明了链霉菌Streptomyces  spectabilis  CCTCC  M2017417基因 组中负责曲张链丝菌素生物合成的基因簇。一种Hangtaimycin生物合成基因簇，其特征在 于：该生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.1的第1-91594位的碱基序列所示，包含 21个基因，具体为： (1)负责hangtaimycin碳骨架合成及修饰的18个基因： 1)1号基因：htmA1位于基因簇核苷酸序列第10986-25451个碱基处，长度为14466 个碱基对，编码聚酮合酶，4821个氨基酸； 2)2号基因：htmA2位于基因簇核苷酸序列第25448-47611个碱基处，长度为22164 个碱基对，编码杂合的聚酮合酶与非核糖体肽合成酶，7387个氨基酸； 3)3号基因：htmA3位于基因簇核苷酸序列第47611-61857个碱基处，长度为14247 个碱基对，编码聚酮合酶，4748个氨基酸； 4)4号基因：htmA4位于基因簇核苷酸序列第1-822个碱基处，长度为822个碱基对， 4 CN 111607603 A 说　明　书 2/9 页 编码游离的酮基还原酶，273个氨基酸； 5)5号基因：htmA5位于基因簇核苷酸序列第9823-10578个碱基处，长度为756个碱 基对，编码II型硫酯酶，251个氨基酸； 6)6号基因：htmA6位于基因簇核苷酸序列第79115-80338个碱基处，长度为1221个 碱基对，编码游离的失活酮基合成酶，负责脱羧，407个氨基酸； 7)7号基因：htmA7位于基因簇核苷酸序列第83995-85938个碱基处，长度为1944个 碱基对，编码游离的酰基转移酶，负责延伸单元的转移，647个氨基酸； 8)8号基因：htmA8位于基因簇核苷酸序列第78787-79113个碱基处，长度为327个 碱基对，编码游离的酰基载体蛋白，108个氨基酸； 9)9号基因：htmB1位于基因簇核苷酸序列第61854-69500个碱基处，长度为7647个 碱基对，编码非核糖体肽合成酶，2548个氨基酸； 10)10号基因：htmB2位于基因簇核苷酸序列第69515-78790个碱基处，长度为9276 个碱基对，编码非核糖体肽合成酶，3091个氨基酸。 11)11号基因：htmB3位于基因簇核苷酸序列第2214-3872个碱基处，长度为1659个 碱基对，编码游离的氨酰转移酶，552个氨基酸； 12)12号基因：htmH位于基因簇核苷酸序列第81630-83990个碱基处，长度为2361 个碱基对，编码脱水酶，786个氨基酸； 13)13号基因：htmI1位于基因簇核苷酸序列第934-2217个碱基处，长度为1284个 碱基对，编码异构化酶，427个氨基酸； 14)14号基因：htmI2位于基因簇核苷酸序列第3932-4564个碱基处，长度为633个 碱基对，编码异构化酶，210个氨基酸； 15)15号基因：htmO位于基因簇核苷酸序列第8335-9717个碱基处，长度为1383个 碱基对，编码氨基合酶，460个氨基酸； 16)16号基因：htmP位于基因簇核苷酸序列第86021-87256个碱基处，长度为1236 个碱基对，编码细胞色素P450氧化酶，411个氨基酸； 17)17号基因：htmS位于基因簇核苷酸序列第80359-81642个碱基处，长度为1284 个碱基对，编码羟甲基戊二酸单酰辅酶A合成酶，427个氨基酸； 18)18号基因：htmT位于基因簇核苷酸序列第6346-7692个碱基处，长度为1257个 碱基对，编码糖基转移酶，418个氨基酸； (2)负责调控和转运的3个基因： 19)19号基因：htmR1位于基因簇核苷酸序列第7768-8274个碱基处，长度为507个 碱基对，编码转录调控因子，168个氨基酸； 20)20号基因：htmR2位于基因簇核苷酸序列第88943-89740个碱基处，长度为798 个碱基对，编码LysR家族转录调控因子，265个氨基酸； 21)21号基因：htmK位于基因簇核苷酸序列第89765-91594个碱基处，长度为1830 个碱基对，编码Ser/Thr蛋白激酶，609个氨基酸。 第二方面，本发明提供一种如上述的Hangtaimycin生物合成基因簇的应用，其特 征在于：所述核苷酸序列可利用聚合酶链式反应PCR的方法或包含所述SEQ  ID  NO.1所示序 列的第1-91594位的DNA作为探针，以Southern杂交方法从其它生物体中得到与 5 CN 111607603 A 说　明　书 3/9 页 hangtaimycin生物合基因簇相似的基因。 本发明还提供一种如上述的Hangtaimycin生物合成基因簇的应用，其特征在于： 所述核苷酸序列通过包括体内或体外插入、缺失、置换、突变、与其它来源的同源核苷酸序 列进行重组和定向进化方法产生hangtaimycin新结构衍生物。 本发明还提供一种如上述的Hangtaimycin生物合成基因簇的应用，其特征在于： 所述核苷酸列序列可用于通过合适的异源宿主表达，获得更高产量hangtaimycin及其新结 构衍生物；所述异源宿主包括放线菌、假单孢菌、大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母或植物中任一 种。 