技术摘要：
本发明公开了一种马凡综合征诊断产品。所述产品包括检测USH2A基因c.4758 3A>G的试剂。本发明的产品通过检测受试者基因组DNA上USH2A基因c.4758 3A>G即可判断受试者是否患有马凡综合征，该产品可应用于临床。
背景技术：
马凡综合征(Marfan syndrome，MFS)是先天性中胚叶发育不良性疾病，是一种遗 传性结缔组织疾病，患病率为0.065‰～0.02‰，是法国儿科专家Antoine于1896年首次报 告，1931年正式命名为Marfan综合征。MFS的临床表现复杂，主要累及骨骼、眼和心血管系 统：患者四肢奇长且细，宛如蜘蛛足，肌肉张力降低，关节活动增加，胸骨畸形，全身性结缔 组织异常可导致关节反复脱位、扁平足或高弓足；皮肤常表现为皮纹增宽或有萎缩性皮纹； 30％～40％的病人有心血管系统并发症，最常见的心血管异常为主动脉特发性扩张、主动 脉夹层动脉瘤和二尖瓣异常等；眼部异常的特征性表现是晶体脱位或半脱位，并发高度近 视、青光眼、视网膜剥离、虹膜炎等；脑血管畸形可导致神经系统病变，表现为蛛网膜下腔出 血和颈内动脉瘤所致的压迫症状动脉瘤引起的癫痫大发作，少数病人可有智力落后或痴 呆。 马凡综合征尚无特殊疗法和根治手段，只能通过手术或者药物对具体症状进行有 限的缓解。多数病人接受治疗后可存活到中年，常死于主动脉瘤破裂和心力衰竭。2018年5 月11日，国家卫生健康委员会等5部门联合制定了《第一批罕见病目录》，马凡综合征被收录 其中。马凡综合征系常染色体显性遗传病，多呈家族聚集性，编码原纤维蛋白1的FBN1基因 为其主要致病基因，目前报道的FBN1基因相关突变超过1800个，符合临床诊断标准的马凡 综合征患者检出FBN1基因突变的比例为70％～93％。现有技术CN109666729A公开了一种突 变基因，在人类FBN1基因的基础上，编码区第718位碱基C突变成T，并提供了该突变位点在 制备马凡综合征筛查试剂盒中的用途。现有技术CN109554467A公开了一种突变基因，在人 类FBN1基因的基础上，编码区第位3617位碱基G突变成A，并提供了该突变位点在制备马凡 综合征筛查试剂盒中的用途。 目前，基因检测是确诊马凡综合征的重要手段，基于该疾病的罕见性，因此，任何 一个或一组马凡综合征的相关基因的发现与提出都将是对本领域的重要技术贡献。
技术实现要素：
为了解决现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种能够在马凡综合征 早期即可准确诊断疾病发生与否的诊断标志物及其应用。 根据本发明的一个方面，本发明提供了一种用于诊断马凡综合征的基因突变，所 述基因突变是USH2A基因上的突变。 进一步，所述突变是c.4758 3A>G。 根据本发明的又一个方面，本发明还提供了检测前面所述的突变的试剂。 进一步，所述试剂包括针对前面所述的基因突变的特异性扩增引物。 进一步，所述试剂还包括dNTPs、Taq酶、Mg2 和PCR反应缓冲液等PCR扩增反应中常 3 CN 111718990 A 说 明 书 2/5 页 规试剂。 本发明提供了前面所述的基因突变在制备前面所述的试剂中的应用。本领域技术 人员根据基因突变位点上下游序列设计特异性扩增引物或者特异性检测探针。引物和探针 的设计方法是本领域的常规技术。 本发明还提供了前面所述的基因突变在制备马凡综合征诊断产品中的应用。 本发明还提供了前面所述的试剂在制备马凡综合征诊断产品中的应用。 进一步，所述诊断产品通过检测样本中前面所述的基因突变位点的基因型来诊断 个体是否患有马凡综合征。 在本发明的具体实施方案中，所述样本来源是血液。 本发明还提供了一种马凡综合征诊断产品，所述诊断产品包括检测前面所述的基 因突变的试剂。 本发明的所述诊断产品包括试剂盒、芯片、或者试纸。 此类试剂盒可以包含载体手段，其被隔室化以紧密约束方式容纳一个或多个容器 手段，诸如管形瓶、管等，每个容器手段装有要在所述方法中使用的分开成分之一。典型地， 试剂盒会包括上文所描述的容器和一个或多个其它容器，其中装有从商业和使用者观点看 需要的材料，包括缓冲剂、稀释剂、滤器、针头、注射器、和印有使用说明书的包装插页。容器 上可以存在标签以指出体内或体外使用的用法。试剂盒中的其它任选成分包括一种或多种 缓冲液(例如封闭缓冲液、清洗缓冲液、底物缓冲液等)、其它试剂诸如能被酶标记物化学改 变的底物(例如色原)、表位修复液、对照样品(阳性和/或阴性对照)等。 