技术摘要：
本发明提供了一种人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物的制备方法及其产物和应用，涉及生物医药技术领域。本发明提供的制备方法操作简便，利用冷沉淀制备vWF/Ⅷ复合物，通过对冷沉淀的充分利用，能间接节约稀缺血浆资源，对提高市场竞争力有着重大意义。本发明制备得  全部
背景技术：
人血管性血友病因子(vWF)是一种多聚体血浆糖蛋白，以超分子质量多聚体形式 存在，其分子量250～20000kDa(每个成熟亚单位250KDa)，是目前血浆中已知的分子量最大 的蛋白。正常人血浆中平均含量10mg/L(0.5～2IU/mL)，一级结构含2050个氨基酸残基，半 衰期12～18小时。vWF在原发性止血中起着重要作用：(1)其负责与血小板膜GPⅠb-Ⅸ复合物 及内皮下胶原结合，介导血小板在血管损伤部位的黏附，有助于纤维蛋白凝固的形成；(2) vWF还能结合GPⅡb-Ⅲa，参与血小板的聚集过程；(3)同时vWF也是人凝血因子Ⅷ(FⅧ)的运 输剂和稳定剂。血浆中vWF多聚体的大小与其功能有密切关系，其分子量越大，与血小板结 合能力越强，更能促进血小板聚集、血栓形成与微血管病性溶血。临床上，纯化的vWF主要用 于血管性血友病(vWD)的治疗。vWD是一类较常见的遗传性出血性疾病，男女都可患病，具报 道，vWD发病率约为万分之一，仅次于甲型血友病。 人凝血因子Ⅷ(FⅧ)亦称抗血友病球蛋白，是一种血浆糖蛋白，分子量约为320KD， 在血浆中的含量极微，1ml血浆中仅含0.1～0.2μg。FⅧ在凝血机制中的内部途径的级联反 应中起着必不可少的作用。临床上广泛应用于治疗甲型血友病和获得性凝血因子Ⅷ缺乏而 致的出血症状及这类病人的手术出血治疗。 血浆中富含纤维蛋白原、纤维结合蛋白、FⅧ、vWF等成分，因此也曾在临床上用于 治疗甲型血友病、vWD等疾病。目前人血浆来源的vWF在国际上已上市的有法国LFB公司的 Grifols公司的 Octapharma公司的 CSL公司的 等，国内尚无同类产品问世。 为高纯度的vWF制品，基本不含FⅧ，以冷沉淀为起始原料，再经二步 阴离子交换层析和一步亲和层析，步骤繁琐、费时，且不得用于治疗甲型血友病。 制品中vWF/Ⅷ＞0.4，采用多糖配基亲和层析，但亲和层析凝胶非常昂贵，来 源有限，提高了生产成本。 制品中vWF/Ⅷ＝1，采用的是凝胶过滤层析(SEC)。SEC上 样体积受限，且无法遵循线性放大原则，为保证良好的分离效果，须要求相对较高的柱装填 高度，在保证不超压的前提下，工艺流速会明显受限，使得整个生产过程都极为繁琐、费时。 制品中vWF/Ⅷ＞2.2，以冷沉淀为起始原料，经低温沉淀、铝胶吸附、甘氨酸沉 淀、NaCl沉淀、巴氏(60℃10h)灭活，整个过程不使用层析技术，但经3步沉淀法，步骤繁琐、 费时。 当产品中vWF与FⅧ的比例为1:1时，能较好的体现正常的人体血浆，vWF和FⅧ在体 内自然存在的比例即为1:1。另外，临床Meta分析表明，部分vWF或FⅧ浓缩物临床使用过程 4 CN 111592591 A 说　明　书 2/9 页 中可出现FⅧ积聚，给药后应监测FⅧ水平。FⅧ水平增高是血栓栓塞形成的已知风险。归功 于vWF与FⅧ的1:1比例，1:1的vWF/Ⅷ即使多次用药也不会引起FⅧ积聚。 止血过程：当人受伤流血时，血小板细胞会迅速汇集到受伤血管内壁，“堵”住受伤 的血管让血液不外流，vWF则充当“胶水”的作用，将血小板固定于受伤血管内壁，形成血小 板团。血小板团为血液凝固提供一个表面位置，此时血液中的凝血因子(如FⅧ)，启动内外 源性凝血途径，聚集在血小板团表面，形成凝块并闭合伤口，产生“结痂”。vWD的患者中，这 种“胶水”不见了，血小板难以成团；同时vWF是FⅧ的运输剂，当vWF水平低下时，FⅧ水平亦 低下。没有正常的FⅧ水平，体内内外源凝血途径的作用减弱，形成固体凝块闭合伤口的时 间延长，出血时间延长。故大部分vWD患者，在vWF因子缺失的同时，FⅧ因子也存在缺失，临 床数据资料也印证了这一点。所以在补充vWF因子的同时，需再补充FⅧ因子，故制备vWF/Ⅷ 的复合物显得很有必要。 中国专利(申请号201610077346.0)提供了一种从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料 中制备vWF的工艺，以冷沉淀为起始原料，经二步阴离子交换层析和一步亲和层析，步骤繁 琐。同样，中国专利(申请号201811633049.5)也提供了一种从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废 料中制备高纯度血管性血友病因子的工艺，以冷沉淀为起始原料，经一步阴离子交换层析、 低电负性明胶吸附和一步离子交换层析，步骤繁琐。但是，无论是国外已上市产品还是中国 专利提供的方法，整个生产过程至少需使用二步离子交换层析或二步沉淀法，繁琐费时，生 产成本较大。 随着目前vWD疾病诊断技术的不断提升，vWF市场需求量将得到提升，预计2020年 将达到1200万支(200IU/支)。目前，国内还未有产品上市，因此，开发一种杂质含量极少、 vWF:Ag/vWF:Act≈1:1，并且安全性较好的vWF制备工艺，是很有必要的。
技术实现要素：
有鉴于