技术摘要：
传统上将重组大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌用于生产各种氨基酸产品。本发明通过在抗染菌的嗜盐菌中构建生产天冬氨酸及其衍生物和谷氨酸的代谢路径，实现重组嗜盐菌生产天冬氨酸及其衍生物(包括天冬氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、赖氨酸和四氢嘧啶等)和谷氨酸。本发明主要  全部
背景技术：
天冬氨酸是一种必需氨基酸，也可作为前体物质合成多种氨基酸及小分子化合 物，如苏氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、四氢嘧啶等。其中苏氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、赖氨 酸占据氨基酸全球市场的百分之五十以上，广泛用于食物，动物饲料、药用等行业，而谷氨 酸作为味精，需求量也很大[Leuchtenberger  et  al .(2005)Biotechnological  prod uc tion  of  a m ino  a cid s  a nd  d e ri va ti ves :curren t  s ta tus  a nd  prospects .Applied  Microbiology  and  Biotechnology]。四氢嘧啶(1 ,4 ,5 ,6- tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidinecarboxylic  acid，也叫ectoine)是一种在耐盐及嗜 盐微生物中最为广泛存在的渗透压调节物。经研究表明，它可以在高渗透压、辐射、高温及 冷冻等逆境条件下保护蛋白质等生物大分子和细胞膜活性的作用，被称为“化学分子伴 侣”。这种化合物在化妆品、生物制剂和制药方面有很好的应用前景[Bownik  et  al.(2016) E c t o i n e  a s  a  p r o m i s i n g  p r o t e c t i v e  a g e n t  i n  h u m a n s  a n d  animals.Arh.Hig.Rada.Toksikol]。 目前，氨基酸的生产方法主要包括提取法、化学合成法、酶法和微生物发酵法4种。 提取法虽然工艺简单，但由于原料不足，无法进行大规模生产；化学合成法产品安全性得不 到较好的保障，存在一定的环境污染问题。酶的稳定性比较差，且会产生副产物，导致生产 效率低。发酵法通过对微生物进行改造，使其产生氨基酸和小分子产物，原料来源广泛，工 艺简单易行，是目前常用的生产方法[Shu  et  al.(2009)Current  status  of  production  for  amino  acids  and  derivatives.CHINA  CONDIMENT]。目前生产以上氨基酸最常用的微 生物为大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌，二者都需要无菌条件下进行发酵生产，操作比较复杂 且成本较高。 目前四氢嘧啶的主要生产方法也为发酵法，分为直接利用嗜盐菌进行发酵和利用 改造后的传统菌株进行发酵。通过“细菌挤奶法”进行高密度发酵，即在高渗透压下培养细 菌，再使用低渗透压溶质冲洗，不断重复上述过程，最后获得四氢嘧啶[Sauer  et  al . (1998)Bacterial  milking:a  novel  bioprocess  for  production  of  compatible  solutes.Biotechnology  and  Bioengineering]。朱皖宜(中国专利：201310416404.4)等使 用Halomonas  sp.HS-2255及其突变株(保藏号为CGMCC  No.6248)进行发酵生产，在72h得到 了19.9g/L的产量。然而这些天然嗜盐菌产量比较低，工业生产成本较高。
技术实现要素：
本发明的目的是通过构建高产天冬氨酸及其衍生物和谷氨酸的重组型嗜盐菌，实 5 CN 111607551 A 说　明　书 2/38 页 现无灭菌、开放和连续发酵生产上述胞外产品。 因此，本发明提供以下各项： 1.重组嗜盐菌(Halobacteriaceae)，其包含生产天冬氨酸或生产谷氨酸的代谢路 径(代谢途径)。 2.根据以上1所述的重组嗜盐菌，其还包含：生产天冬氨酸的衍生物的代谢途径， 所述天冬氨酸的衍生物选自赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和四氢嘧啶中的一种或多种 (一种，两种，三种，四种或五种)。 3.根据以上1或2所述的重组嗜盐菌，其中所述代谢路径是通过在野生型嗜盐菌中 表达(过表达)负责该代谢途径的(外源)基因或(外源)基因的组合和/或减弱或阻断或敲除 所述代谢路径的支路和/或分解代谢路径的(内源)基因或(内源)基因的组合(使其为该基 因缺陷型)来构建的，优选地基因的减弱或阻断可以通过表达(过表达)所述基因的抑制剂 基因来实现的，并且优选所述重组嗜盐菌还表达用于分泌天冬氨酸或其衍生物或谷氨酸到 胞外的分泌蛋白。优选地，所述(外源)基因或(外源)基因的组合或抑制剂基因或编码所述 分泌蛋白的基因来自大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌。微生物中基因的敲除方法是本领域技术人 员公知的。优选地，通过CRISPR-Cas9方法进行基因向嗜盐菌基因组中的整合和/或基因敲 除。在本发明中，表达(过表达)基因可以通过本领域公知的基因表达方法/体系进行，并且 表达(过表达)基因中所用的启动子优选利用porin启动子库中的启动子[Shen  et  al . (2018)Promoter  engineering  for  enhanced  p(3hb-co-4hb)production  by  Halomonas  bluephagenesis.ACS  Synthetic  Biology]。 4.