技术摘要：
本发明公开了一种冻干保护剂及其应用和冻干苗及其制备方法，所述冻干保护剂各成分配制浓度为：蔗糖10%、右旋糖酐0.5～2.0%、谷氨酸钠1%、KCL1%，或者是蔗糖10%、右旋糖酐1%、海藻糖1~5%、谷氨酸钠1%、KCL1%，配制冻干保护剂的溶剂为注射用水，用10%氢氧化钠溶液调节冻 全部
背景技术：
1970年代中期到1980年代，越来越多的证据显示早期膀胱癌分型之一CIS可以用 免疫药物卡介苗（BCG）治疗。BCG是减毒性疫苗，通过导尿管注入到膀胱内（叫做灌注治疗） 产生免疫反应治疗肿瘤。多项临床试验结果显示，与单独手术比较，内镜切除CIS后接受BCG 治疗可以减少膀胱癌复发风险。随后的试验结果证实，CIS术后接受长期的BCG治疗（叫做维 持治疗）可以减少膀胱癌复发风险、延长CIS患者生存时间。 我国使用卡介苗防治膀胱癌术后复发的临床研究很早就开始。目前，国内市面上 的治疗用卡介苗为用卡介菌经培养后收集菌体，加入稳定剂分装至安瓿瓶中冻干制成的免 疫治疗剂，其中的稳定剂通常含有明胶成分，相关研究表明：明胶或明胶衍生物能直接引起 使用者发生过敏等变态反应。为了减轻或避免治疗用卡介苗在使用过程中出现的由明胶引 起的不良反应，因此，可以使用明胶替代品或直接生产不含明胶的治疗用卡介苗冻干制品。 国家药典委员会在2007年7月17日至7月19日北京会议纪要中明确要求“作为稳定 剂成分的明胶注射到人体后可发生过敏反应，生产企业应进行取代明胶成分的相关研究工 作，以进一步提高制品的安全性”。国产明胶内毒素含量偏高，而进口明胶有携带疯牛病病 毒的潜在风险，针对这一问题，需研究一系列明胶的替代品来改进传统的配方。 现有专利文献CN101537186A（一种不含明胶的疫苗冻干保护剂，2009.09.23）公开 了一种用作疫苗冻干保护剂的组合物，该组合物包括蔗糖、海藻糖、右旋糖酐70、谷氨酸钠、 尿素以及精氨酸，并且所述组合物中不含有明胶。可用于提高冻干疫苗的稳定性和安全性。 现有专利文献CN102657870A（一种无明胶及人血蛋白成分的疫苗冻干保护剂， 2012.09.12）一种由右旋糖酐40、蔗糖、乳糖、甘露醇、甘氨酸、精氨酸、谷氨酸钠、尿素、199 综合培养基等物质构成的保护剂，不含动物源性组分，疫苗的内毒素含量大幅降低，极大地 降低了对人体的刺激性及危害性，且赋予了疫苗更好的安全性、稳定性。 现有专利文献CN104117070A（一种含山梨醇成分的水痘疫苗冻干保护剂， 2014.10.29）公开了一种含有山梨醇、人血清白蛋白、蔗糖、右旋糖酐、海藻糖、精氨酸、谷氨 酸钠和尿素的保护剂，无明胶成分，且去除了动物源性成分，使疫苗内毒素含量明显降低， 有效提高了水痘疫苗的稳定性和安全性。 现有专利文献CN104826101A（冻干人用狂犬疫苗及其制备方法，2015.08.12）公开 了一种由海藻糖、谷氨酸钠、尿素、L-精氨酸、199培养基等组成的疫苗冻干保护剂，该疫苗 冻干保护剂中不含有明胶、人血白蛋白和右旋糖酐。大幅度提高了疫苗的质量和产量，降低 了疫苗内杂质的含量，不易发生过敏等反应，极大地提高了疫苗的安全性。 现有专利文献CN105267971A（一种不含明胶和人血白蛋白的疫苗冻干保护剂， 3 CN 111588859 A 说 明 书 2/13 页 2016.01.27）公开了一种以199培养液或PBS缓冲溶液或注射用水为基质液，采用蔗糖、右旋 糖酐、山梨醇、谷氨酸钠、L-精氨酸配制而成的保护剂。该保护剂中不含明胶和人血清白蛋 白，可以提高疫苗在冻干过程和储存过程中的稳定性，同时还能提高冻干疫苗对人体的安 全性，减少了疫苗的不良反应。 由上述现有技术可以知道，在预防性疫苗制品中，由于不含明胶的保护剂能够降 低对人体的刺激性，目前已被广泛推广和应用在各类疫苗制品中，但是对菌体的保护效果 还有待提高，特别是作为治疗用卡介苗而言，由于是采用活菌生物制剂，因此，加强卡介菌 在冻干过程和储存过程中的稳定性以保证临床用药质量尤其重要。因此，本领域中急需一 种安全有效的无明胶的治疗用卡介苗冻干保护剂。