技术摘要：
本发明提供了一种NAC2基因mRNA在葫芦科砧穗间运输的分子鉴定方法，包括如下步骤：(1)、黄瓜与南瓜进行自嫁接及黄瓜/南瓜、南瓜/黄瓜进行异嫁接；(2)、分析黄瓜NAC2基因的核苷酸序列，寻找与南瓜同源基因的差异片段，设计黄瓜NAC2基因的特异性引物；(3)、用该引物对适温  全部
背景技术：
嫁接是将植物体的芽或枝接到另一植物体的适当部位，使两者接合形成一个新的 植物体的技术。园艺领域中，嫁接常用来获得抗性、矮化、优质等性状，提高产品品质。大量 研究表明，利用抗性砧木进行嫁接，可增强蔬菜嫁接苗根系吸收能力，并提高嫁接植株的抗 逆性。 前人经过大量的研究发现，RNA作为一种信息分子，由细胞间和长距离的信息网络 介导其在嫁接植物砧穗之间运输，从而调控植物生长发育及抗逆性相关能力。因此通过鉴 定特定基因转录得出的  mRNA在黄瓜自异嫁接植株间的运输情况，探究嫁接黄瓜砧穗间长 距离mRNA分子调控机制。从而利用其调控黄瓜生长、品质性状及提高冬春季节黄瓜产量，对 于黄瓜越冬高效栽培生产具有重要意义。 最新研究显示，嫁接园艺作物砧穗间存在大量的mRNA、小分子  RNA和蛋白质等信 号分子，通过胞间连丝在相邻的细胞间局部移动，进入韧皮部运输，参与砧穗交流互作，调 控转录、参与基因表达及蛋白翻译，并调控器官生长发育及对逆境胁迫的适应性(Lucas  et  al.，  2001，Turgeon  et  al.，2009)。 迄今为止，研究发现，能在葫芦科韧皮部进行长距离运输的基因  mRNA及其编码的 蛋白质有很多。如免疫印迹分析结果表明，南瓜的蛋白质PP1和PP2从南瓜砧木中转移，在黄 瓜接穗中积累，定位于外韧皮部的筛分子和伴胞中，但在黄瓜中没有检测到南瓜PP1和PP2  的mRNA信号，这表明PP蛋白质发生了长距离运输(Golecki  et  al.，1999)。异种嫁接实验证 明，部分mRNA能从甜瓜砧木到南瓜接穗进行远距离的转移(Omid  et  al.，2007)。 NAC2编码一个转录因子蛋白，在拟南芥中AtNAC2响应盐胁迫，也可以被ABA和NAA 诱导，其能够促进或抑制下游基因，对拟南芥的侧根发育起到调控作用(He  et  al.，2005)。 在拟南芥中小麦  TaNAC2的过表达导致拟南芥对干旱，盐和冷胁迫的耐受性增强(Mao et  al .，2011)。这说明NAC2  mRNA的长距离运输可能对嫁接植株的发育及抗性调控有潜在意 义。 目前研究用来检测植物韧皮部mRNA长距离运输的方法有很多，如RNA-蛋白免疫共 沉淀法(Ham  et  al.，2009)，巢式RT-PCR(Harada et  al.,2009)，Northern杂交法等。这些 方法虽然可以比较准确地检测基因在韧皮部中的传递性，但其过程繁琐，要求多，操作不 易，增加了实验难度。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种NAC2  基因mRNA在葫芦 科砧穗间运输的分子鉴定方法。 4 CN 111593056 A 说　明　书 2/6 页 为达到以上目的，本发明采取的技术方案是： 一种黄瓜NAC2基因，其核苷酸序列如SEQ  ID  NO.1所示。 黄瓜NAC2基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ  ID  NO.2所示。 一种NAC2基因mRNA在葫芦科砧穗间运输的分子鉴定方法，包括如下步骤： (1)黄瓜与南瓜分别进行自嫁接；以黄瓜为接穗，南瓜为砧木进行嫁接；以南瓜为 接穗，黄瓜为砧木进行嫁接，嫁接方式均为下胚轴嫁接； (2)分析所述黄瓜NAC2基因的核苷酸序列，寻找与南瓜同源基因的差异片段，设计 黄瓜NAC2基因的特异性引物，保证以黄瓜cDNA为模板时可以扩增得到条带，以南瓜cDNA为 模板时无法扩增，电泳不产生条带； (3)将嫁接植株分为两组，一组低温处理，另一组适温生长。每组都包含黄瓜、南瓜 自嫁接以及异嫁接植株，提取嫁接成活后的砧木和接穗的RNA，反转录成cDNA，PCR扩增黄瓜 NAC2的基因片段； (4)凝胶电泳检测是否有正确的电泳条带：如果在嫁接体系中存在RNA的传递，则 在砧木的扩增产物中会出现接穗的特异性条带，同样在接穗的扩增产物中也会出现砧木的 特异性条带；如果不发生传递，那么扩增产物的电泳图中就会显示出各自相应样品的条带 而无其他杂带，即用黄瓜NAC2基因的特异性引物在异嫁接南瓜部分PCR  扩增出的产物如果 有特异性条带，则发生运输，无特异性条带则不发生运输。 在上述方案的基础上，步骤(1)具体过程包括： 1)接穗、砧木的培育：将砧木和接穗种子分别进行育苗，待接穗长至一叶一心，砧 木子叶完全展开，砧木和接穗的下胚轴粗度保持一致。 2)下胚轴嫁接：用刀片将接穗子叶下方1cm处斜向下切出30°斜面，去除砧木的全 部子叶，用刀片在砧木子叶下方1cm处斜切一刀，切面长度与接穗的斜面长度一致，然后将 接穗与砧木切面对齐贴紧并用嫁接夹固定；然后将砧木子叶部分嫁接至原接穗切面处，用 嫁接夹固定住嫁接口处。 3)嫁接后管理：将嫁接苗放置育苗套装中，透明塑料顶罩上用喷壶充分湿润，育苗 基质浇透水，保持育苗套装内小环境的湿度；将育苗套装用保鲜膜密封后放入28±2℃培养 箱中暗培养2-3d，后转入弱光培养3-4d，之后进行正常光照培养。 在上述方案的基础上，步骤(2)中设计的特异性引物序列为： 上游引物5‘-CTCCGTCCCCAGAATGCACA-3’ 下游引物5‘-CAAATGGAACGTCCTCTGGCATA-3’。 在上述方案的基础上，步骤(3)中分别提取低温处理和适温生长的嫁接植株的两 叶一心时期的根和第一真叶的RNA进行反转录。 在上述方案的基础上，步骤(3)中PCR扩增反应程序如下： 95℃ 预变性3min； 95℃  30s； 60℃  30s； 72℃  1min； 39个循环； 72℃最后延伸5min。 5 CN 111593056 A 说　明　书 3/6 页 本发明保护所述的分子鉴定方法在葫芦科植物砧穗间NAC2  mRNA分子传递的鉴定 上的应用。 有益效果：本发明提供的方法快速、灵敏，准确性高，简便，能够应用于其他葫芦科 植物。 附图说明 本发明有如下附图： 图1为运输性鉴定的检测结果示意图。 图2所示为NAC2氨基酸序列同源性比较。图中Cucurbita moschata：南瓜； Cucurbita  pepo：西葫芦；Cucurbita  maxima：笋瓜；  Cucumis  sativus：黄瓜；Cucumis  melo：甜瓜；Momordica  charantia：苦瓜。 图3所示为NAC2氨基酸序列系统进化树分析图。