技术摘要：
本发明公开了用于早期胰腺肿瘤检测分子标志物、其检测方法及应用，属于生物技术及临床分子诊断药物开发领域。该胰腺癌标志物miRNAs：miR‑30c、miR‑24、miR‑23a和miR‑132。本发明所提供的组合、方法和试剂盒能够用于早期胰腺癌的筛查与鉴别诊断、疾病并发症发生和复 全部
背景技术：
早期胰腺癌通常指肿块直径≤2.0cm，无淋巴结转移，无胰腺被膜和胰周浸润，无 血管和邻近脏器侵犯的胰腺癌，分期属T1aN0M0。但是有学者认为，1.0cm～2.0cm的胰腺癌 大多已发生了淋巴结转移，主张肿瘤直径≤1.0cm为早期胰腺癌的标准。除非病灶恰巧位于 十二指肠乳头处，可以早期出现胆胰管梗阻症状以外，极少有临床症状。另有学者提出，早 期胰腺癌和小胰腺癌的定义有所区别，后者主要是指肿瘤最大直径≤2.0cm，而无论有无淋 巴结转移。因此，早期胰腺癌的诊断，应重点在于高危人群的筛查、分子生物学诊断和探索 新的影像检查手段。 目前临床应用最为广泛的胰腺癌诊断手段，即应用多种影像学方法来鉴别疑似胰 腺癌患者的肿瘤，其中包括腹部B超、计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)、内镜超声 (EUS) 和正电子发射断层扫描(PET)。由于胰腺癌肿瘤所处于人体内脏的深处，在初期没有 明显的临床表现，并且在微小癌灶时期难以用放射成像进行诊断，导致大部分胰腺癌患者 在确诊时已进入晚期，病灶已经转移，患者丧失用手术进行治疗的机会。 考虑到影像检测手段的局限性，研究者们开始思考是否可以利用人体体内的某些 生物分子作为诊断靶标，从而提高诊断的特异性。因此在近些年，人们热衷于开发新型生物 标志物。关于胰腺癌的生物标志物的研究也有很多，但是很少能被证明是有效的检测早期 胰腺癌。目前，碳水化合物类抗原19-9(CA 19-9)是应用最广泛的胰腺癌生物标志物。然而， 由于 CA19-9、CA125、CA50、TIMP-1、及CEA对胰腺癌的诊断敏感性和特异性都较低(都在 30 ～40％和60％左右)，因此它们并不是筛查和早期检测胰腺癌的最佳诊断标，其主要临床应 用是作为监测病情进展和治疗反应的标志物。 现有技术中CN101942502A和发明人的在先申请CN109423519A虽然公开了采用微 小核糖核酸作为检测临床早期胰腺癌诊断的用途，但现有技术中都是用单一检测指标来判 断，并且所发明的单一miRNAs并不是最灵敏的，不是最能反映临床病人体内实际情况的，缺 乏综合考虑每种miRNAs个体化临床上表征，有可能导致其产品检测结果不能真实反映病人 实际状况，造成漏诊和误诊。 传统的miRNA的检测技术主要是Northern Blotting印迹法、微阵列、原位杂交 (ISH)和核酸扩增技术。如今，尽管在开发miRNA检测技术的研究方面已经取得许多进展，但 是仍然存在以下的问题亟待解决： 1)目前，虽然已经报道了许多种miRNA检测方法，但可商业化且推广至临床的技术 主要还是PCR。但是普通的RT-PCR并无法达到实际所要求的高灵敏度、准确性以及特异性， 并且面对临床大规模样品，如何实现快速且大批量检测是技术难点； 5 CN 111575374 A 说 明 书 2/18 页 2)通常一个miRNA可以同时调控多种功能，与多种疾病息息相关。因此，开发可同 时检测多种目的miRNA的高通量检测技术是非常重要的； 3)目前在临床中经常以血液作为检测样品，进行体外miRNA分析。这一般需要从血 清中提取和分离miRNA，但其中miRNA的含量较低，并且容易出现RNA降解的情况，因此有必 要进一步开发一种可以提供高质量miRNA样品的RNA提取技术。 因此，开发高效、灵敏的miRNA及检测方法对于胰腺癌的早期诊断、治疗及预后具 有非常重要的意义。
