技术摘要：
本发明公开了一种合成2'‑岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其构建方法与应用，属于代谢工程技术领域。本发明通过在大肠杆菌MG1655的鞭毛驱动蛋白基因fliR位点整合外源α‑1,2‑岩藻糖基转移酶的基因，进一步将岩藻糖激酶的基因敲入至大肠杆菌MG1655基因组L‑墨角藻糖激酶  全部
背景技术：
人乳低聚糖(Human  milk  oligosaccharides,HMOs)是一类构成母乳特有的复合 碳水化合物，通过刺激新生儿中有益肠道细菌如双歧杆菌和乳酸杆菌的生长，平衡肠道菌 群的发育可能对调节新生儿出生后免疫系统起重要作用，作为先进婴儿配方食品的功能性 成分非常重要。此外，HMOs可以抑制病原体与上皮细胞表面聚糖的粘附，从而限制一些病原 体的毒力。根据组成HMOs的单糖结构单元，HMOs可分为中性岩藻糖基乳糖，酸性唾液酸乳糖 和中性非岩藻糖基化乳糖三种。在多种HMOs寡糖结构类别中，大约50％的HMOs是岩藻糖基 化的，而2'-岩藻糖基乳糖(2'-Fucosyllactose,2'-FL)是目前最具有潜力的一种岩藻糖基 乳糖，已被美国食品和药物管理局(FDA)批准为安全的食品添加剂，可作为高档婴幼儿配方 食品中的营养添加剂。岩藻糖基化的2'-FL可通过α-1,2-岩藻糖基转移酶，以GDP-L-岩藻糖 (GDP-L-fucose,GDP-L-Fuc)为供体、乳糖为底物催化合成。 目前，2'-FL的生产方法主要有化学合成法、酶合成法和生物合成法。在化学合成 法中，由于使用高浓度的有毒试剂，会对环境造成一定的污染。在酶法合成中，2'-FL的催化 合成需要昂贵的GDP-L-Fuc前体试剂，这大幅增加了生产成本。而生物合成法是利用细菌合 成GDP-L-Fuc前体，并在α-1,2-岩藻糖基转移酶的作用下，以环境友好的方式自身代谢合成 2'-FL。因此，生物合成法具有更好的工业应用前景，并受到越来越多研究者的青睐。例如， 研究者利用岩藻糖补救途径可以实现在酿酒酵母(Saccharomyces  Cerevisiae)中合成2'- FL，但由于酿酒酵母的发酵周期较长，限制了其在工业生产的广泛应用。 大肠杆菌MG1655能够内源性地合成2'-FL的前体物质GDP-L-Fuc，在外源α-1,2-岩 藻糖基转移酶和底物乳糖的催化作用下合成岩藻糖基化的2'-FL(如图1所示)。然而，在以 葡萄糖或甘油为碳源的内源性从头合成途径中，GDP-L-Fuc同时也是合成荚膜异多糖酸的 中间体。因此，2'-FL的合成前体GDP-L-Fuc容易被其他竞争途径所消耗，导致大肠杆菌 MG1655合成2'-FL所需的前体GDP-L-Fuc的含量非常有限。虽然在目前研究中，多种策略包 括过表达与辅因子相关酶的基因、删除代谢竞争途径上的相关基因等，被用来提高2'-FL的 产量，但这些方法构建的质粒容易对菌体造成一定的代谢负担，从而使细胞在生产过程中 容易出现质粒丢失的情况。因此，为在发酵过程中产生更稳定的工程菌株，可以将与2'-FL 和GDP-L-Fuc合成相关的基因敲入到大肠杆菌的基因组上，以构建生产2'-FL的无质粒重组 大肠杆菌。但是目前整合到基因组上构建的菌株合成2'-FL的产量较低，不能适用于工业化 生产。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明提供一种合成2'-岩藻糖基乳糖的无质粒重组大肠 3 CN 111575220 A 说　明　书 2/6 页 杆菌，通过在大肠杆菌MG1655的鞭毛驱动蛋白基因fliR位点整合外源α-1,2-岩藻糖基转移 酶的基因，进一步将岩藻糖激酶的基因敲入至大肠杆菌MG1655基因组L-墨角藻糖激酶基因 fuck位点，并敲除大肠杆菌MG1655上乳糖操纵子中的转录阻遏物基因lacI，获得了可高效 合成2'-FL的无质粒工程菌株，其胞内胞外积累总量达到806.2mg/L。 