技术摘要：
本发明提供了一种产朊假丝酵母的同源整合表达载体、工程菌及构建方法和应用，涉及基因工程技术领域。整个表达系统的全部遗传元件均来自益生菌产朊假丝酵母和无毒无害的真菌，不携带抗生素抗性基因，不存在抗性基因的漂移、扩散及整合，也不携带其他有毒蛋白基因，不会  全部
背景技术：
内蒙古有着丰富的秸秆资源，全区年产各类农作物秸秆达35亿公斤，相当于全区 天然草原打草量的2倍。当前绝大多数秸秆还是以简单的粉碎、压成颗粒及青贮制作方式饲 喂家畜。奶牛对简单加工玉米秸秆中的干物质(DM)的表观消化率为63.38％，中性洗涤纤维 (NDF)的表观消化率为62.06％，酸性洗涤纤维(ADF)的表观消化率为50.36％。肉牛对简单 粉碎小麦秸秆中的中性洗涤纤维的表观消化率为56.87％，酸性洗涤纤维的表观消化率为 49.04％。就是说秸秆饲料饲喂当中，至少有近37％的干物质、38～46％的中性洗涤纤维、49 ～51％酸性洗涤纤维经粪便流失掉。我国玉米的种植面积持续增长较快，在玉米产量提升 的同时，产生大量的玉米秸秆，但是仅有不到20％的玉米秸秆被有效加工。所以，攻克秸秆 饲料消化利用率的关键技术是解决我区畜牧业生产中粗饲料资源不足和利用率低，降低养 殖成本，提高牛、羊饲养数量和养殖经济效益的有效途径。 由于秸秆营养成分利用率低，适口性差，利用价值不高，每年都有大量秸秆直接还 田或焚烧，用作饲料的仅占一小部分，这不仅造成资源浪费，而且焚烧还污染环境。造成农 作物秸秆用作饲草利用率低的原因主要是随着农作物的成熟，木质化程度也越高，秸秆细 胞壁中木质素含量也增加，同时木质素能与半纤维素分子紧密交联形成疏水的网状结构， 整个细胞壁就成为一个紧密的网状，增加了细胞壁的机械强度和对微生物的抵抗能力；与 此同时，也阻碍了反刍动物瘤胃微生物水解酶与细胞壁中纤维素和半纤维素接触，从而降 低纤维多糖的降解效率。因此木质素被认为是抑制秸秆利用率的主要限制性因素。 到目前为止，仅有少数微生物可以降解木质素，其中绝大部分是真菌，少数是细 菌，但是后者仅有较弱的木质素降解能力。由于白腐真菌能高效地选择性降解木质素，因此 被认为是去除木质素最有应用前景的一大类真菌。然而白腐真菌生长周期长、酶活低，不利 于工业化生产。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于一种产朊假丝酵母的同源整合表达载体、工程菌及 构建方法和应用，通过产朊假丝酵母异源表达木质素降解酶，可提高木质素降解酶产量，为 工业化生产打基础；同时发酵产品不必经过分离纯化，省时且经济实惠。 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案： 本发明提供了一种产朊假丝酵母的同源整合表达载体，所述表达载体以pBR322为 基本载体，所述同源整合表达载体内包括从3’端到5’端依次连接的18S  rDNA基因片段、酵 母三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列GAP-p、木质素过氧化物酶基因、酵母三磷酸甘油 3 CN 111607530 A 说　明　书 2/14 页 醛脱氢酶基因的终止子序列GAP-t和放线菌酮抗性基因CYH； 所述启动子序列GAP-p的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.1所示，所述终止子序列GAP-t 的核苷酸序列如SEQ  ID  NO .2所示，所述放线菌酮抗性基因CYH的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.3所示，所述18S  rDNA基因片段的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.4所示，所述木质素过氧化物 酶基因的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.5所示。 本发明还提供了上述同源整合表达载体的构建方法，包括以下步骤：(1)分别从产 朊假丝酵母中克隆酵母三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列GAP-p、终止子序列GAP-t、 放线菌酮抗性基因CYH和18S  rDNA基因片段，并分别连接至载体pMD19-T  simple  vector上 后，得pT-GP、pT-GT、pT-CYH和pT-rD； (2)以黄孢原毛平革菌的总RNA反转录后得到的cDNA为模板，克隆得到木质素过氧 化物酶基因； (3)将所述pT-GP和pT-GT与pBR322的质粒连接后，得质粒pBR-GAP； (4)将所述pT-CYH与所述质粒pBR-GAP连接后，得质粒pBR-G-L； (5)将所述木质素过氧化物酶基因与所述质粒pBR-G-L连接后，得质粒pGML； (6)将所述质粒pGML与所述pT-rD连接后，得质粒pGMLR； 步骤(2)与(1)、(3)和(4)之间不存在时间上的先后顺序。 优选的，步骤(3)、(4)、(5)和(6)所述连接，均为利用T4  DNA连接酶进行连接。 本发明还提供了一种表达木质素过氧化物酶的工程菌，所述工程菌中包括上述同 源整合表达载体或利用上述构建方法构建得到的同源整合表达载体。 优选的，在利用所述同源整合表达载体在构建所述工程菌前，还包括删除所述同 源整合表达载体中的来自原核的DNA序列，得整合表达载体GMLR；所述来自原核的DNA序列 包括细菌质粒序列的DNA片段。 优选的，所述工程菌以产朊假丝酵母菌为宿主菌。 本发明还提供了一种上述表达木质素过氧化物酶的工程菌的构建方法，包括以下 步骤：(a)删除所述质粒pGMLR中的来自原核的DNA序列，得整合表达载体GMLR； (b)利用所述整合表达载体GMLR电转化产朊假丝酵母菌，得所述工程菌ZHMX4。 优选的，在步骤(b)所述电转化后，还包括转化子的筛选和表达蛋白的鉴定。 优选的，所述转化子的筛选包括初筛和复筛，所述初筛为利用含有CYH的YPD培养 基进行；所述复筛为PCR筛选。 优选的，所述PCR筛选用的引物包括Lip-R1 1和Lip-F1 1；所述Lip-R1 1的核苷酸 序列如SEQ  ID  NO.22所示；所述Lip-F1 1的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.23所示。 本发明提供了一种产朊假丝酵母的同源整合表达载体，整个表达系统的全部遗传 元件均来自益生菌产朊假丝酵母和无毒无害的真菌，不携带抗生素抗性基因，不存在抗性 基因的漂移、扩散及整合，也不携带其他有毒蛋白基因，不会对环境或人和动物带来生物安 全性的危害，达到了食品级，可直接添加到食品和饲料中应用。本发明将所述同源整合表达 载体构建进产朊假丝酵母菌后，形成的工程菌，在传代100代时仍含有目的条带，表明外源 基因没有丢失，在传代培养过程中保持了较高的遗传稳定性。 4 CN 111607530 A 说　明　书 3/14 页 附图说明 图1为检测外源基因遗传稳定性PCR电泳图，其中M表示DL2000marker；1表示YPD (无CYH)培养基中生长的酵母(Day15)；2表示阳性对照：pGMLR质粒PCR产物；3表示菌阴性对 照(一)未转化质粒的产朊假丝酵母基因组PCR产物；4表示阴性对照(二)水的PCR产物； 图2为酵母转化子ZHMX4的SDS-PAGE结果图，其中1表示Protein  marker；2表示未 转化质粒的产朊假丝酵母菌总蛋白(阴性对照)；3表示ZHMX4的总蛋白； 图3为同源整合表达载体pGMLR的模式图。