技术实现要素：
针对目前胰腺癌早期诊断困难及现有的生物标志物敏感性和特异性较低的问题， 本发明提供了一组血清中miRNAs差异性表达筛查和检测胰腺癌的新方法以及早期胰腺肿 瘤分子标志物的新用途。 本发明的发明构思是：miRNA是由非蛋白质编码的小RNA组成的长度为18-24个的 核苷酸，涉及通过降解靶调节mRNA或多肽来实现多基因表达或抑制，从而调节各种肿瘤过 程，包括细胞增殖，迁移，侵袭，存活和转移。由于miRNA的异常表达体现在胰腺癌的发病过 程中的各个阶段，而且在分子水平上的表达量都是不同的。所以按照不同病理类型miRNA的 差异表达，用来检测各个阶段特征疾病，是一个具有极好的敏感性和特异性地区分患者患 有胰腺良性疾病还是胰腺癌的技术手段。 为实现上述目的，本发明请求保护的胰腺癌标志物miRNAs分别为：miR-30c、miR- 24、 miR-23a和miR-132。 所述miR-30c，包括hsa-miR-30c-5p；miR-24包括hsa-miR-24-3p；miR-23a包括 hsa-miR-23a-3p；miR-132包括hsa-miR-132-3p。 上述miRNAs引物及探针序列为： 6 CN 111575374 A 说 明 书 3/18 页 本发明另一个目的是请求保护分别含有上述miRNAs中任一个或2～4个组合的核 心诊断组合。 所述组合包括： 组合1：miR-24/miR-23a/miR-132/miR-30c； 组合2：miR-130/miR-200c/miR-154/miR-30c； 组合3：miR-24/miR-132/miR-1207/let-7i； 组合4：miR-30c/miR-24/miR-59/miR-132； 组合5：miR-130/miR-21/let-7i/miR-30c； 组合6：miR-30c/miR-154/miR-23a/miR-57。 本发明不仅探明用于临床早期胰腺癌诊断最佳组合，而且找到用于胰腺癌病人最 佳临床分类治疗方法。 本发明请求保护上述早期胰腺癌诊断分子标志物的应用，即，上述早期胰腺癌标 志物在试剂盒或以任何其他便捷方法，包括但不限于可携带式检测试纸、数字检测条/卡及 检测仪以及利用任何化学方法修饰以上miRNAs分子的衍生物等上的应用。该试剂盒或其他 7 CN 111575374 A 说 明 书 4/18 页 检测方法包括上述用于检测早期胰腺癌标志物的任何一种miRNAs探针组合。 本发明将多组合联合检测结果结合常规病理结果来综合判断检测准确性，检测精 确度高 (>95％)，而现有技术中仅采用单一检测指标(单个微小核糖核酸来判断，并且现有 技术中的miRNAs并不是最灵敏的，缺乏综合考虑个体化临床特点，有可能导致产品检测结 果不能真实反映病人实际状况。 本发明另一个目的请求保护利用上述miRNAs早期筛查、精准用药检测方法。在本 发明筛选出一组在胰腺癌患者中异常高表达的miRNAs的基础上，将其作为胰腺癌早期检测 的候选标志物。在检测过程中，考虑到成本和操作的便捷，本发明采用应用广泛的TaqMan探 针法实时荧光定量PCR技术。与SYBR Green I染料法相比，TaqMan探针法在特异性和灵敏度 方面更有优势。鉴于人血清中miRNA含量较低，提高检测的特异性是一大难题。为了提高检 测特异性避免假阳性结果，发明人根据Taqman探针技术原理，自主设计了目标miRNAs的特 异性探针及引物；其次，为了减少普通Taqman探针检测中内参和靶标分开检测引起的误差， 本发明采用多重探针技术，将内参(U6)与目标miRNA在同一体系中进行反应，这样不仅大大 减少操作误差，还一定程度上避免了临床样本稀少给检测带来的不便。