本发明的第一个目的是提供一种合成2'-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌，所述重 组大肠杆菌是在大肠杆菌的鞭毛驱动蛋白基因fliR位点整合α-1 ,2-岩藻糖基转移酶的基 因，在L-墨角藻糖激酶基因fuck位点整合岩藻糖激酶的基因，并敲除大肠杆菌上乳糖操纵 子中的转录阻遏物基因lacI。 进一步地，所述的α-1 ,2-岩藻糖基转移酶的整合片段核苷酸序列如SEQ  ID  NO.1 所示。 进一步地，所述的岩藻糖激酶的整合片段核苷酸序列如SEQ  ID  NO.2所示。 进一步地，所述的转录阻遏物基因lacI的敲除片段核苷酸序列如SEQ  ID  NO.3所 示。 进一步地，所述的大肠杆菌为大肠杆菌MG1655。 本发明的第二个目的是提供所述的重组大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤： S1、构建包含鞭毛驱动蛋白基因fliR位点的上下游同源臂、P11启动子和α-1,2-岩 藻糖基转移酶基因组成的整合片段，与包含pTarget质粒共同转入带有pCas9质粒的大肠杆 菌MG1655感受态中，构建重组大肠杆菌MG1655△fliR::futC；所述的pTarget质粒包含鞭毛 驱动蛋白基因fliR的N20序列的sgRNA，所述的pCas9质粒用于表达Cas9蛋白； S2、构建包含由L-墨角藻糖激酶基因fuck位点的上下游同源臂、P11启动子和岩藻 糖激酶基因组成的整合片段，与包含pTarget质粒共同转入到带有pCas9质粒的重组大肠杆 菌MG1655  △fliR::futC感受态中，构建重组大肠杆菌MG1655  △fliR::futC ,△fuck:: fkp；所述的pTarget质粒包含L-墨角藻糖激酶基因fuck的N20序列的sgRNA，所述的pCas9质 粒用于表达Cas9蛋白； S3、构建包含由乳糖操纵子转录阻遏物基因lacI位点的上下游同源臂组成的敲除 片段，与包含pTarget质粒共同转入到带有pCas9质粒的重组大肠杆菌MG1655  △fliR:: futC,△fuck::fkp感受态中，构建重组大肠杆菌MG1655  △fliR::futC,△fuck::fkp,△ lacI；所述的pTarget质粒包含乳糖操纵子转录阻遏物基因lacI的N20序列的sgRNA，所述的 pCas9质粒用于表达Cas9蛋白。 本发明的第三个目的是提供所述的重组大肠杆菌发酵生产2'-岩藻糖基乳糖的方 法。 进一步地，所述的方法包括如下步骤： S1、将重组大肠杆菌单菌落接种在种子培养基中培养8～12h，制备成种子液； S2、将种子液以0.5～2％的接种量接种至发酵培养基中，于35～38℃、200～250r/ min条件下培养5～10h后，添加L-岩藻糖1～5g/L、乳糖1～5g/L，继续发酵至60～80h，分离 发酵液得到2'-岩藻糖基乳糖。 进一步地，所述的种子培养基包括胰蛋白胨8～12g/L、酵母粉4～6g/L、NaCl8～ 12g/L。 进一步地，所述的发酵培养基包括甘油3～5g/L、胰蛋白胨10～15g/L、酵母粉20～ 4 CN 111575220 A 说　明　书 3/6 页 30g/L、磷酸氢二钾12～13g/L、磷酸二氢钾2～2.5g/L。 本发明的有益效果： 通过在大肠杆菌MG1655的鞭毛驱动蛋白基因fliR位点整合外源α-1 ,2-岩藻糖基 转移酶的基因，进一步将岩藻糖激酶的基因敲入至大肠杆菌MG1655基因组L-墨角藻糖激酶 基因fuck位点，并敲除大肠杆菌MG1655上乳糖操纵子中的转录阻遏物基因lacI，获得了可 高效合成2'-FL的无质粒工程菌株，其胞内胞外总量达到806.2mg/L。 附图说明 图1为2'-FL的重组大肠杆菌合成代谢途径图； 图2为本发明通过融合PCR得到的用于基因敲入和基因敲除片段的琼脂糖凝胶电 泳图； 图3为本发明实施例1通过LC-MS定性检测2'-FL的结果图； 图4为本发明实施例4通过HPLC检测2'-FL和底物乳糖的结果图。