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种冻干保护剂及其应用，该冻干保护剂不含明胶，在制 备冻干治疗用卡介苗时使用，可使内毒素含量下降，不易发生过敏反应，并且仍然能保持较 高的稳定性和较长的有效期。 本发明还提供了一种冻干苗及其制备方法，采用上述冻干保护剂制备得到治疗用 卡介苗冻干产品，较同类产品而言具有相同的有效性，且不易发生过敏反应，安全性更高。 本发明通过下述技术方案实现：一种冻干保护剂，所述冻干保护剂各成分配制浓 度为：蔗糖10%、右旋糖酐0.5～2.0%、谷氨酸钠1%、KCL1%，配制冻干保护剂的溶剂为注射用 水，用10%氢氧化钠溶液调节冻干保护剂的pH值为7.3～7.5。 所述冻干保护剂各成分配制浓度为：蔗糖10%、右旋糖酐1%、谷氨酸钠1%、KCL1%。 所述右旋糖酐为右旋糖酐40。 本发明还提供了一种冻干保护剂，所述冻干保护剂各成分配制浓度为：蔗糖10%、 右旋糖酐1%、海藻糖1～5%、谷氨酸钠1%、KCL1%，配制冻干保护剂的溶剂为注射用水，用10% 氢氧化钠溶液调节冻干保护剂的pH值为7.3～7.5。 该冻干保护剂中海藻糖配制浓度可以为：1%、2%、3%、4%或5%。右旋糖酐可以为右旋 糖酐40。 本发明还提供了上述冻干保护剂在制备冻干治疗用卡介苗中的应用。 一种制备冻干苗的方法，包括以下步骤： （1）向治疗用卡介苗菌体中加入权利要求1或4任一项所述冻干保护剂，以制成治疗用 卡介苗原液； （2）向步骤（1）所述治疗用卡介苗原液中加入稀释液，以配制得到治疗用卡介苗半成 品； （3）将步骤（2）所述治疗用卡介苗半成品经冻干处理后制得治疗用卡介苗冻干产品。 所述步骤（2）中，稀释液含有与冻干保护剂相同的成分，且各成分的浓度相同。 所述步骤（2）中，治疗用卡介苗半成品中各成分的终浓度为：蔗糖10%、右旋糖酐 0.5～2.0%、谷氨酸钠1%、KCL1%，或者终浓度为：蔗糖10%、右旋糖酐1%、海藻糖1~5%、谷氨酸 钠1%、KCL1%。 所述步骤（2）中，卡介苗半成品的浓度为120mg/ml。 所述步骤（3）中，所述冻干处理时满足以下条件： 4 CN 111588859 A 说 明 书 3/13 页 预冻阶段：最低温度≤-40℃，达到最低温度后维持2~3小时； 升华干燥阶段：最终温度-15～ -10℃，达到最终温度的时间为8～14小时，真空压力控 制在8～10Pa； 解吸干燥阶段：最终温度34～37℃，真空压力控制在0.5～10Pa，运行15～22小时。 一种冻干苗，采用上述方法制得的治疗用卡介苗冻干产品。 本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果： （1）本发明提供了一种治疗用卡介苗的冻干保护剂，该冻干保护剂采用蔗糖、右旋糖 酐、谷氨酸钠、KCL配制而成，或者是蔗糖、右旋糖酐、海藻糖、谷氨酸钠、KCL配制而成，能够 合理替代含有明胶的同类保护剂在治疗用卡介苗冻干产品中的应用，不仅能达到同类保护 剂相同的有效性，还具有更高的安全性。 （2）本发明涉及的冻干保护剂成分中，由于不含有明胶，不易引发过敏反应，如发 热、恶心等，制品的安全性更高，减少了不良反应。 （3）本发明制备得到的治疗用卡介苗冻干产品的质量远高于《中国药典》三部要求 的标准，经试验证明，本发明涉及的治疗用卡介苗活菌数的质量均高于《中国药典》三部要 求不低于1.0*106CFU/mg的标准；热稳定性试验结果表明活菌率的质量均高于《中国药典》 三部要求不低于25%，且不低于2.5*105CFU/mg的标准。 （4）本发明制备得到的治疗用卡介苗冻干产品具有更高的安全性，经试验证明，其 水分含量低于2.0%，高于《中国药典》三部要求不高于3.0%的质量标准。 （5）本发明针对治疗用卡介苗的冻干程序，采用特定的冻干曲线，通过预冻、升华 干燥以及解吸干燥各阶段中的参数控制，可使得治疗用卡介苗冻干成型好，且冻干成品符 合《中国药典》三部要求。