由于目前市面上没 有已成熟的多重Taqman探针检测血清中miRNA的试剂体系，我们花费了大量时间和精力将 市面上现有的RNA提取、逆转录及PCR试剂体系进行优化，并通过不同的样本类型反复测试， 以建立一套稳定的标准检测体系(SOP)。 本发明所述miRNAs早期筛查、精准用药检测体系构建方法的具体步骤为： S1.筛选胰腺癌miRNA，根据TaqMan探针技术原理，设计目标miRNA的特异性探针及 引物；将U6或hsa-miR-16或hsa-miR-159a内参与目标miRNA在同一体系中进行反应； S2.miRNA提取技术优化 S2.1确定提取试剂，根据分离试剂盒对测试样品提取的miRNA质量，筛选出最佳提 取试剂为TRIzol LS Reagent； S2 .2优化提取过程中的影响因素，影响miRNA提取质量的因素主要有：裂解液用 量、氯仿用量、异丙醇用量以及离心条件等，采用TRIzol LS Reagent试剂盒考察不同异丙 醇用量以及离心条件对提取miRNA质量的影响，设计三种细节优化方案； S2.3对TRIzol LS常规提取方式按照上述三种方案进行细节优化； 根据异丙醇用量、离心时间和用量，设计了三种优化方案及对比方案，方案A与传 统方案的区别在于，离心时间为20min，离心20000g；方案B与传统方案的区别在于，异丙醇 用量为200μL，600μL，800μL；方案C与传统方案的区别在于，异丙醇用量为800μ L，离心时间 为20min，离心20000g。 S3.多重RT-qPCR体系反应程序和反应体系的优化和建立 S3.1反转录的RNA上样量优化 对目标miRNA上样量进行梯度设置，确定反转录的RNA最佳上样量为50ng； S3.2 PCR扩增反应试剂的优化 分别采用正常人血清及胰腺癌患者血清进行AceQ qPCR Probe Master Mix和 Premix Ex TaqTM对比实验，选取Premix Ex TaqTM作为临床打样本检测的qPCR试剂。 本发明还请求保护采用上述方法构建的检测体系进行临床诊断的方法，具体步骤 为： 8 CN 111575374 A 说 明 书 5/18 页 S1.采集临床样品对符合条件的病例入组 S2.RNA提取 (1)每200ul血清样品中加入600ul TRIzolTM LS室温孵育以充分裂解； (2)向裂解液中加入氯仿，室温孵育；20000g，4℃离心20min，将上层水相移至新的 离心管中； (3)加入800μL异丙醇，室温孵育；12,000×g，4℃离心10min，RNA在管底形成白色 沉淀，移去上清液；再加入75％乙醇重悬清洗沉淀；7500×g，4℃离心5min，去上清液，晾干； 加入ddH2O溶解RNA；测定所提RNA的浓度和质量。 S3.RT-PCR反应程序和反应体系 (1)在0.1ml 8-strip PCR管中配制以下体系吹打混匀，多个样品一起配制再分 装： 将含有miR-30c、miR-24、miR-23a、miR-132中任意一个miR与U6组合，按照表中配 伍比例，先配好工作液，然后，按表中比例加入相应反应试剂，确保总体积为15微升；然后， 进行PCR扩增实验；在PCR扩增仪进行以下程序：16℃30min→42℃30min→85℃ 5min→4℃， 完成后轻微离心至管底。 (2)在02ml PCR管或RNAase-free 15ml EP管中配制以下体系吹打混匀 试剂 用量(μl) cDNA 3 Premix Ex Taq(Probe qPCR)(2×) 5 U6 Forward Primer(10μM) 0.2 U6 Reverse Primer(10μM) 0.2 miRNA Forward Primer(10μM) 0.2 miRNA Reverse Primer(10μM) 0.2 U6 Probe(10μM) 0.4 9 CN 111575374 A 说 明 书 6/18 页 miRNA Probe(10μM) 0.4 RNase-free ddH2O 0.4 总体积 10 采用两步法进行PCR扩增，反应条件为：预变性，1个循环，95℃30秒，PCR反应，40个 循环，95℃5秒，60℃30秒，退火50℃30秒，1个循环。 (3)QuantStudio DX实时荧光定量PCR系统，反应条件为：预变性，1个循环，95℃30 秒，PCR反应，45个循环，95℃5秒和60℃40秒。 S4 .根据用核心诊断组合进行的定量PCR结果，分析生物标志物在病人血样中分 布，判断病人病理状态。 与现有技术相比，本发明的有益效果在于： (1)本发明的miRNAs是经过了系统研究发现、并反复用不同样本、通过多个研究中 心和临床中心验证得出的最有效的生物标志物组合，提出miR-30c、miR-24、miR-23a、miR- 132 作为胰腺癌的诊断生物标志物，为早期胰腺肿瘤分子诊断与精准用药提供了理论支 撑。 (2)针对miRNAs序列短、组织细胞含量低、高度同源性等特点，相应地对检测技术 提出了更高的要求，本发明建立了一种Taqman探针多重实时荧光定量PCR体系来克服以上 问题，达到便捷快速、高度特异性地检测血清样本中多种靶标miRNA的目的，实现可靠区分 早期胰腺癌与胰腺炎病变以及正常人，为胰腺癌的早期检测提供技术支撑，也为miRNA标志 物开发工作提供了新思路。 (3)本发明建立了一种多个组合联合检测，即，6个组合联合检测结果结合常规病 理结果来综合判断检测准确性，检测精确度高(>98％)，该检测方法是建立在国内5个大临 床研究中心近600病例验证基础上最佳的用于临床诊断与精准治疗方法。 10 CN 111575374 A 说 明 书 7/18 页 本发明是基于多种miRNAs在早期胰腺癌细胞中的表达强度差异而开发出来的可 用于早期胰腺癌分子诊断和治疗的生物小分子。本发明提供多种早期胰腺癌标记物组合及 其早期筛查以及精准用药检测方法。本发明所提供的胰腺癌标记物包含受试者血清/血浆 以及唾液中稳定存在且可检测的4种微小核糖核酸组合表达强度。 本发明提供的技术方案不同于现有技术任一种miRNAs及筛查方案，发明人通过临 床多中心验证，综合病人医学背景、BMI(肥胖指数)、生活习惯(饮酒和吸烟)、临床代谢指标 血象以及其在个体及随访个体血象中的变异度，运用大数据综合分析每一种miRNAs对早期 胰腺细胞发生癌变的贡献度进行精度计算，从而选择与现有技术中所公开的不同的灵敏度 高、特异性更强miRNAs，这样通过综合分析每种miRNAs的惩罚指数分析找到的miRNAs最能 反映临床病人体内实际情况。 本发明所提供的组合、方法和试剂盒能够用于早期胰腺癌的筛查与鉴别诊断、疾 病并发症发生和复发的监测、疗效、药效及指导精准用药等方面评价，具有检出谱系广、灵 敏度高、特异性好、检测成本低、取材方便、样本易存放等优点，该方法可广泛用于胰腺癌早 期普查和预后等相关工作，改进单一的标记物或目前临床广泛应用的生物标志物本身的不 稳定性所难以克服的个体差异、所带来的低特异性和低灵敏度，显著提高早期胰腺癌的临 床检出率、降低对胰腺癌误诊率和漏诊率，成为早期胰腺癌诊断的有效手段。 附图说明 图1：TRIzol LS提取过程的优化流程； 图2：qPCR试剂检测结果，其中图2a为Vazyme试剂测试结果，图2b为TAKARA qPCR试 剂测试结果； 图3：为PCR技术检测人血清miRNA拷贝数变化曲线； 图4：为组合1筛查来自正常人、胰腺炎及早期胰腺癌病人血清miRNA拷贝数变化 (*p<0.001) 图5：为组合3和组合4基因在人血清中PCR检测拷贝数变化； 图6：为组合1临床实验结果决策树分析(n＝800)； 图7：为组合1临床实验结果随机森林模型分析(n＝800)。