本发明还提供一种如上述的Hangtaimycin生物合成基因簇的应用，其特征在于： 利用所述核苷酸列序列转换的氨基酸序列用于特定蛋白的表达及其抗体的制备。 本发明还提供一种如上述的Hangtaimycin生物合成基因簇的应用，其特征在于： 利用所述核苷酸列序列转换的氨基酸序列用于提高特定蛋白的活性、优化蛋白的动力学特 征。 本发明还提供一种如上述的Hangtaimycin生物合成基因簇的应用，其特征在于： 所述生物合成基因簇通过遗传改造产生可用于医药、工业或农业的hangtaimycin新结构衍 生物。 本发明还提供一种如上述的Hangtaimycin生物合成基因簇的应用，其特征在于： 该生物合成基因簇的基因及其蛋白信息用于发现同类化合物、基因或蛋白。 概括来说，本发明的第二个目的是提供hangtaimycin生物合成基因簇的应用，包 括以下几个方面： (1)本发明提供的核苷酸列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶链式反应(PCR)的方 法或包含本发明SEQ  ID  NO.1所示序列的第1-91594位的DNA作为探针，以Southern杂交等 方法从其它生物体中得到与hangtaimycin生物合基因簇相似的基因。 (2)本发明提供的核苷酸列或部分核苷酸序列，可以通过包括但不限于体内或体 外插入、缺失、置换、突变、与其它来源的同源核苷酸序列进行重组和定向进化等方法产生 hangtaimycin新结构衍生物。 (3)本发明提供的核苷酸列或部分核苷酸序列，可以用于通过合适的异源宿主表 达，获得更高产量hangtaimycin及其新结构衍生物，这些异源宿主包括但不限于放线菌、假 单孢菌、大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母、植物等。 (4)本发明所提供的氨基酸序列，可以用于特定蛋白的表达及其抗体的制备。 (5)本发明所提供的氨基酸序列，可以用于提高特定蛋白的活性、优化蛋白的动力 学特征或其它致力于得到的性质。 总之，本发明所提供的包含hangtaimycin生物合成相关的所有基因和蛋白信息， 有助于人们理解hangtaimycin家族天然产物的生物合成机制，以及在此基础上通过遗传改 造产生可用于医药、工业或农业的hangtaimycin新结构衍生物，本发明所提供的基因及其 蛋白信息还可以用于发现同类化合物、基因或蛋白。 本发明的链霉菌Streptomyces  spectabilis  CCTCC  M2017417是已知菌种，公开 于文献：Functional  Analysis  of  Cytochrome  P450s  Involved  in  Streptovaricin  Biosynthesis  and  Generation  of  Anti-MRSA  Analogues .Liu  Y,Chen  X ,Li  Z,Xu  W , 6 CN 111607603 A 说　明　书 4/9 页 Tao,Wu  J,Yang  J,Deng  Z,SunY.ACS  Chem  Biol.2017,12(10):2589-2597。本申请人保证 自申请日起20年内向公众提供该链霉菌Streptomyces  spectabilis  CCTCC  M2017417菌 株。 附图说明： 图1.Hangtaimycin的化学结构式。 图2.Hangtaimycin生物合成基因簇。 图3.Hangtaimycin生物合成基因簇敲除重组质粒。 图4.Hangtaimycin生物合成基因簇敲除示意图。 图5.Hangtaimycin生物合成基因簇敲除验证结果。 图6.Hangtaimycin生物合成基因簇敲除突变株ΔhtmBGC发酵产物HPLC检测结果； (A)突变株ΔhtmBGC，(B)野生型CCTCC  M2017417，(C)Hangtaimycin标准品；*表示在同样条 件下未检测到hangtaimycin。 图7.Hangtaimycin生物合成基因簇敲除突变株ΔhtmBGC发酵产物LC-ESI-HRMS检 测结果；(A)突变株ΔhtmBGC发酵产物中hangtaimycin对应[M H] 抽提和高分辨检测结果， 未检测到hangtaimycin对应产物；(B)野生型CCTCC  M2017417发酵产物中hangtaimycin对 应[M H] (理论值m/z  936.45018)抽提和高分辨检测结果；(C)hangtaimycin标准品[M H] (理论值m/z  936.45018)抽提和高分辨检测结果。 图8.Hangtaimycin的1H核磁共振测试结果。 图9.Hangtaimycin的13C核磁共振测试结果。 图10.Hangtaimycin的1H-1H  COZY的核磁共振测试结果。 图11.Hangtaimycin的HSQC核磁共振测试结果。 图12.Hangtaimycin的HMBC核磁共振测试结果。 图13.Hangtaimycin的1H-1H  ROESY核磁共振测试结果。