根据以上1-3中任一项所述的重组嗜盐菌，其特征在于以下中的一个或多个(优 选包括以下特征(1)并且包括以下特征(2)-(6)中任一个，例如特征(1) (2)的组合，特征 (1) (3)的组合，特征(1) (4)的组合，特征(1) (5)的组合或特征(1) (6)的组合)： (1)所述重组嗜盐菌通过过表达天冬氨酸合成基因来生产天冬氨酸，优选所述天 冬氨酸合成基因为pyc(丙酮酸羧化酶)基因、ppc基因(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶)和aspC基因 (天冬氨酸转氨酶)，更优选为谷氨酸棒杆菌的(丙酮酸羧化酶)pyc基因、大肠杆菌的ppc(磷 酸烯醇丙酮酸羧化酶)基因和aspC(天冬氨酸转氨酶)基因，最优选pyc基因的核苷酸序列为 SEQ  ID  NO:46所示序列；ppc基因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:35所示序列；和/或aspC基因 的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:36所示序列； (2)所述重组嗜盐菌通过过表达赖氨酸合成基因来生产赖氨酸，优选所述赖氨酸 合成基因为lysC*(天冬氨酸激酶突变体)基因、asd(天冬氨酸半醛脱氢酶)基因、dapA(二氢 吡啶二羧酸合成酶)基因、lysE(赖氨酸分泌蛋白)基因和zwf(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)基因， 更优选所述重组嗜盐菌为thrB(高丝氨酸激酶)基因和metX(高丝氨酸乙酰转移酶)基因缺 陷型，还更优选所述赖氨酸合成基因为大肠杆菌的lysC*基因和asd基因，谷氨酸棒杆菌的 dapA基因、lysE基因和zwf基因，最优选lysC*基因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:37所示序列； asd基因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:38所示序列；dapA基因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:47 所示序列；lysE基因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:48所示序列；zwf基因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:49所示序列；thrB基因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:2或19所示序列；和/或metX基因 的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:3或20所示序列； (3)所述重组嗜盐菌通过过表达蛋氨酸合成基因来生产蛋氨酸，优选所述蛋氨酸 6 CN 111607551 A 说　明　书 3/38 页 合成基因为metX(高丝氨酸乙酰转移酶)基因、yjeH(蛋氨酸分泌蛋白)基因、lysC*(天冬氨 酸激酶突变体)基因和malY(胱硫醚裂解酶)基因，更优选所述重组嗜盐菌为thrB(高丝氨酸 激酶)基因、metN(蛋氨酸吸收相关的ATP结合蛋白)基因和dapA(二氢吡啶二羧酸合成酶)基 因缺陷型，还更优选所述蛋氨酸合成基因为谷氨酸棒杆菌的metX基因，大肠杆菌的yjeH基 因、lysC*基因和malY基因，最优选metX基因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:50所示序列；yjeH 基因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:39所示序列；lysC*基因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:37所 示序列；malY基因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:40所示序列；thrB基因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:2或19所示序列；metN基因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:5或22所示序列；和/或dapA基 因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:6或23所示序列； (4)所述重组嗜盐菌通过过表达苏氨酸合成基因来生产苏氨酸，优选所述苏氨酸 合成基因为thrA*BC基因簇[thrA*(天冬氨酸激酶突变体)基因、thrB(高丝氨酸激酶)基因 和thrC(苏氨酸合成酶)基因]、lysC*(天冬氨酸激酶突变体)基因、rhtC(苏氨酸分泌蛋白) 基因，更优选所述重组嗜盐菌为sstT(苏氨酸吸收蛋白)基因和tdh(苏氨酸脱氢酶)基因缺 陷型，还更优选所述蛋氨酸合成基因为大肠杆菌的thrA*BC基因簇[thrA*基因、thrB基因和 thrC基因]、大肠杆菌的lysC*基因和rhtC基因，最优选thrA*基因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:41所示序列；thrB基因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:42所示序列；thrC基因的核苷酸序列 为SEQ  ID  NO:43所示序列；lysC*基因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:37所示序列；rhtC基因的 核苷酸序列为SEQ  ID  NO:44所示序列；sstT基因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:8或25所示序 列；和/或tdh基因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:9或26所示序列； (5)所述重组嗜盐菌通过过表达异亮氨酸合成基因来生产异亮氨酸，优选所述异 亮氨酸合成基因为ilvA(苏氨酸脱水酶)基因、brnFE(氨基酸转运蛋白)基因、thrB(高丝氨 酸激酶)基因和ilvBN(乙酰羟基氨酸合酶)基因和tdcB(苏氨酸脱水酶)基因，更优选所述重 组嗜盐菌为metX(高丝氨酸乙酰转移酶)基因和dapA(二氢吡啶二羧酸合成酶)基因缺陷型， 还更优选所述异亮氨酸合成基因为谷氨酸棒状杆菌的ilvA基因、brnFE基因、thrB基因和 ilvBN基因和大肠杆菌的tdcB基因，最优选ilvA基因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:62所示序 