本发明公开了用于早期胰腺肿瘤检测分子标志物、其检测方法及应用，属于生物技术及临床分子诊断药物开发领域。该胰腺癌标志物miRNAs：miR‑30c、miR‑24、miR‑23a和miR‑132。本发明所提供的组合、方法和试剂盒能够用于早期胰腺癌的筛查与鉴别诊断、疾病并发症发生和复 全部
背景技术：
早期胰腺癌通常指肿块直径≤2.0cm，无淋巴结转移，无胰腺被膜和胰周浸润，无 血管和邻近脏器侵犯的胰腺癌，分期属T1aN0M0。但是有学者认为，1.0cm～2.0cm的胰腺癌 大多已发生了淋巴结转移，主张肿瘤直径≤1.0cm为早期胰腺癌的标准。除非病灶恰巧位于 十二指肠乳头处，可以早期出现胆胰管梗阻症状以外，极少有临床症状。另有学者提出，早 期胰腺癌和小胰腺癌的定义有所区别，后者主要是指肿瘤最大直径≤2.0cm，而无论有无淋 巴结转移。因此，早期胰腺癌的诊断，应重点在于高危人群的筛查、分子生物学诊断和探索 新的影像检查手段。 目前临床应用最为广泛的胰腺癌诊断手段，即应用多种影像学方法来鉴别疑似胰 腺癌患者的肿瘤，其中包括腹部B超、计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)、内镜超声 (EUS) 和正电子发射断层扫描(PET)。由于胰腺癌肿瘤所处于人体内脏的深处，在初期没有 明显的临床表现，并且在微小癌灶时期难以用放射成像进行诊断，导致大部分胰腺癌患者 在确诊时已进入晚期，病灶已经转移，患者丧失用手术进行治疗的机会。 考虑到影像检测手段的局限性，研究者们开始思考是否可以利用人体体内的某些 生物分子作为诊断靶标，从而提高诊断的特异性。因此在近些年，人们热衷于开发新型生物 标志物。关于胰腺癌的生物标志物的研究也有很多，但是很少能被证明是有效的检测早期 胰腺癌。目前，碳水化合物类抗原19-9(CA 19-9)是应用最广泛的胰腺癌生物标志物。然而， 由于 CA19-9、CA125、CA50、TIMP-1、及CEA对胰腺癌的诊断敏感性和特异性都较低(都在 30 ～40％和60％左右)，因此它们并不是筛查和早期检测胰腺癌的最佳诊断标，其主要临床应 用是作为监测病情进展和治疗反应的标志物。 现有技术中CN101942502A和发明人的在先申请CN109423519A虽然公开了采用微 小核糖核酸作为检测临床早期胰腺癌诊断的用途，但现有技术中都是用单一检测指标来判 断，并且所发明的单一miRNAs并不是最灵敏的，不是最能反映临床病人体内实际情况的，缺 乏综合考虑每种miRNAs个体化临床上表征，有可能导致其产品检测结果不能真实反映病人 实际状况，造成漏诊和误诊。 传统的miRNA的检测技术主要是Northern Blotting印迹法、微阵列、原位杂交 (ISH)和核酸扩增技术。如今，尽管在开发miRNA检测技术的研究方面已经取得许多进展，但 是仍然存在以下的问题亟待解决： 1)目前，虽然已经报道了许多种miRNA检测方法，但可商业化且推广至临床的技术 主要还是PCR。但是普通的RT-PCR并无法达到实际所要求的高灵敏度、准确性以及特异性， 并且面对临床大规模样品，如何实现快速且大批量检测是技术难点； 5 CN 111575374 A 说 明 书 2/18 页 2)通常一个miRNA可以同时调控多种功能，与多种疾病息息相关。因此，开发可同 时检测多种目的miRNA的高通量检测技术是非常重要的； 3)目前在临床中经常以血液作为检测样品，进行体外miRNA分析。这一般需要从血 清中提取和分离miRNA，但其中miRNA的含量较低，并且容易出现RNA降解的情况，因此有必 要进一步开发一种可以提供高质量miRNA样品的RNA提取技术。 因此，开发高效、灵敏的miRNA及检测方法对于胰腺癌的早期诊断、治疗及预后具 有非常重要的意义。
