技术摘要：
本发明提供一种用于在芽孢杆菌属细菌的菌体内高生产Cry蛋白质的方法。一种Cry蛋白质或含有该Cry蛋白质的培养产物的制造方法，包括：用将编码Cry蛋白质的基因与包含σA依赖性启动子或σH依赖性启动子的控制区域能够工作地连接并嵌入而成的表达质粒来转化芽孢杆菌属细菌 全部
背景技术：
一般而言，大多使用大肠杆菌，在其菌体内使蛋白质大量表达则作为称为包涵体 (inclusion body、封入体)的不溶且非活化的凝集体(改性蛋白质)被回收，为了使蛋白质 恢复生物活性，需要凝集体的可溶化和活性化(重折叠)的操作(非专利文献1)。即使这样也 得不到活性型的蛋白质时，进行表达量的调节使得不形成包涵体(非专利文献2、3)。此外， 在使异种蛋白质在菌体内生产时，由于异种蛋白质对宿主的影响等，也需要调整启动子的 表达、或质粒拷贝数(非专利文献2、3)。 另一方面，在菌体外蛋白质的表达中，考虑包涵体的形成或宿主内的该蛋白质浓 度的影响的必要性少，一直以来进行了组合高表达启动子和高拷贝数质粒的高表达化或解 除启动子的抑制的研究(专利文献1)。另外，作为适于这样的菌体外蛋白质的生产的宿主， 也报道了芽孢杆菌属细菌、特别是枯草杆菌是优异的(非专利文献4、5)。另外，枯草杆菌特 别是从作为安全性高的微生物被认识这一点上来说，作为宿主也是有利的。 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)是生产各种杀虫性结晶蛋白质 (crystal protein、以下也称为“Cry蛋白质”)，作为生物农药使用的微生物(非专利文献 6)。一般而言，编码苏云金芽孢杆菌所具有的Cry蛋白质基因(cry基因)的质粒是进行θ型复 制的低拷贝数的巨大质粒，相对于此，如编码枯草杆菌中发挥复制功能的序列编号9所示的 复制蛋白质(RepB)的质粒这样进行滚环型的复制的质粒一般为高拷贝数，与上述的进行θ 型复制的低拷贝数质粒不同(非专利文献7)。启示了使用这样的苏云金芽孢杆菌从其质粒 上的Cry蛋白质基因(cry基因)在菌体内生产该Cry蛋白质时，cry基因的拷贝数达到饱和， 生产量也不会随着拷贝数的增加而增加(非专利文献6)。另外，也观察到向高拷贝数质粒克 隆cry基因则生理的平衡崩坏，阻碍孢子形成(非专利文献6)。另外，启示了Cry蛋白质的结 晶构造的形成、可溶性与2级构造、附加的构成成分等的各种因子有关(非专利文献6)，认为 不能说能够通过单纯地增加cry基因表达来使该蛋白质高生产。例如，报道了在使来自苏云 金芽孢杆菌的Cry5B蛋白质在枯草杆菌PY79中表达时，苏云金芽孢杆菌的该蛋白质的生产 率为75mg/L，相对于此，在枯草杆菌PY79中的生产率只不过为10mg/L(非专利文献8、专利文 献2)。另外，也报道了在乳酸链球菌中，使用高拷贝数质粒在高表达启动子的控制下表达 Cry5B蛋白质基因时，苏云金芽孢杆菌的该蛋白质的生产率仅能检测出免疫印迹水平(非专 利文献9)。 这样，研究了用于一般地提高菌体外蛋白质的表达的方法，但不能说能够应用于 菌体内蛋白质的生产，特别是仍没有发现用于使Cry蛋白质高表达的高效的方法。 〔专利文献1〕国际专利公开第2011/049227号 〔专利文献2〕国际专利公开第2016/007355号 〔专利文献3〕国际专利公开第2017/123946号 5 CN 111601892 A 说 明 书 2/24 页 〔非专利文献1〕Singh A,Upadhyay V,Upadhyay AK,Singh SM,Panda AK(2015) Protein recovery from inclusion bodies of Escherichia coli using mild solubilization process.Microb Cell Fact.；25:14-41. 〔非专利文献2〕东端启贵(2013)将大肠杆菌作为宿主的异种蛋白质高表达的ABC (大腸菌を宿主とした異种タンパク質高発現的イロハ) .生物工学,91,96-100 〔非专利文献3〕CHUMANN ,Wolfgang and FERREIRA ,Luis Carlos S .