列；brnF基因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:51所示序列；brnE基因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:52所示序列；thrB基因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:53所示序列；ilvB基因的核苷酸序列 为SEQ  ID  NO:54所示序列；ilvN基因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:55所示序列；tdcB基因的 核苷酸序列为SEQ  ID  NO:45所示序列；metX基因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:3或20所示序 列；和/或dapA基因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:6或23所示序列； (6)所述重组嗜盐菌通过过表达四氢嘧啶合成基因来生产四氢嘧啶，优选所述四 氢嘧啶合成基因为ectABC基因簇[ectA(氨基丁酸乙酰基转移酶)基因、ectB(二氨基丁酸氨 基转移酶)基因、ectC(四氢嘧啶合成酶)基因]、asd(天冬氨酸半醛脱氢酶)基因和lysC(天 冬氨酸激酶)基因，更优选所述重组嗜盐菌为doeA(四氢嘧啶水解酶)基因和ectD(四氢嘧啶 羟化酶)基因缺陷型，还更优选所述四氢嘧啶合成基因为Halomonas  aydingkolgenesis  M1 和Halomonas  bluephagenesis  TD01的ectABC基因簇[ectA基因、ectB基因、ectC基因]、asd 基因和谷氨酸棒杆菌的lysC基因，最优选ectA基因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:10或27所示 序列；ectB基因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:11或28所示序列；ectC基因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:12或29所示序列；asd基因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:13或30所示序列；lysC基因的 7 CN 111607551 A 说　明　书 4/38 页 核苷酸序列为SEQ  ID  NO:56所示序列；doeA基因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:14或31所示序 列；和/或ectD基因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:15或32所示序列；和/或 (7)所述重组嗜盐菌通过过表达谷氨酸合成基因来生产谷氨酸，优选所述谷氨酸 合成基因为ppc(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶)基因、pyc(丙酮酸羧化酶)基因、icd(异柠檬酸脱 氢酶)基因、gdh(谷氨酸脱氢酶)基因、odhI(酮戊二酸脱氢酶抑制剂)基因和NCgl1221(谷氨 酸输出蛋白)基因，更优选所述重组嗜盐菌为proB(谷氨酸激酶)基因和argJ(精氨酸生物合 成双功能蛋白)基因缺陷型，还更优选所述谷氨酸合成基因为谷氨酸棒杆菌的ppc基因、pyc 基因、icd基因、gdh基因、odhI基因和NCgl1221基因，最优选ppc基因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:57所示序列；pyc基因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:46所示序列；icd基因的核苷酸序列为 SEQ  ID  NO:59所示序列；gdh基因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:58所示序列；odhI基因的核苷 酸序列为SEQ  ID  NO:60所示序列；NCgl1221基因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:61所示序列； proB基因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:16或33所示序列；和/或argJ基因的核苷酸序列为SEQ  ID  NO:17或34所示序列。 5 .根据以上1-4中任一项所述的重组嗜盐菌，其中所述嗜盐菌为嗜盐单胞菌属 (Halomonas  sp.)，更优选为Halomonas  bluephagenesis或Halomonas  aydingkolgenesis， 最优选为Halomonas  bluephagenesis  TD01(菌种保藏编号CGMCC  No.4353)或Halomonas  aydingkolgenesis  M1(菌种保藏编号CGMCC  No.19880)。 6.一种制备天冬氨酸或其衍生物的方法，所述天冬氨酸的衍生物选自赖氨酸、蛋 氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和四氢嘧啶中的一种或多种(一种，两种，三种，四种或五种)，所述 方法包括使用根据以上1-5中任一项所述的重组嗜盐菌来生产天冬氨酸或其衍生物。 7.一种制备谷氨酸的方法，所述方法包括使用根据以上1-5中任一项所述的重组 嗜盐菌来生产谷氨酸。 8.根据以上6或7所述的方法，其中所述方法可以在开放无灭菌和/或批次或连续 发酵的条件下进行。 9.一种制备根据以上1-5中任一项所述的重组嗜盐菌的方法，所述方法包括构建 具有以上4中所述特征中一个或多个(优选包括所述特征(1)并且包括所述特征(2)-(6)中 任一个，例如特征(1) (2)的组合，特征(1) (3)的组合，特征(1) (4)的组合，特征(1) (5) 的组合或特征(1) (6)的组合)的重组嗜盐菌。 10.根据以上9所述的方法，其中所述表达(过表达)是通过将所表达的基因在一个 或多个质粒上表达或者被整合到所述嗜盐菌的基因组中表达来实现的，和/或所述基因缺 陷型是通过从所述嗜盐菌中敲除所述基因来实现的。 发明详述 针对现有生产天冬氨酸及其衍生物和谷氨酸的技术的不足，本发明的发明人经过 反复的研究和实验验证，发明了一种重组嗜盐菌以及使用该嗜盐菌生产天冬氨酸及其衍生 物和谷氨酸的方法。 1.