技术实现要素：
针对目前胰腺癌早期诊断困难及现有的生物标志物敏感性和特异性较低的问题， 本发明提供了一组血清中miRNAs差异性表达筛查和检测胰腺癌的新方法以及早期胰腺肿 瘤分子标志物的新用途。 本发明的发明构思是：miRNA是由非蛋白质编码的小RNA组成的长度为18-24个的 核苷酸，涉及通过降解靶调节mRNA或多肽来实现多基因表达或抑制，从而调节各种肿瘤过 程，包括细胞增殖，迁移，侵袭，存活和转移。由于miRNA的异常表达体现在胰腺癌的发病过 程中的各个阶段，而且在分子水平上的表达量都是不同的。所以按照不同病理类型miRNA的 差异表达，用来检测各个阶段特征疾病，是一个具有极好的敏感性和特异性地区分患者患 有胰腺良性疾病还是胰腺癌的技术手段。 为实现上述目的，本发明请求保护的胰腺癌标志物miRNAs分别为：miR-30c、miR- 24、 miR-23a和miR-132。 所述miR-30c，包括hsa-miR-30c-5p；miR-24包括hsa-miR-24-3p；miR-23a包括 hsa-miR-23a-3p；miR-132包括hsa-miR-132-3p。 上述miRNAs引物及探针序列为： 6 CN 111575374 A 说 明 书 3/18 页 本发明另一个目的是请求保护分别含有上述miRNAs中任一个或2～4个组合的核 心诊断组合。 所述组合包括： 组合1：miR-24/miR-23a/miR-132/miR-30c； 组合2：miR-130/miR-200c/miR-154/miR-30c； 组合3：miR-24/miR-132/miR-1207/let-7i； 组合4：miR-30c/miR-24/miR-59/miR-132； 组合5：miR-130/miR-21/let-7i/miR-30c； 组合6：miR-30c/miR-154/miR-23a/miR-57。 本发明不仅探明用于临床早期胰腺癌诊断最佳组合，而且找到用于胰腺癌病人最 佳临床分类治疗方法。 本发明请求保护上述早期胰腺癌诊断分子标志物的应用，即，上述早期胰腺癌标 志物在试剂盒或以任何其他便捷方法，包括但不限于可携带式检测试纸、数字检测条/卡及 检测仪以及利用任何化学方法修饰以上miRNAs分子的衍生物等上的应用。该试剂盒或其他 7 CN 111575374 A 说 明 书 4/18 页 检测方法包括上述用于检测早期胰腺癌标志物的任何一种miRNAs探针组合。 本发明将多组合联合检测结果结合常规病理结果来综合判断检测准确性，检测精 确度高 (>95％)，而现有技术中仅采用单一检测指标(单个微小核糖核酸来判断，并且现有 技术中的miRNAs并不是最灵敏的，缺乏综合考虑个体化临床特点，有可能导致产品检测结 果不能真实反映病人实际状况。 本发明另一个目的请求保护利用上述miRNAs早期筛查、精准用药检测方法。在本 发明筛选出一组在胰腺癌患者中异常高表达的miRNAs的基础上，将其作为胰腺癌早期检测 的候选标志物。在检测过程中，考虑到成本和操作的便捷，本发明采用应用广泛的TaqMan探 针法实时荧光定量PCR技术。与SYBR Green I染料法相比，TaqMan探针法在特异性和灵敏度 方面更有优势。鉴于人血清中miRNA含量较低，提高检测的特异性是一大难题。为了提高检 测特异性避免假阳性结果，发明人根据Taqman探针技术原理，自主设计了目标miRNAs的特 异性探针及引物；其次，为了减少普通Taqman探针检测中内参和靶标分开检测引起的误差， 本发明采用多重探针技术，将内参(U6)与目标miRNA在同一体系中进行反应，这样不仅大大 减少操作误差，还一定程度上避免了临床样本稀少给检测带来的不便。