技术摘要：
本发明属于分析化学技术领域，涉及一种基于丝网印刷电极的NF‑κB电化学检测方法。本发明主要是利用肽核酸(PNA)能够竞争性的结合含NF‑κB结合序列dsDNA中的互补ssDNA形成稳定的PNA‑DNA杂交链，NF‑κB的存在会抑制PNA‑DNA杂交链生成的原理。实验首先在激活的丝网印  全部
背景技术：
核转录因子NF-κB是隶属于锌指结构家族的转录因子，能与B细胞免疫球蛋白κ轻 链启动子区域相结合，并且调控该区域基因启动表达的蛋白。NF-κB广泛存在于哺乳动物的 各个细胞类型中，不同类型研究皆发现机体在健康状态和病理状态下NF-κB的表达量有明 显的差异，NF-κB的含量的变化在机体免疫、代谢、炎症反应、肿瘤发展以及其他病程的发生 发展过程中发挥重要的指示作用，对于疾病的发展、早期诊断或预防，建立一种灵敏、快速、 便捷检测NF-κB水平的方法是非常必要的。 现今，NF-κB的检测方法包括电泳迁移率变动分析，蛋白质免疫印迹等。然而，这些 方法通常需要特异性抗体，繁琐的标记或特殊仪器。众所周知，标记过程往往是非常耗时且 昂贵，甚至可能会导致生物分子的变性。电化学检测技术具有设备简单，价格低廉、灵敏度 高、简便快捷，同时可以实现无标记检测等优点。其中丝网印刷电极作为一种小型传感器具 有多种优势，缩短反应时间，平行性好，灵敏度更高。在电化学实验中得到广泛的应用，近年 来，被成功的应用于生物大分子定性或定量的检测。
技术实现要素：
本发明的目的是发挥电化学检测技术的优势，建立一种简单、无需标记且成本低 廉，同时又具有高灵敏度的NF-κB检测方法。 本发明的技术方案：一种基于丝网印刷电极的NF-κB电化学检测方法，利用PNA与 DNA结合具有高亲和力与特异性，能够竞争性的结合dsDNA中的互补ssDNA形成稳定的PNA- DNA杂交链；MB能够嵌合于杂交双链，作为氧化还原指示剂放大电信号响应；设计了含有NF- κB结合序列的DNA，当NF-κB蛋白存在时，NF-κB蛋白与dsDNA的靶向结合能抑制PNA-DNA杂交 链的生成，电极表面修饰的PNA单链与MB互作力不强，信号微弱；NF-κB含量的差别导致不同 程度的信号响应，测得标准曲线，通过统计学分析得出NF-κB检测的线性方程并计算其含 量。该方法具有良好的重复性，高的灵敏度，可应用于NF-κB的检测。 方法包括以下步骤：丝网印刷电极的预处理、金粒子修饰丝网印刷电极、PNA修饰 镀金丝网印刷电极、样品与修饰电极共孵育、MB与修饰电极共孵育、NF-κB的电化学检测。 (1)丝网印刷电极的预处理 具体步骤如下：用蒸馏水冲洗丝网印刷电极表面10s，洗耳球吹干。之后将处理好 的电极置于0.1M  PBS中，在0V-0.8V电压范围内进行循环伏安扫描，扫速参数设置为0.1V/ s，直至达到稳定后，室温干燥。 (2)金粒子修饰丝网印刷电极 将上述(1)中经过经典方法预处理的丝网印刷电极表面滴加100μL  5mM的氯金酸 溶液(0.5M  H2SO4)中电沉积350s，沉积电位为-200mV。 3 CN 111595916 A 说　明　书 2/2 页 (3)PNA修饰镀金丝网印刷电极 将上述(2)中镀金丝网印刷电极表面滴加0.5μM  5 .0μL的PNA(0 .1M  PBS，pH＝ 7.4)，37℃孵育1.5h，蒸馏水冲洗。后在PNA修饰的电极表面滴加100μL  1.0mM  MCH溶液，室 温处理30min进行占位去除非特异性吸附。 上述PNA的序列为：5′-Cys-ATG-GTC-GGG-ACT-TTC-CCT-3′。 (4)样品与修饰电极共孵育 对待测样品预处理：取12.5μL  0.06μM  ssDNA1(0.1M  PBS，0.25M  NaCl，pH＝7.4) 与12.5μL  0.06μM  ssDNA2(0.1M  PBS，0.25M  NaCl，pH＝7.4)，经90℃5min→70℃10min→50 ℃10min→30℃10min→10℃25min杂交得dsDNA。再和25μL不同浓度(0→0.1ng/mL)NF-κB  p50(50mM  HEPES，1mM  TCEP，50mM  NaCl，pH＝7.4)溶液混合，37℃孵育0.5h。将经过上述(3) 处理的电极表面滴加dsDNA与蛋白的混合溶液，37℃孵育2.0h。 上述ssDNA1的序列为：5′-ATG-GTC-GGG-ACT-TTC-CCT-3′； 上述ssDNA2的序列为：5′-AGG-GAA-AGT-CCC-GAC-CAT-3′ (5)MB与修饰电极共孵育 将经过上述(4)处理的电极表面滴加100μL，浓度为20mM的MB溶液(20mM  Tris- HCl，pH＝7.4)中，避光，室温孵育2h。 (6)NF-κB的电化学检测 将经过上述(5)处理的电极表面滴加100μL  20mM  Tris-HCl，pH为7.4的溶液，进行 电化学定量分析，本检测采用的电化学工作站(CHI  660E)，以饱和甘汞电极为参比电极，铂 电极为对电极。使用的扫描方法为微分脉冲伏安法，参数设置：初始电位-0 .6V，终止电位 0.3V，电位增量0.004V，振幅0.05V，脉冲宽度0.05s，脉冲周期0.5s。NF-κB含量越多，形成的 PNA-DNA杂交链就越少，吸附的电信号分子MB也就越少，因此，得到的电化学信号也就随之 越小。以MB的电化学信号为纵坐标，NF-κB的浓度为横坐标，绘制标准曲线，通过计算NF-κB 的浓度，即可实现NF-κB的灵敏检测。 本发明的有益效果：方法简便快速、灵敏度高，实现了NF-κB的无标记检测，简化了 实验步骤，避免了标记过程，对各类疾病包括癌症的监控与治疗具有重要意义。 附图说明 图1：丝网印刷电极结构图。 图2：NF-κB的检测原理图。 图3：NF-κB在不同浓度下，电化学信号值与NF-κB浓度关系标准曲线图。