本发明公开了一种冻干保护剂及其应用和冻干苗及其制备方法，所述冻干保护剂各成分配制浓度为：蔗糖10%、右旋糖酐0.5～2.0%、谷氨酸钠1%、KCL1%，或者是蔗糖10%、右旋糖酐1%、海藻糖1~5%、谷氨酸钠1%、KCL1%，配制冻干保护剂的溶剂为注射用水，用10%氢氧化钠溶液调节冻 全部
背景技术：
1970年代中期到1980年代，越来越多的证据显示早期膀胱癌分型之一CIS可以用 免疫药物卡介苗（BCG）治疗。BCG是减毒性疫苗，通过导尿管注入到膀胱内（叫做灌注治疗） 产生免疫反应治疗肿瘤。多项临床试验结果显示，与单独手术比较，内镜切除CIS后接受BCG 治疗可以减少膀胱癌复发风险。随后的试验结果证实，CIS术后接受长期的BCG治疗（叫做维 持治疗）可以减少膀胱癌复发风险、延长CIS患者生存时间。 我国使用卡介苗防治膀胱癌术后复发的临床研究很早就开始。目前，国内市面上 的治疗用卡介苗为用卡介菌经培养后收集菌体，加入稳定剂分装至安瓿瓶中冻干制成的免 疫治疗剂，其中的稳定剂通常含有明胶成分，相关研究表明：明胶或明胶衍生物能直接引起 使用者发生过敏等变态反应。为了减轻或避免治疗用卡介苗在使用过程中出现的由明胶引 起的不良反应，因此，可以使用明胶替代品或直接生产不含明胶的治疗用卡介苗冻干制品。 国家药典委员会在2007年7月17日至7月19日北京会议纪要中明确要求“作为稳定 剂成分的明胶注射到人体后可发生过敏反应，生产企业应进行取代明胶成分的相关研究工 作，以进一步提高制品的安全性”。国产明胶内毒素含量偏高，而进口明胶有携带疯牛病病 毒的潜在风险，针对这一问题，需研究一系列明胶的替代品来改进传统的配方。 现有专利文献CN101537186A（一种不含明胶的疫苗冻干保护剂，2009.09.23）公开 了一种用作疫苗冻干保护剂的组合物，该组合物包括蔗糖、海藻糖、右旋糖酐70、谷氨酸钠、 尿素以及精氨酸，并且所述组合物中不含有明胶。可用于提高冻干疫苗的稳定性和安全性。 现有专利文献CN102657870A（一种无明胶及人血蛋白成分的疫苗冻干保护剂， 2012.09.12）一种由右旋糖酐40、蔗糖、乳糖、甘露醇、甘氨酸、精氨酸、谷氨酸钠、尿素、199 综合培养基等物质构成的保护剂，不含动物源性组分，疫苗的内毒素含量大幅降低，极大地 降低了对人体的刺激性及危害性，且赋予了疫苗更好的安全性、稳定性。 现有专利文献CN104117070A（一种含山梨醇成分的水痘疫苗冻干保护剂， 2014.10.29）公开了一种含有山梨醇、人血清白蛋白、蔗糖、右旋糖酐、海藻糖、精氨酸、谷氨 酸钠和尿素的保护剂，无明胶成分，且去除了动物源性成分，使疫苗内毒素含量明显降低， 有效提高了水痘疫苗的稳定性和安全性。 现有专利文献CN104826101A（冻干人用狂犬疫苗及其制备方法，2015.08.12）公开 了一种由海藻糖、谷氨酸钠、尿素、L-精氨酸、199培养基等组成的疫苗冻干保护剂，该疫苗 冻干保护剂中不含有明胶、人血白蛋白和右旋糖酐。大幅度提高了疫苗的质量和产量，降低 了疫苗内杂质的含量，不易发生过敏等反应，极大地提高了疫苗的安全性。 现有专利文献CN105267971A（一种不含明胶和人血白蛋白的疫苗冻干保护剂， 3 CN 111588859 A 说 明 书 2/13 页 2016.01.27）公开了一种以199培养液或PBS缓冲溶液或注射用水为基质液，采用蔗糖、右旋 糖酐、山梨醇、谷氨酸钠、L-精氨酸配制而成的保护剂。该保护剂中不含明胶和人血清白蛋 白，可以提高疫苗在冻干过程和储存过程中的稳定性，同时还能提高冻干疫苗对人体的安 全性，减少了疫苗的不良反应。 由上述现有技术可以知道，在预防性疫苗制品中，由于不含明胶的保护剂能够降 低对人体的刺激性，目前已被广泛推广和应用在各类疫苗制品中，但是对菌体的保护效果 还有待提高，特别是作为治疗用卡介苗而言，由于是采用活菌生物制剂，因此，加强卡介菌 在冻干过程和储存过程中的稳定性以保证临床用药质量尤其重要。因此，本领域中急需一 种安全有效的无明胶的治疗用卡介苗冻干保护剂。