技术摘要：
本发明公开了一种酶‑金属核苷酸复合物及其可控构建方法与应用，属于催化剂领域。该方法包括：将核苷酸盐、金属盐及酶加入水中，得到混合液，搅拌反应，离心取沉淀，得到酶‑金属离子核苷酸复合物；将酶‑金属离子核苷酸复合物加入水中，分散均匀，得到分散液；将还原  全部
背景技术：
无机金属催化剂与生物催化剂相耦合所构建的多功能高效催化剂，在生物医药、 化工制造、医学检测等领域具有巨大的应用前景。多功能催化剂可实现一锅法催化级联反 应，减少反应步骤，降低中间产物的分离纯化，有望提高催化效率，同时降低能耗，减少污 染，有利于发展绿色化工生产。同时，金属催化剂与生物催化剂子在纳米尺度下的耦合，有 望带来催化特性的协同，增强其功能，提高杂化催化剂的催化效率，拓展酶在生产应用中的 潜力和范围。 已有的蛋白-金属复合催化剂的构建方法主要分为两类。一类是先合成金属纳米 颗粒，再将金属纳米颗粒和酶分子同时负载到一个惰性载体上，容易造成金属纳米颗粒的 团聚以及金属纳米颗粒与酶催化剂在物理空间上的分离，无法利用其纳米效应。近年来，利 用蛋白分子吸附金属离子，实现其还原，可获得具有高度分散的金属纳米颗粒。专利 CN106729713ASSSS在蛋白的碱性水溶液条件下实现对金属离子的还原，获得金属纳米颗 粒-蛋白复合物，然而上述工作中，所使用的蛋白没有催化活性，而仅仅将蛋白作为载体。文 献（Nature  Catalysis ,  DOI:  10.1038/s41929-019-0305-8）对酶进行化学修饰，获得在有 机相中具有良好分散性的酶复合物，再将金属离子溶液加入到含醇和高分子-酶复合物中， 实现了对金属纳米颗粒的尺寸调控。然而其所使用的醇类主要为甲醇或乙醇等容易造成酶 失活的极性有机溶剂，对不耐受有机溶剂的酶分子不适用。
技术实现要素：
为了克服现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种酶-金属核苷酸复 合物及其可控构建方法与应用。 本发明的目的在于提供一种酶-金属核苷酸复合催化剂及其可控制备的方法。 该方法利用金属离子与核苷酸在水溶液中自组装形成的配位化合物作为酶和金 属纳米颗粒的载体以及金属纳米颗粒的制备前体，使均匀分散在配位网络中的部分金属离 子原位还原，得到金属纳米颗粒均匀分散的酶-金属核苷酸复合催化剂。该方法制备条件温 和简便，所构建的酶-金属核苷酸复合催化剂在药物生产和医学检测治疗领域具有广阔的 应用前景。 本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。 本发明提供的酶-金属核苷酸复合催化剂是一种以金属离子-核苷酸配位化合物 负载的酶-金属纳米颗粒复合催化剂。所述金属离子-核苷酸配位化合物中的蛋白含量为 0.1%-5%。所述酶-金属核苷酸复合催化剂中金属纳米颗粒的负载量为2%-10%，所述金属纳 米颗粒在复合催化剂中分散性良好，粒径分布在2-20  nm之间。 3 CN 111569943 A 说　明　书 2/8 页 本发明提供的一种酶-金属核苷酸复合催化剂的制备方法，包括如下步骤： （1）酶-金属离子核苷酸复合物的制备：将核苷酸盐、金属盐及酶加入水中，搅拌反应， 离心取沉淀，得到酶-金属离子核苷酸复合物； （2）将步骤（1）所述酶-金属离子核苷酸复合物加入水中，分散均匀，得到分散液；将还 原剂加入所述分散液中，搅拌反应（还原反应），离心洗涤，取沉淀，冷冻干燥，得到所述酶- 金属核苷酸复合催化剂。 进一步地，步骤（1）所述核苷酸盐与金属盐的终摩尔浓度比（mM:mM）为0.1-5:1；所 述核苷酸盐为5'-单磷酸胞苷二钠（CMP）、二磷酸胞苷、三磷酸胞苷、5'-单磷酸腺苷二钠 （AMP）、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷、5'-单磷酸鸟苷二钠（GMP）、二磷酸鸟苷及三磷酸鸟苷中的 一种以上；所述金属盐为氯化铜、硫酸铜、醋酸钯、氯钯酸钠、硝酸银及四氯金酸中的一种以 上。 所述核苷酸为含有核苷基团和磷酸基团的核苷酸及其类似物。 进一步地，步骤（1）所述核苷酸盐与金属盐的终摩尔浓度比（mM:mM）为5-0.1:1。 优选地，在步骤（1）所述混合液中，核苷酸盐的终摩尔浓度为5-100mM。 优选地，步骤（1）所述核苷酸盐与金属盐的终摩尔浓度比（mM:mM）为5:3-1:3。 进一步优选地，步骤（1）所述核苷酸盐与金属盐的终摩尔浓度比（mM:mM）为5:3 ,  4:3,  3:3,  2:3,  1:3。 进一步地，步骤（1）所述酶的终质量浓度（mg/mL）为0.01-1  mg/mL；所述酶为猪胰 脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶A、南极假丝酵母脂肪酶B、褶皱假丝酵母脂肪酶、米黑根毛霉 脂肪酶、梳棉状嗜热丝孢菌脂肪酶、辣根过氧化物酶、有机磷水解酶中的一种以上。 优选地，步骤（1）所述酶的终质量浓度（mg/mL）为0.05-0.4  mg/mL。 