技术摘要：
本发明提供一种用于检测β‑地中海贫血的PCR试剂及试剂盒，该PCR试剂通过采用高耐受性直扩PCR酶对β‑地中海贫血检测全血样品进行扩增，无需提取样品中的基因组DNA，利用该PCR试剂获得的检测试剂盒，缩短了检测人员整个检测时间，大大节约了时间成本，同时因为减少了DN  全部
背景技术：
β-地中海贫血是由血红蛋白四聚体形式的β珠蛋白合成减少或合成缺乏引起的， 根据临床症状和血液学特征分为：β-地中海贫血携带者状态，中间型地中海贫血和重型地 中海贫血。β-地中海贫血的携带者状态是由β-地中海贫血的杂合性引起的，在临床上无症 状，并由特定的血液学特征定义。重型地中海贫血是严重的输血依赖性贫血，中间型地中海 贫血严重程度从无症状携带者状态到严重输血依赖性贫血类型。 β-地中海贫血在分子水平上是异质的。迄今为止，已经鉴定出200多种致病突变。 大多数突变是导致移码的寡核苷酸的单核苷酸取代、缺失或插入。中国人群中有5种常见的 突变，以CD17(A→T)，-28M(A→G)、CD41/42(-TTCT)、IVS-II-654(C→T)、CD71/72( A)居多， 占所有突变类型的90％。由于某些人群中β珠蛋白基因突变携带率高，故胎儿遗传到β珠蛋 白突变基因的概率也高。随着科技的发展，通过早期分子诊断以及遗传咨询和产前诊断，可 以使具有生育风险的夫妇对其生育选择做出明智的决定。 β-地中海贫血的传统检测方法有血常规参数检测分析、红细胞渗透脆性试验、血 红蛋白电泳试验等，这些检测方法的特异性不高，较易产生假阴性。随着生物技术的发展， 诞生了一些特异性高的分子诊断方法，例如TaqMan探针技术、寡核苷酸探针杂交、变性高效 液相色谱技术、多重连接酶依赖的探针扩增技术、基因芯片等，但是这些技术均需要提取外 周血、绒毛、羊水中的DNA，DNA的质量是PCR成功的一个非常关键的因素，直接影响后续试 验。而提取与纯化DNA时极易受污染，使得检测结果易出现假阴性或者假阳性，且DNA的提取 和纯化时间约1-2h，检测过程耗费时间长。
技术实现要素：
本发明的一个目的在于提供一种用于检测β-地中海贫血的PCR试剂；本发明的另 一个目的在于提供一种用于检测β-地中海贫血的试剂盒。本发明使得在β-地中海贫血检测 过程中免去DNA提取和纯化过程，提高了检测结果的准确性，并且节约检测耗费时间。 一方面，本发明提供一种用于检测β-地中海贫血的PCR试剂，包括高耐受性直扩 PCR酶，缓冲液，dNTP混合物，PCR增强剂，以及用于扩增待检测样品中β珠蛋白基因片段的 PCR引物，所述β珠蛋白基因片段含有与β珠蛋白基因突变探针发生特异性杂交的DNA序列。 在一些实施例中，PCR引物包括两对引物，分别为SEQ  ID  NO.1和SEQ  ID  NO.2、SEQ  ID  NO.3和SEQ  ID  NO.4。 在一些实施例中，所述PCR增强剂包括二甲基亚砜、甘油、甲酰胺、氯化四甲铵、谷 氨酸钾和硫酸铵。 在一些实施例中，所述PCR引物的终浓度为0.4μm-0.8μm。 3 CN 111593112 A 说　明　书 2/19 页 另一方面，本发明提供一种用于检测β-地中海贫血的试剂盒，包括上述用于检测 β-地中海贫血的PCR试剂，以及用于检测β-地中海贫血的核酸杂交膜条和杂交试剂。 在一些实施例中的，所述用于检测β-地中海贫血的核酸杂交膜条包括一尼龙膜基 底，以及固定于所述尼龙膜基底上的β珠蛋白基因突变探针和对应的β珠蛋白基因正常探 针，所述β珠蛋白基因突变探针选自SEQ  ID  NO.5～SEQ  ID  NO.21中的至少一个DNA序列或 其反向互补序列，所述β珠蛋白基因正常探针选自SEQ  ID  NO.22～SEQ  ID  NO.32中的至少 一个DNA序列或其反向互补序列。 在一些实施例中的，所述β珠蛋白基因突变探针和所述β珠蛋白基因正常探针在5’ 端或3’端带有氨基标记，所述尼龙膜基底带有羧基标记，所述β珠蛋白基因突变探针和所述 β珠蛋白基因正常探针通过共价结合固定在所述尼龙膜基底上。 在一些实施例中的，所述杂交试剂包括裂解液、洗膜缓冲液、生物素抗体和显色 液。 在一些实施例中的，所述生物素抗体为过氧化物酶，所述显色液为四甲基联苯胺。 本发明的有益效果： 解决了现有的β-地中海贫血检测试剂盒必须从样本中提取基因组DNA，而且必须 是高质量的DNA，从而影响检测准确性以及检测时间长的问题；本发明试剂盒无需提取样品 中的基因组DNA，全血即可用于PCR扩增模板，从而缩短了检验人员整个检验时间，大大节约 了时间成本，提高了检测准确性。 附图说明 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附 图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对 本发明范围的限定。 图1为PCR扩增产物凝胶电泳图。一共有五个全血样品，其中1-5号泳道是用传统方 法先进行基因组DNA提取纯化再进行PCR扩增后的电泳结果，6-10号泳道是对应的本发明提 供的PCR试剂扩增全血样品后的电泳结果，阴性对照是以无菌水为模板扩增的电泳结果，阳 性对照是以正常无突变的基因组DNA为模板扩增的电泳结果。DNAmarker为1000bpLadder。 图2-图4为本发明的β-地中海贫血检测试剂盒检测全血样品结果图。 图2为1-2号全血样品检测结果图。 图3为3-4号全血样品检测结果图。 图4为5号全血样品检测结果图。 图5为全血样品检测结果的阳性对照Y和阴性对照N。