术语解释 引物 如本文所用，术语“引物”指的是能与模板互补配对，在DNA聚合酶的作用合成与模 板互补的DNA链的寡聚核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天 然核苷酸，引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基本上”)与 模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延 伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3’端与模板互补的引物的5’端 加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能 与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩 增。 文库及其制备 如本文所用，术语“文库”是指对基因组的目的片段进行打断，获得一组具有一定 大小的DNA片段混合物。 文库的制备方法为本领域技术人员所熟知，包括(但不局限于)步骤： (1)提供一待检测样本，所述样品含有经打断的、源自基因组DNA的双链核酸片段， 并且所述核酸片段具有平末端； (2)在双链核酸片段的末端添加接头连接序列；通过所述接头连接序列，在所述双 链核酸片段的两端添加接头，其中所述接头具有引物结合区以及连接互补区，所述的连接 互补区与所述的接头连接序列互补；两侧3’端和5’端的接头的引物结合区序列不同。 (3)对上一步骤获得的带有接头的DNA双链核酸片段，用第一引物和第二引物进行 4 CN 111718990 A 说 明 书 3/5 页 扩增，从而获得PCR扩增产物的混合物，其中所述引物具有对应于所述接头的引物结合区的 接头结合区，并且位于接头结合区外侧的测序探针结合区。 还可以对打断产物、末端修复产物、接头产物和富集产物进行纯化。纯化条件及参 数为本领域技术人员所熟知，对反应的条件进行一定的变化或优化也在本领域技术人员能 力范围之内。 捕获 如本文所用，术语“捕获”，指的是探针对文库中外显子区域的DNA片段进行特异性 选择和结合的过程。 DNA分子正常情况下是双链，因此捕获之前，DNA分子必须变为单链，一般是通过加 热使其变性而达到解链目的，解链的DNA分子被迅速冷却，即保持单链状态。文库变性后在 杂交平台与芯片进行捕获杂交。含有外显子区域的DNA片段与固定在芯片上的探针之间在 严格的条件下进行分子杂交。较佳地，芯片上探针分子的浓度要远远高于靶分子浓度。待杂 交完毕后，通过变性等方法收集捕获的序列并纯化，得到来自捕获后的序列混合物。 本领域技术人员可以通过通用的方法进行外显子捕获和目的片段的洗脱和纯化， 也可以应用市售(如：德国Qiagen公司的MinElute PCR Purification kit)试剂盒进行上 述过程。在一个优选例中，对待检测的DNA文库的PCR扩增产物的混合物进行单链化，并用封 闭分子封闭所述扩增产物中对应于第一引物和第二引物的区域，从而获得两端被封闭的单 链扩增产物的混合物；用核酸芯片从所述的经封闭的单链扩增产物的混合物中，捕获疾病 相关的核酸分子；对经捕获的核酸分子，用第三引物和第四引物进行扩增，从而获得第二 PCR扩增产物的混合物，其中第三引物和第四引物分别特异性结合于所述的第一引物和第 二引物；对上一步骤获得的第二PCR扩增产物的混合物进行测序，从而获得样本中疾病相关 核酸分子的核苷酸序列信息。 高通量测序 基因组的“高通量测序”使得人类能够尽早地发现与疾病相关基因的异常变化，有 助于对个体疾病的诊断和治疗进行深入的研究。本领域技术人员通常可以采用三种第二代 测序平台进行高通量测序：454FLX(Roche公司)、SolexaGenome Analyzer(Illumina公司) 和Applied Biosystems公司的SOLID等。这些平台共同的特点是极高的测序通量，相对于传 统测序的96道毛细管测序，高通量测序一次实验可以读取40万到400万条序列，根据平台的 不同，读取长度从25bp到450bp不等，因此不同的测序平台在一次实验中，可以读取1G到14G 不等的碱基数。 本发明的优点和有益效果： 与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：本发明提供了能够诊断马凡综合征 的基因突变；通过对本发明提供的基因突变进行基因分型(genotyping)，即可检测出个体 是否有患病的风险或者检测出个体是否患病。本发明的基因突变的检测可达到早预测、早 诊断、早干预、早治疗的目的；同时，本发明提供基因突变还可用于诊断产品开发，并能够应 用于临床研究、分析及诊断等诸多用途。
