技术摘要：
本发明公开了一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂和试剂盒，设计出一对序列分别如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示的上游引物、下游引物，SEQ ID No.4所示的核苷酸序列作为探针，探针的5′端有用荧光染料标记的FAM荧光报告基团，所述探针的3′端有用淬灭荧光染料标记 全部
背景技术：
非洲猪瘟（African Swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African Swine fever virus，ASFV）感染家猪和各种野猪（非洲野猪、欧洲野猪等）引起一种急性、出血性、烈性传 染病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为A类动物传染病，该病也是我国重点防范的一类动 物疫情。其特征是发病过程短，最急性和急性感染死亡率高达100%，临床表现为发热（达40 ～42℃），心跳加快，呼吸困难，部分咳嗽，眼、鼻有浆液性或粘液性脓性分泌物，皮肤发绀， 淋巴结、肾、胃肠粘膜明显出血，非洲猪瘟临床症状与猪瘟症状相似，非洲猪瘟病毒能从被 感染猪只血液、组织液、内脏，及其他排泄物中依靠实验室监测证实出来。 OIE推荐检测非洲猪瘟的方法为聚合酶链式反应（PCR），我国标准检测非洲猪瘟的 方法主要PCR和酶联免疫吸附试验（ELISA）。现有检测方法均存在时间长、灵敏度低等缺陷。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的缺陷，提供一种灵敏度高、特异性 强、快速诊断、高通量、操作简单、重复性好、自动化程度高、易标准化操作和试验的生物安 全性高的检测试剂和试剂盒。 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂，所述检测试剂是针对以非洲猪瘟病毒 VP72基因的部分目标片段（170bp）作为靶目标，包括： 上游引物为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列； 下游引物为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列； 探针为SEQ ID No .4所示的核苷酸序列。 其中探针的5′端有用荧光染料标记的FAM荧光报告基团，所述探针的3′端有用淬 灭荧光染料标记的BQ1荧光淬灭基团。 截取非洲猪瘟E75毒株（Genebank:FN557520.1）VP72基因170bp作为目标片段，扩 增目标核苷酸序列为SEQ ID NO：4所示。 一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，包括荧光PCR反应液、样品裂解液、 阳性对照、阴性对照。 一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，还可包括无菌生理盐水。 其中，所述荧光PCR反应液中包含： 上游引物为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列； 下游引物为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列； 探针为SEQ ID No .4所示的核苷酸序列； 3 CN 111593137 A 说 明 书 2/9 页 阳性对照为包括SEQ ID NO：1所示序列的质粒。 其中探针的5′端有用荧光染料标记的FAM荧光报告基团，所述探针的3′端有用淬 灭荧光染料标记的BQ1荧光淬灭基团。 其中，所述阳性对照为将阳性质粒稀释106倍。 其中，所述阴性对照为SPF猪血清。 其中所述样品裂解液为1×TE（pH 8.0）。 其中1×TE（pH 8.0）配制包括如下步骤： （1）1 M Tris-HCL（pH 8.0）的配制：称取Tris碱6.06g，加超纯水40 mL溶解，滴加 浓HCL约2.1 mL调节pH至8.0，定容至50 mL。 （2）0.5 M EDTA（pH 8.0）的配制：称取EDTA-Na2·2H2O 9.306 g，加超纯水35 mL， 剧烈搅拌，用约1 g的强氧化钠颗粒调节pH至8.0，定容至50 mL（EDTA-Na2·2H2O需加入强氧 化钠调节pH至8.0时才能溶解）。 （3）1×TE（pH 8.0）的配制：1 M Tris-HCL（pH 8.0）1 mL，0.5 M EDTA（pH 8.0）2 mL，加超纯水定容100 mL。 本发明获得的非洲猪瘟实时荧光PCR检测试剂盒是基于在PCR反应体系中加入荧 光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过软件对未知模板进行计算分析 的方法，具有灵敏度高、特异性强、快速诊断、高通量、操作简单、重复性好、自动化程度高、 易标准化操作和试验的生物安全性高等突出优点。