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种冻干保护剂及其应用，该冻干保护剂不含明胶，在制 备冻干治疗用卡介苗时使用，可使内毒素含量下降，不易发生过敏反应，并且仍然能保持较 高的稳定性和较长的有效期。 本发明还提供了一种冻干苗及其制备方法，采用上述冻干保护剂制备得到治疗用 卡介苗冻干产品，较同类产品而言具有相同的有效性，且不易发生过敏反应，安全性更高。 本发明通过下述技术方案实现：一种冻干保护剂，所述冻干保护剂各成分配制浓 度为：蔗糖10%、右旋糖酐0.5～2.0%、谷氨酸钠1%、KCL1%，配制冻干保护剂的溶剂为注射用 水，用10%氢氧化钠溶液调节冻干保护剂的pH值为7.3～7.5。 所述冻干保护剂各成分配制浓度为：蔗糖10%、右旋糖酐1%、谷氨酸钠1%、KCL1%。 所述右旋糖酐为右旋糖酐40。 本发明还提供了一种冻干保护剂，所述冻干保护剂各成分配制浓度为：蔗糖10%、 右旋糖酐1%、海藻糖1～5%、谷氨酸钠1%、KCL1%，配制冻干保护剂的溶剂为注射用水，用10% 氢氧化钠溶液调节冻干保护剂的pH值为7.3～7.5。 该冻干保护剂中海藻糖配制浓度可以为：1%、2%、3%、4%或5%。右旋糖酐可以为右旋 糖酐40。 本发明还提供了上述冻干保护剂在制备冻干治疗用卡介苗中的应用。 一种制备冻干苗的方法，包括以下步骤： （1）向治疗用卡介苗菌体中加入权利要求1或4任一项所述冻干保护剂，以制成治疗用 卡介苗原液； （2）向步骤（1）所述治疗用卡介苗原液中加入稀释液，以配制得到治疗用卡介苗半成 品； （3）将步骤（2）所述治疗用卡介苗半成品经冻干处理后制得治疗用卡介苗冻干产品。 所述步骤（2）中，稀释液含有与冻干保护剂相同的成分，且各成分的浓度相同。 所述步骤（2）中，治疗用卡介苗半成品中各成分的终浓度为：蔗糖10%、右旋糖酐 0.5～2.0%、谷氨酸钠1%、KCL1%，或者终浓度为：蔗糖10%、右旋糖酐1%、海藻糖1~5%、谷氨酸 钠1%、KCL1%。 所述步骤（2）中，卡介苗半成品的浓度为120mg/ml。 所述步骤（3）中，所述冻干处理时满足以下条件： 4 CN 111588859 A 说 明 书 3/13 页 预冻阶段：最低温度≤-40℃，达到最低温度后维持2~3小时； 升华干燥阶段：最终温度-15～ -10℃，达到最终温度的时间为8～14小时，真空压力控 制在8～10Pa； 解吸干燥阶段：最终温度34～37℃，真空压力控制在0.5～10Pa，运行15～22小时。 一种冻干苗，采用上述方法制得的治疗用卡介苗冻干产品。 本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果： （1）本发明提供了一种治疗用卡介苗的冻干保护剂，该冻干保护剂采用蔗糖、右旋糖 酐、谷氨酸钠、KCL配制而成，或者是蔗糖、右旋糖酐、海藻糖、谷氨酸钠、KCL配制而成，能够 合理替代含有明胶的同类保护剂在治疗用卡介苗冻干产品中的应用，不仅能达到同类保护 剂相同的有效性，还具有更高的安全性。 （2）本发明涉及的冻干保护剂成分中，由于不含有明胶，不易引发过敏反应，如发 热、恶心等，制品的安全性更高，减少了不良反应。 （3）本发明制备得到的治疗用卡介苗冻干产品的质量远高于《中国药典》三部要求 的标准，经试验证明，本发明涉及的治疗用卡介苗活菌数的质量均高于《中国药典》三部要 求不低于1.0*106CFU/mg的标准；热稳定性试验结果表明活菌率的质量均高于《中国药典》 三部要求不低于25%，且不低于2.5*105CFU/mg的标准。 （4）本发明制备得到的治疗用卡介苗冻干产品具有更高的安全性，经试验证明，其 水分含量低于2.0%，高于《中国药典》三部要求不高于3.0%的质量标准。 （5）本发明针对治疗用卡介苗的冻干程序，采用特定的冻干曲线，通过预冻、升华 干燥以及解吸干燥各阶段中的参数控制，可使得治疗用卡介苗冻干成型好，且冻干成品符 合《中国药典》三部要求。