本发明公开了一种马凡综合征诊断产品。所述产品包括检测USH2A基因c.4758 3A>G的试剂。本发明的产品通过检测受试者基因组DNA上USH2A基因c.4758 3A>G即可判断受试者是否患有马凡综合征，该产品可应用于临床。
背景技术：
马凡综合征(Marfan syndrome，MFS)是先天性中胚叶发育不良性疾病，是一种遗 传性结缔组织疾病，患病率为0.065‰～0.02‰，是法国儿科专家Antoine于1896年首次报 告，1931年正式命名为Marfan综合征。MFS的临床表现复杂，主要累及骨骼、眼和心血管系 统：患者四肢奇长且细，宛如蜘蛛足，肌肉张力降低，关节活动增加，胸骨畸形，全身性结缔 组织异常可导致关节反复脱位、扁平足或高弓足；皮肤常表现为皮纹增宽或有萎缩性皮纹； 30％～40％的病人有心血管系统并发症，最常见的心血管异常为主动脉特发性扩张、主动 脉夹层动脉瘤和二尖瓣异常等；眼部异常的特征性表现是晶体脱位或半脱位，并发高度近 视、青光眼、视网膜剥离、虹膜炎等；脑血管畸形可导致神经系统病变，表现为蛛网膜下腔出 血和颈内动脉瘤所致的压迫症状动脉瘤引起的癫痫大发作，少数病人可有智力落后或痴 呆。 马凡综合征尚无特殊疗法和根治手段，只能通过手术或者药物对具体症状进行有 限的缓解。多数病人接受治疗后可存活到中年，常死于主动脉瘤破裂和心力衰竭。2018年5 月11日，国家卫生健康委员会等5部门联合制定了《第一批罕见病目录》，马凡综合征被收录 其中。马凡综合征系常染色体显性遗传病，多呈家族聚集性，编码原纤维蛋白1的FBN1基因 为其主要致病基因，目前报道的FBN1基因相关突变超过1800个，符合临床诊断标准的马凡 综合征患者检出FBN1基因突变的比例为70％～93％。现有技术CN109666729A公开了一种突 变基因，在人类FBN1基因的基础上，编码区第718位碱基C突变成T，并提供了该突变位点在 制备马凡综合征筛查试剂盒中的用途。现有技术CN109554467A公开了一种突变基因，在人 类FBN1基因的基础上，编码区第位3617位碱基G突变成A，并提供了该突变位点在制备马凡 综合征筛查试剂盒中的用途。 目前，基因检测是确诊马凡综合征的重要手段，基于该疾病的罕见性，因此，任何 一个或一组马凡综合征的相关基因的发现与提出都将是对本领域的重要技术贡献。
技术实现要素：
为了解决现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种能够在马凡综合征 早期即可准确诊断疾病发生与否的诊断标志物及其应用。 根据本发明的一个方面，本发明提供了一种用于诊断马凡综合征的基因突变，所 述基因突变是USH2A基因上的突变。 进一步，所述突变是c.4758 3A>G。 根据本发明的又一个方面，本发明还提供了检测前面所述的突变的试剂。 进一步，所述试剂包括针对前面所述的基因突变的特异性扩增引物。 进一步，所述试剂还包括dNTPs、Taq酶、Mg2 和PCR反应缓冲液等PCR扩增反应中常 3 CN 111718990 A 说 明 书 2/5 页 规试剂。 本发明提供了前面所述的基因突变在制备前面所述的试剂中的应用。本领域技术 人员根据基因突变位点上下游序列设计特异性扩增引物或者特异性检测探针。引物和探针 的设计方法是本领域的常规技术。 本发明还提供了前面所述的基因突变在制备马凡综合征诊断产品中的应用。 本发明还提供了前面所述的试剂在制备马凡综合征诊断产品中的应用。 进一步，所述诊断产品通过检测样本中前面所述的基因突变位点的基因型来诊断 个体是否患有马凡综合征。 在本发明的具体实施方案中，所述样本来源是血液。 本发明还提供了一种马凡综合征诊断产品，所述诊断产品包括检测前面所述的基 因突变的试剂。 本发明的所述诊断产品包括试剂盒、芯片、或者试纸。 此类试剂盒可以包含载体手段，其被隔室化以紧密约束方式容纳一个或多个容器 手段，诸如管形瓶、管等，每个容器手段装有要在所述方法中使用的分开成分之一。典型地， 试剂盒会包括上文所描述的容器和一个或多个其它容器，其中装有从商业和使用者观点看 需要的材料，包括缓冲剂、稀释剂、滤器、针头、注射器、和印有使用说明书的包装插页。容器 上可以存在标签以指出体内或体外使用的用法。试剂盒中的其它任选成分包括一种或多种 缓冲液(例如封闭缓冲液、清洗缓冲液、底物缓冲液等)、其它试剂诸如能被酶标记物化学改 变的底物(例如色原)、表位修复液、对照样品(阳性和/或阴性对照)等。 