技术摘要：
本发明涉及一种8‑羟基喹诺酮有关物质的检测方法。它是取8‑羟基喹诺酮待测品配制供试品溶液，将供试品溶液稀释100倍作为对照溶液，然后以pH 3.1磷酸盐缓冲液为流动相A，以甲醇为流动B，按下表进行梯度洗脱；检测波长为255nm，柱温为35℃，分别进行HPLC检测，按照主成  全部
背景技术：
8-羟基喹诺酮，英文名为8-Hydroxycarbostyril，分子式为C9H7NO2，分子量为 161.16，CAS登录号:  284461-73-0。其结构如式I所示。 未查阅到8-羟基喹诺酮有关物质相关参考文献。 8-羟基喹诺酮是盐酸丙卡特罗重要的关键起始物料，盐酸丙卡特罗是β2受体激动 剂，支气管扩张作用强，适用于支气管哮喘、喘息性支气管炎、伴有支气管反应性增高的急 性支气管炎、慢性阻塞性肺部疾病。天津药物研究院有限公司是国内目前盐酸丙卡特罗原 料药的唯一生产单位，鉴于当前市场对盐酸丙卡特罗原料药的需求和对产品质量的严格要 求，因此需要对8-羟基喹诺酮进行有关物质与含量的检测，以期达到标准要求。 根据工艺合成路线与稳定性研究，8-羟基喹诺酮目前已知的主要有关物质为杂质 A、杂质B，均来自于合成中间体，结构如式Ⅱ、Ⅲ所示： （杂质A）                        （杂质B）。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种8-羟基喹诺酮有关物质的检测方法，使其在系统适用 性、专属性、重复性、定量限、检出限、线性范围等方面完全符合标准并具有较高的精密度。 为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案： 一种8-羟基喹诺酮有关物质的检测方法，包括：取8-羟基喹诺酮待测品配制供试品溶 液，将供试品溶液稀释100倍作为对照溶液，然后以磷酸二氢钠溶液为流动相A，以甲醇为流 动B分别进行HPLC检测，按照主成分自身对照法，计算获得有关物质的含量。 作为优选，本发明所述检测方法包括：取8-羟基喹诺酮待测品配制供试品溶液，将 3 CN 111595990 A 说　明　书 2/9 页 供试品溶液稀释100倍作为对照溶液，然后以磷酸二氢钠溶液为流动相A，以甲醇为流动B分 别进行HPLC检测，按照主成分自身对照法，计算获得有关物质的含量。 作为优选，梯度洗脱程序如下表： 作为优选，磷酸盐缓冲液中磷酸二氢钠的物质的量为0.01～0.5  mol/L，最佳浓度为 0.05mol/L；所述的磷酸盐溶液可选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、 磷酸二氢胺、磷酸氢二胺溶液； 作为优选，所述的流动性A溶液pH值范围为2～3.5； 作为优选，所述HPLC色谱柱选自Welch  Ultimate  AQ  C18、Agela  Technologies  Venusil  ASB  C18、Thermo  BDS  HYPERSIL  C18、Agilent  ZORBAX  SB-C18、Waters  symmetry  C18；Agilent  5  HC-C18(2)、YMC-PACK  ODS  AQ；更优选为YMC-PACK  ODS  AQ色谱柱，其规格 为150×4.6mm，5µm，它采用较小的粒径和长度，使8-羟基喹诺酮与有关物质及各有关物质 之间的分离度更高； 作为优选，所述配制供试品溶液为采用混合溶液（流动相A：流动相B=1：4）配制成浓度 为1.5mg/mL的供试品溶液。更优选地，所述配制供试品溶液为：取8-羟基喹诺酮约75mg，置 50mL量瓶中，加混合溶液适量。