进一步优选地，步骤（1）所述酶的终质量浓度（mg/mL）为0.05  mg/mL,  0.1  mg/mL,  0.2  mg/mL,  0.3  mg/mL,  0.4  mg/mL。 进一步地，步骤（2）所述还原剂与步骤（1）所述金属盐的终摩尔浓度比（mM:mM）为 1-20:1；所述还原剂为硼氢化钠、氰基硼氢化钠和维生素C中的一种以上。 优选地，步骤（2）所述还原剂与步骤（1）所述金属盐的终摩尔浓度比（mM:mM）为2- 10:1。 进一步优选地，步骤（2）所述还原剂与步骤（1）所述金属盐的终摩尔浓度比（mM: mM）为2:1、4:1  、6:1、  8:1、  10:1。 进一步地，步骤（1）所述搅拌反应的时间为0.5-2h；搅拌反应的温度为20-30℃。 优选地，步骤（1）所述搅拌反应的时间为0.5h，步骤（1）所述搅拌反应的温度为25 ℃。 步骤（1）所述酶-金属离子核苷酸复合物（酶-金属离子核苷酸配位化合物）中的蛋 白含量为0.1%-5%；优选为0.21%~1.68%。 进一步优选地，步骤（1）所述酶-金属离子核苷酸复合物（酶-金属离子核苷酸配位 化合物）中的蛋白含量为0.21%、0.42%、0.84%、1.26%或1.68%。 优选地，在步骤（1）所述混合液中，核苷酸盐的终摩尔浓度为10-50mM。 进一步优选地，在步骤（1）所述混合液中，核苷酸盐的终摩尔浓度为10mM,  20mM,  30mM,  40mM,  50mM。 4 CN 111569943 A 说　明　书 3/8 页 进一步地，步骤（2）所述搅拌反应的时间为1-30min，搅拌反应的温度为20-30℃。 优选地，步骤（2）所述搅拌反应的时间为1-20min，步骤（2）所述搅拌反应的温度为 25℃。 进一步优选地，步骤（2）所述搅拌反应的时间为1min ,  3min ,  5min ,  10min ,  20min。 进一步地，步骤（2）所述分散液中，金属离子的浓度为30-50mM。 优选地，步骤（2）所述分散液中，金属离子的浓度为43mM。 进一步地，步骤（2）所述冷冻干燥的时间为12-20h。 优选地，步骤（2）所述冷冻干燥的时间为15h。 本发明提供一种由上述的制备方法制得的酶-金属核苷酸复合催化剂。 本发明提供的制备方法包括金属离子与核苷酸及酶分子复合物的构建以及金属 离子在复合物上的原位还原，实现对金属纳米颗粒的尺寸调控，获得具有良好分散性的酶- 金属核苷酸复合催化剂。 所述酶-金属核苷酸复合催化剂的金属纳米颗粒粒径分布为5-15  nm，负载在金属 离子核苷酸复合物上。 本发明提供的酶-金属核苷酸复合物能够应用在级联催化反应中。 与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果： （1）本发明提供的酶-金属核苷酸复合催化剂可通过调控还原反应时间等调控金属颗 粒的尺寸和其在复合物上的负载量。反应时间越长，金属尺寸越大，金属负载量越大，反应 时间为1-30min，金属颗粒尺寸在5-15nm，负载量在2%-10%之间； （2）本发明提供的的酶-金属核苷酸复合催化剂兼具酶的催化活性和金属纳米颗粒的 催化活性，其中，酶的催化活性为相对于游离酶的1.7-25%，金属纳米颗粒的催化活性为反 应常数k为1-8（10-2  s-1）； （3）本发明构建的的酶-金属核苷酸复合物可用于催化化学-酶级联反应，在药物生产 和医学检测治疗领域具有良好的应用前景。 附图说明 图1a为实施实例1制得的铜离子核苷酸复合物（Cu/CMP）的扫描电镜图； 图1b为实施实例2制得的脂肪酶-铜离子核苷酸复合物（PPL@Cu/CMP）的扫描电镜图； 图1c为实施实例2制得的脂肪酶-铜核苷酸复合物（PPL&Cu@MNC）的扫描电镜图； 图1d为实施实例2制得的脂肪酶-铜核苷酸复合物（PPL&Cu@MNC）的透射电镜图； 图2为实施实例2制得的脂肪酶-铜核苷酸复合催化剂（PPL&Cu@MNC）的X-射线衍射谱 图； 图3为购自阿拉丁试剂有限公司的5'-单磷酸胞苷二钠（CMP）、实施例1制得的铜离子核 苷酸复合物（Cu/CMP）、实施例2制得的脂肪酶-铜离子核苷酸复合物（PPL@Cu/CMP）和脂肪 酶-铜核苷酸复合物（PPL&Cu@MNC）的红外光谱图； 图4为实施实例3制得的脂肪酶-铜核苷酸复合催化剂（PPL&Cu@MNC）的酶催化活性； 图5为实施实例3制得的脂肪酶-铜核苷酸复合催化剂（PPL&Cu@MNC）的金属催化活性； 图6为实施实例4制得的脂肪酶-铜核苷酸复合催化剂（PPL&Cu@MNC）的酶催化活性； 5 CN 111569943 A 说　明　书 4/8 页 图7为实施实例4制得的脂肪酶-铜核苷酸复合催化剂（PPL&Cu@MNC）的金属催化活性； 图8为实施实例5制得的脂肪酶-铜离子核苷酸复合物（PPL@Cu/CMP）的固定化效率和酶 催化活性； 图9为实施实例6制得的脂肪酶-铜离子核苷酸复合物（PPL@Cu/CMP、PPL@Cu/AMP、PPL@ Cu/GMP）的固定化效率和酶催化活性； 图10为实施实例7制得的脂肪酶-铜离子核苷酸复合物（PPL@Cu/CMP）的固定化效率和 酶催化活性。