由于目前市面上没 有已成熟的多重Taqman探针检测血清中miRNA的试剂体系，我们花费了大量时间和精力将 市面上现有的RNA提取、逆转录及PCR试剂体系进行优化，并通过不同的样本类型反复测试， 以建立一套稳定的标准检测体系(SOP)。 本发明所述miRNAs早期筛查、精准用药检测体系构建方法的具体步骤为： S1.筛选胰腺癌miRNA，根据TaqMan探针技术原理，设计目标miRNA的特异性探针及 引物；将U6或hsa-miR-16或hsa-miR-159a内参与目标miRNA在同一体系中进行反应； S2.miRNA提取技术优化 S2.1确定提取试剂，根据分离试剂盒对测试样品提取的miRNA质量，筛选出最佳提 取试剂为TRIzol LS Reagent； S2 .2优化提取过程中的影响因素，影响miRNA提取质量的因素主要有：裂解液用 量、氯仿用量、异丙醇用量以及离心条件等，采用TRIzol LS Reagent试剂盒考察不同异丙 醇用量以及离心条件对提取miRNA质量的影响，设计三种细节优化方案； S2.3对TRIzol LS常规提取方式按照上述三种方案进行细节优化； 根据异丙醇用量、离心时间和用量，设计了三种优化方案及对比方案，方案A与传 统方案的区别在于，离心时间为20min，离心20000g；方案B与传统方案的区别在于，异丙醇 用量为200μL，600μL，800μL；方案C与传统方案的区别在于，异丙醇用量为800μ L，离心时间 为20min，离心20000g。 S3.多重RT-qPCR体系反应程序和反应体系的优化和建立 S3.1反转录的RNA上样量优化 对目标miRNA上样量进行梯度设置，确定反转录的RNA最佳上样量为50ng； S3.2 PCR扩增反应试剂的优化 分别采用正常人血清及胰腺癌患者血清进行AceQ qPCR Probe Master Mix和 Premix Ex TaqTM对比实验，选取Premix Ex TaqTM作为临床打样本检测的qPCR试剂。 本发明还请求保护采用上述方法构建的检测体系进行临床诊断的方法，具体步骤 为： 8 CN 111575374 A 说 明 书 5/18 页 S1.采集临床样品对符合条件的病例入组 S2.RNA提取 (1)每200ul血清样品中加入600ul TRIzolTM LS室温孵育以充分裂解； (2)向裂解液中加入氯仿，室温孵育；20000g，4℃离心20min，将上层水相移至新的 离心管中； (3)加入800μL异丙醇，室温孵育；12,000×g，4℃离心10min，RNA在管底形成白色 沉淀，移去上清液；再加入75％乙醇重悬清洗沉淀；7500×g，4℃离心5min，去上清液，晾干； 加入ddH2O溶解RNA；测定所提RNA的浓度和质量。 S3.RT-PCR反应程序和反应体系 (1)在0.1ml 8-strip PCR管中配制以下体系吹打混匀，多个样品一起配制再分 装： 将含有miR-30c、miR-24、miR-23a、miR-132中任意一个miR与U6组合，按照表中配 伍比例，先配好工作液，然后，按表中比例加入相应反应试剂，确保总体积为15微升；然后， 进行PCR扩增实验；在PCR扩增仪进行以下程序：16℃30min→42℃30min→85℃ 5min→4℃， 完成后轻微离心至管底。 (2)在02ml PCR管或RNAase-free 15ml EP管中配制以下体系吹打混匀 试剂 用量(μl) cDNA 3 Premix Ex Taq(Probe qPCR)(2×) 5 U6 Forward Primer(10μM) 0.2 U6 Reverse Primer(10μM) 0.2 miRNA Forward Primer(10μM) 0.2 miRNA Reverse Primer(10μM) 0.2 U6 Probe(10μM) 0.4 9 CN 111575374 A 说 明 书 6/18 页 miRNA Probe(10μM) 0.4 RNase-free ddH2O 0.4 总体积 10 采用两步法进行PCR扩增，反应条件为：预变性，1个循环，95℃30秒，PCR反应，40个 循环，95℃5秒，60℃30秒，退火50℃30秒，1个循环。 (3)QuantStudio DX实时荧光定量PCR系统，反应条件为：预变性，1个循环，95℃30 秒，PCR反应，45个循环，95℃5秒和60℃40秒。 S4 .根据用核心诊断组合进行的定量PCR结果，分析生物标志物在病人血样中分 布，判断病人病理状态。 与现有技术相比，本发明的有益效果在于： (1)本发明的miRNAs是经过了系统研究发现、并反复用不同样本、通过多个研究中 心和临床中心验证得出的最有效的生物标志物组合，提出miR-30c、miR-24、miR-23a、miR- 132 作为胰腺癌的诊断生物标志物，为早期胰腺肿瘤分子诊断与精准用药提供了理论支 撑。 (2)针对miRNAs序列短、组织细胞含量低、高度同源性等特点，相应地对检测技术 提出了更高的要求，本发明建立了一种Taqman探针多重实时荧光定量PCR体系来克服以上 问题，达到便捷快速、高度特异性地检测血清样本中多种靶标miRNA的目的，实现可靠区分 早期胰腺癌与胰腺炎病变以及正常人，为胰腺癌的早期检测提供技术支撑，也为miRNA标志 物开发工作提供了新思路。 (3)本发明建立了一种多个组合联合检测，即，6个组合联合检测结果结合常规病 理结果来综合判断检测准确性，检测精确度高(>98％)，该检测方法是建立在国内5个大临 床研究中心近600病例验证基础上最佳的用于临床诊断与精准治疗方法。 10 CN 111575374 A 说 明 书 7/18 页 本发明是基于多种miRNAs在早期胰腺癌细胞中的表达强度差异而开发出来的可 用于早期胰腺癌分子诊断和治疗的生物小分子。本发明提供多种早期胰腺癌标记物组合及 其早期筛查以及精准用药检测方法。本发明所提供的胰腺癌标记物包含受试者血清/血浆 以及唾液中稳定存在且可检测的4种微小核糖核酸组合表达强度。 本发明提供的技术方案不同于现有技术任一种miRNAs及筛查方案，发明人通过临 床多中心验证，综合病人医学背景、BMI(肥胖指数)、生活习惯(饮酒和吸烟)、临床代谢指标 血象以及其在个体及随访个体血象中的变异度，运用大数据综合分析每一种miRNAs对早期 胰腺细胞发生癌变的贡献度进行精度计算，从而选择与现有技术中所公开的不同的灵敏度 高、特异性更强miRNAs，这样通过综合分析每种miRNAs的惩罚指数分析找到的miRNAs最能 反映临床病人体内实际情况。 本发明所提供的组合、方法和试剂盒能够用于早期胰腺癌的筛查与鉴别诊断、疾 病并发症发生和复发的监测、疗效、药效及指导精准用药等方面评价，具有检出谱系广、灵 敏度高、特异性好、检测成本低、取材方便、样本易存放等优点，该方法可广泛用于胰腺癌早 期普查和预后等相关工作，改进单一的标记物或目前临床广泛应用的生物标志物本身的不 稳定性所难以克服的个体差异、所带来的低特异性和低灵敏度，显著提高早期胰腺癌的临 床检出率、降低对胰腺癌误诊率和漏诊率，成为早期胰腺癌诊断的有效手段。 附图说明 图1：TRIzol LS提取过程的优化流程； 图2：qPCR试剂检测结果，其中图2a为Vazyme试剂测试结果，图2b为TAKARA qPCR试 剂测试结果； 图3：为PCR技术检测人血清miRNA拷贝数变化曲线； 图4：为组合1筛查来自正常人、胰腺炎及早期胰腺癌病人血清miRNA拷贝数变化 (*p<0.001) 图5：为组合3和组合4基因在人血清中PCR检测拷贝数变化； 图6：为组合1临床实验结果决策树分析(n＝800)； 图7：为组合1临床实验结果随机森林模型分析(n＝800)。