本发明公开了一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂和试剂盒，设计出一对序列分别如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示的上游引物、下游引物，SEQ ID No.4所示的核苷酸序列作为探针，探针的5′端有用荧光染料标记的FAM荧光报告基团，所述探针的3′端有用淬灭荧光染料标记 全部
背景技术：
非洲猪瘟（African Swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African Swine fever virus，ASFV）感染家猪和各种野猪（非洲野猪、欧洲野猪等）引起一种急性、出血性、烈性传 染病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为A类动物传染病，该病也是我国重点防范的一类动 物疫情。其特征是发病过程短，最急性和急性感染死亡率高达100%，临床表现为发热（达40 ～42℃），心跳加快，呼吸困难，部分咳嗽，眼、鼻有浆液性或粘液性脓性分泌物，皮肤发绀， 淋巴结、肾、胃肠粘膜明显出血，非洲猪瘟临床症状与猪瘟症状相似，非洲猪瘟病毒能从被 感染猪只血液、组织液、内脏，及其他排泄物中依靠实验室监测证实出来。 OIE推荐检测非洲猪瘟的方法为聚合酶链式反应（PCR），我国标准检测非洲猪瘟的 方法主要PCR和酶联免疫吸附试验（ELISA）。现有检测方法均存在时间长、灵敏度低等缺陷。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的缺陷，提供一种灵敏度高、特异性 强、快速诊断、高通量、操作简单、重复性好、自动化程度高、易标准化操作和试验的生物安 全性高的检测试剂和试剂盒。 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂，所述检测试剂是针对以非洲猪瘟病毒 VP72基因的部分目标片段（170bp）作为靶目标，包括： 上游引物为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列； 下游引物为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列； 探针为SEQ ID No .4所示的核苷酸序列。 其中探针的5′端有用荧光染料标记的FAM荧光报告基团，所述探针的3′端有用淬 灭荧光染料标记的BQ1荧光淬灭基团。 截取非洲猪瘟E75毒株（Genebank:FN557520.1）VP72基因170bp作为目标片段，扩 增目标核苷酸序列为SEQ ID NO：4所示。 一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，包括荧光PCR反应液、样品裂解液、 阳性对照、阴性对照。 一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，还可包括无菌生理盐水。 其中，所述荧光PCR反应液中包含： 上游引物为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列； 下游引物为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列； 探针为SEQ ID No .4所示的核苷酸序列； 3 CN 111593137 A 说 明 书 2/9 页 阳性对照为包括SEQ ID NO：1所示序列的质粒。 其中探针的5′端有用荧光染料标记的FAM荧光报告基团，所述探针的3′端有用淬 灭荧光染料标记的BQ1荧光淬灭基团。 其中，所述阳性对照为将阳性质粒稀释106倍。 其中，所述阴性对照为SPF猪血清。 其中所述样品裂解液为1×TE（pH 8.0）。 其中1×TE（pH 8.0）配制包括如下步骤： （1）1 M Tris-HCL（pH 8.0）的配制：称取Tris碱6.06g，加超纯水40 mL溶解，滴加 浓HCL约2.1 mL调节pH至8.0，定容至50 mL。 （2）0.5 M EDTA（pH 8.0）的配制：称取EDTA-Na2·2H2O 9.306 g，加超纯水35 mL， 剧烈搅拌，用约1 g的强氧化钠颗粒调节pH至8.0，定容至50 mL（EDTA-Na2·2H2O需加入强氧 化钠调节pH至8.0时才能溶解）。 （3）1×TE（pH 8.0）的配制：1 M Tris-HCL（pH 8.0）1 mL，0.5 M EDTA（pH 8.0）2 mL，加超纯水定容100 mL。 本发明获得的非洲猪瘟实时荧光PCR检测试剂盒是基于在PCR反应体系中加入荧 光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过软件对未知模板进行计算分析 的方法，具有灵敏度高、特异性强、快速诊断、高通量、操作简单、重复性好、自动化程度高、 易标准化操作和试验的生物安全性高等突出优点。