术语解释 引物 如本文所用，术语“引物”指的是能与模板互补配对，在DNA聚合酶的作用合成与模 板互补的DNA链的寡聚核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天 然核苷酸，引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基本上”)与 模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延 伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3’端与模板互补的引物的5’端 加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能 与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩 增。 文库及其制备 如本文所用，术语“文库”是指对基因组的目的片段进行打断，获得一组具有一定 大小的DNA片段混合物。 文库的制备方法为本领域技术人员所熟知，包括(但不局限于)步骤： (1)提供一待检测样本，所述样品含有经打断的、源自基因组DNA的双链核酸片段， 并且所述核酸片段具有平末端； (2)在双链核酸片段的末端添加接头连接序列；通过所述接头连接序列，在所述双 链核酸片段的两端添加接头，其中所述接头具有引物结合区以及连接互补区，所述的连接 互补区与所述的接头连接序列互补；两侧3’端和5’端的接头的引物结合区序列不同。 (3)对上一步骤获得的带有接头的DNA双链核酸片段，用第一引物和第二引物进行 4 CN 111718990 A 说 明 书 3/5 页 扩增，从而获得PCR扩增产物的混合物，其中所述引物具有对应于所述接头的引物结合区的 接头结合区，并且位于接头结合区外侧的测序探针结合区。 还可以对打断产物、末端修复产物、接头产物和富集产物进行纯化。纯化条件及参 数为本领域技术人员所熟知，对反应的条件进行一定的变化或优化也在本领域技术人员能 力范围之内。 捕获 如本文所用，术语“捕获”，指的是探针对文库中外显子区域的DNA片段进行特异性 选择和结合的过程。 DNA分子正常情况下是双链，因此捕获之前，DNA分子必须变为单链，一般是通过加 热使其变性而达到解链目的，解链的DNA分子被迅速冷却，即保持单链状态。文库变性后在 杂交平台与芯片进行捕获杂交。含有外显子区域的DNA片段与固定在芯片上的探针之间在 严格的条件下进行分子杂交。较佳地，芯片上探针分子的浓度要远远高于靶分子浓度。待杂 交完毕后，通过变性等方法收集捕获的序列并纯化，得到来自捕获后的序列混合物。 本领域技术人员可以通过通用的方法进行外显子捕获和目的片段的洗脱和纯化， 也可以应用市售(如：德国Qiagen公司的MinElute PCR Purification kit)试剂盒进行上 述过程。在一个优选例中，对待检测的DNA文库的PCR扩增产物的混合物进行单链化，并用封 闭分子封闭所述扩增产物中对应于第一引物和第二引物的区域，从而获得两端被封闭的单 链扩增产物的混合物；用核酸芯片从所述的经封闭的单链扩增产物的混合物中，捕获疾病 相关的核酸分子；对经捕获的核酸分子，用第三引物和第四引物进行扩增，从而获得第二 PCR扩增产物的混合物，其中第三引物和第四引物分别特异性结合于所述的第一引物和第 二引物；对上一步骤获得的第二PCR扩增产物的混合物进行测序，从而获得样本中疾病相关 核酸分子的核苷酸序列信息。 高通量测序 基因组的“高通量测序”使得人类能够尽早地发现与疾病相关基因的异常变化，有 助于对个体疾病的诊断和治疗进行深入的研究。本领域技术人员通常可以采用三种第二代 测序平台进行高通量测序：454FLX(Roche公司)、SolexaGenome Analyzer(Illumina公司) 和Applied Biosystems公司的SOLID等。这些平台共同的特点是极高的测序通量，相对于传 统测序的96道毛细管测序，高通量测序一次实验可以读取40万到400万条序列，根据平台的 不同，读取长度从25bp到450bp不等，因此不同的测序平台在一次实验中，可以读取1G到14G 不等的碱基数。 本发明的优点和有益效果： 与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：本发明提供了能够诊断马凡综合征 的基因突变；通过对本发明提供的基因突变进行基因分型(genotyping)，即可检测出个体 是否有患病的风险或者检测出个体是否患病。本发明的基因突变的检测可达到早预测、早 诊断、早干预、早治疗的目的；同时，本发明提供基因突变还可用于诊断产品开发，并能够应 用于临床研究、分析及诊断等诸多用途。