超声使其溶解，放冷，用混合溶液稀释至刻度，摇匀，作为供 试品溶液； 作为优选，所述HPLC检测的检测波长为210-280  nm；更优选为255nm； 作为优选，所述HPLC检测的流速为0.5-1.5ml/min； 作为优选，所述HPLC检测的进样量1-20µL； 作为优选，所述HPLC检测的柱温为20-40℃； 作为优选，本发明所述检测方法还包括在HPLC检测之前进行系统适用性检测步骤：按 照正式检测的色谱条件，分别进样空白溶液、系统适用性溶液，记录色谱图，通过调整色谱 柱和色谱仪使空白溶液色谱图中无干扰峰，系统适用性溶液色谱图中8-羟基喹诺酮与杂质 A、杂质B及其它未知杂质之间的分离度不得小于1.5；所述空白溶液为流动相A：流动相B体 积比为1：4的混合溶液，所述系统适用性溶液由以下方法配制而成：另取杂质A和杂质B对照 品各15mg，精密称定，置10mL量瓶中，加溶剂适量，超声使溶解，放冷，用溶剂稀释至刻度，摇 匀，精密量取10ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备溶液；再取8- 羟基喹诺酮对照品适量，精密称定，置100ml量瓶中，加溶剂适量，超声使溶解，放冷，再精密 加入上述对照品储备溶液1ml，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性试验溶液。 在系统适用性试验中，和8-羟基喹诺酮最接近的杂质的分离度为1.8左右，杂质A 与未知杂质的分离度为3.8左右，杂质B与8-羟基喹诺酮的分离度为5.6左右，都大于分离度 标准要求的1.5，表明本发明所述检测方法可以完好的分离出各有关物质峰和8-羟基喹诺 酮主成分峰，各峰之间无干扰，利于检测。 4 CN 111595990 A 说　明　书 3/9 页 在专属性的试验中，在经酸、碱、氧化、高温、光照降解后的样品图谱中，主峰的纯 度因子均大于阈值，符合标准要求。 在定量限的试验中，相当于样品浓度0.03%的有关物质样品信噪比在10以上，保证 样品中0.03%以上的有关物质可以定量检测；在检测线的试验中，相当于样品浓度0.01%的 有关物质样品信噪比在3以上，保证样品中0.01%以上的有关物质可以被检测到；证明本发 明的灵敏度很高。 在线性范围的试验中，本发明所述检测方法针对各有关物质的线性范围均符合至 少在LOQ~指标200%的范围内的标准，且回归系数均在0.996~0.999之间，证明呈良好的线性 关系。 在重复性试验中，6次测定的杂质峰数一致，杂质量的RSD为1.9%，8-羟基喹诺酮峰 面积RSD为0.2%，证实本发明所述检测方法具有良好的精密度。 在回收率试验中，本发明所述检测方法针对各有关物质的平均回收率结果均在 90%-105%之间，符合验证方法要求，证实该方法具有良好的精密度。 在耐用性试验中，当流动性A的pH值，流动性B比例或柱温来评估当测定条件有微 小变化时，测定结果不受影响的承受程度。证明该方法具有良好的耐用性。 本发明进一步公开了8-羟基喹诺酮有关物质的检测方法在有效提高8-羟基喹诺 酮色谱峰和其有关物质峰的分离度方面的应用。实验结果显示采用甲醇-磷酸盐缓冲液梯 度洗脱体系，使得8-羟基喹诺酮的色谱峰可以和其他有关物质峰分离度更高，且峰型对称 性较高，利于有关物质的检出，具有较高的系统适应性，同时在专属性、定量限、检出限、线 性范围、重复性以及稳定性上都表现出无可比拟的优势，具有较高的精密度。 本发明主要解决了8-羟基喹诺酮有关物质的检测条件，重点考察了高效液相梯度 条件对8-羟基喹诺酮色谱峰和其有关物质峰分离度的影响，主要的难点在于色谱柱和流动 相中盐溶液的选择。 附图说明 图1是实施例3中系统适应性溶液的液相色谱图； 图2是实施例3中供试品溶液稳定性（0小时）的液相色谱图； 图3是实施例3中供试品溶液稳定性（24小时）的液相色谱图; 图4是实施例3中杂质A定量限的液相色谱图; 图5是实施例3中8-羟基喹诺酮定量限的液相色谱图; 图6是实施例3中杂质B定量限的液相色谱图。