(2004) Production of recombinant proteins in Escherichia coli .Genet .Mol .Biol . [online].,27(3) ,442-453. 〔非专利文献4〕Gomes AR,Byregowda SM,Veeregowda BM,Balamurugan V(2016) .An overview of heterologous expression host systems for the production of recombinant proteins.Adv.Anim.Vet.Sci.4(7):346-356. 〔非专利文献5〕Ferrer-Miralles and Villaverde(2013) .Bacterial cell factories for recombinant proteinproduction；expanding the catalogue.Microbial Cell Factories,12:113 〔非专利文献6〕HERVE′A.et al.How Does Bacillus thuringiensis Produce SO Much Insecticidal Crystal Protein？,J.of Bacteriology 1995,177(21) ,6027-6032 〔非专利文献7〕Deng C,Peng Q,Song F,Lereclus D(2014)Regulation of cry gene expression in Bacillus thuringiensis.Toxins.6:2194-2209 〔非专利文献8〕Yan Hu et al .Bacillus subtilis Strain Engineered for Treatment of Soil-Transmitted Helminth Diseases ,Applied and Environmental Microbiology 2013,79(18):5527-5532 〔非专利文献9〕Durmaz E .et al .Intracellular and Extracellular Expression of Bacillus thuringiensis Crystal Protein Cry5B in Lactococcus lactis for Use as an Anthelminthic ,Applied and Environmental Microbiology 2016,82(4):1286-1294
技术实现要素：
本发明提供以下的1)～2)。 1)一种Cry蛋白质或含有该Cry蛋白质的培养产物的制造方法，其中，所述方法包 括：用将编码Cry蛋白质的基因与包含σA依赖性启动子或σH依赖性启动子的控制区域能够 工作地连接并嵌入而成的表达质粒来转化芽孢杆菌属细菌，培养该转化细胞，其中，上述表 达质粒是包含编码由序列编号9所示的氨基酸序列构成的复制蛋白质、或在氨基酸序列上 与其具有80％以上的同一性并且参与复制起始的蛋白质的多核苷酸的质粒。 2)一种用于在芽孢杆菌属细菌内表达Cry蛋白质的表达质粒，其中，所述表达质粒 包含：编码由序列编号9所示的氨基酸序列构成的复制蛋白质、或在氨基酸序列上与其具有 80％以上的同一性并且参与复制起始的蛋白质的多核苷酸，编码Cry蛋白质的基因与包含σ A依赖性启动子或σH依赖性启动子的控制区域能够工作地连接而成。 6 CN 111601892 A 说 明 书 3/24 页 附图说明 [图1-A]Cry5B表达质粒(pPsScry5B和pPsScry5Bt)的构建。箭头表示引物的位置 和方向，在箭头的上或下标记引物的名称。 [图1-B]Cry5B表达质粒(pPscry5B和pPscry5Bt)的构建。箭头表示引物的位置和 方向，在箭头的上或下标记引物的名称。 [图1-C]Cry5B表达质粒(pPvcry5B和pPvcry5Bt)的构建。箭头表示引物的位置和 方向，在箭头的上或下标记引物的名称。 [图1-D]Cry5B表达质粒(pPvScry5B和pPvScry5Bt)的构建。箭头表示引物的位置 和方向，在箭头的上或下标记引物的名称。 [图2]利用具有分泌信号的质粒的Cry5B和Cry5Bt的表达。 [图3]利用不具有分泌信号的质粒的Cry5B表达。 [图4-A]使用了枯草杆菌突变株的Cry5B表达(1)。 [图4-B]使用了枯草杆菌突变株的Cry5B表达(2)。 [图5]L1 growth分析中线虫的照片。 [图6]线虫的面积。以对照的面积为100％时的各Cry5B蛋白浓度的值。 [图7]利用不具有分泌信号的质粒的Cry5Bt表达。 [图8]灭蚊蛋白质表达质粒(pHY-Pscry4Aa、pHY-Pscry4Ba、pHY-Pscry11Aa、pHY- Pvcry4Aa、pHY-Pvcry4Ba、pHY-Pvcry11Aa)。 [图9]灭蚊蛋白质的表达。
本发明提供一种用于在芽孢杆菌属细菌的菌体内高生产Cry蛋白质的方法。一种Cry蛋白质或含有该Cry蛋白质的培养产物的制造方法，包括：用将编码Cry蛋白质的基因与包含σA依赖性启动子或σH依赖性启动子的控制区域能够工作地连接并嵌入而成的表达质粒来转化芽孢杆菌属细菌 全部
背景技术：
一般而言，大多使用大肠杆菌，在其菌体内使蛋白质大量表达则作为称为包涵体 (inclusion body、封入体)的不溶且非活化的凝集体(改性蛋白质)被回收，为了使蛋白质 恢复生物活性，需要凝集体的可溶化和活性化(重折叠)的操作(非专利文献1)。即使这样也 得不到活性型的蛋白质时，进行表达量的调节使得不形成包涵体(非专利文献2、3)。此外， 在使异种蛋白质在菌体内生产时，由于异种蛋白质对宿主的影响等，也需要调整启动子的 表达、或质粒拷贝数(非专利文献2、3)。 另一方面，在菌体外蛋白质的表达中，考虑包涵体的形成或宿主内的该蛋白质浓 度的影响的必要性少，一直以来进行了组合高表达启动子和高拷贝数质粒的高表达化或解 除启动子的抑制的研究(专利文献1)。另外，作为适于这样的菌体外蛋白质的生产的宿主， 也报道了芽孢杆菌属细菌、特别是枯草杆菌是优异的(非专利文献4、5)。另外，枯草杆菌特 别是从作为安全性高的微生物被认识这一点上来说，作为宿主也是有利的。 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)是生产各种杀虫性结晶蛋白质 (crystal protein、以下也称为“Cry蛋白质”)，作为生物农药使用的微生物(非专利文献 6)。一般而言，编码苏云金芽孢杆菌所具有的Cry蛋白质基因(cry基因)的质粒是进行θ型复 制的低拷贝数的巨大质粒，相对于此，如编码枯草杆菌中发挥复制功能的序列编号9所示的 复制蛋白质(RepB)的质粒这样进行滚环型的复制的质粒一般为高拷贝数，与上述的进行θ 型复制的低拷贝数质粒不同(非专利文献7)。启示了使用这样的苏云金芽孢杆菌从其质粒 上的Cry蛋白质基因(cry基因)在菌体内生产该Cry蛋白质时，cry基因的拷贝数达到饱和， 生产量也不会随着拷贝数的增加而增加(非专利文献6)。另外，也观察到向高拷贝数质粒克 隆cry基因则生理的平衡崩坏，阻碍孢子形成(非专利文献6)。另外，启示了Cry蛋白质的结 晶构造的形成、可溶性与2级构造、附加的构成成分等的各种因子有关(非专利文献6)，认为 不能说能够通过单纯地增加cry基因表达来使该蛋白质高生产。例如，报道了在使来自苏云 金芽孢杆菌的Cry5B蛋白质在枯草杆菌PY79中表达时，苏云金芽孢杆菌的该蛋白质的生产 率为75mg/L，相对于此，在枯草杆菌PY79中的生产率只不过为10mg/L(非专利文献8、专利文 献2)。另外，也报道了在乳酸链球菌中，使用高拷贝数质粒在高表达启动子的控制下表达 Cry5B蛋白质基因时，苏云金芽孢杆菌的该蛋白质的生产率仅能检测出免疫印迹水平(非专 利文献9)。 这样，研究了用于一般地提高菌体外蛋白质的表达的方法，但不能说能够应用于 菌体内蛋白质的生产，特别是仍没有发现用于使Cry蛋白质高表达的高效的方法。 〔专利文献1〕国际专利公开第2011/049227号 〔专利文献2〕国际专利公开第2016/007355号 〔专利文献3〕国际专利公开第2017/123946号 5 CN 111601892 A 说 明 书 2/24 页 〔非专利文献1〕Singh A,Upadhyay V,Upadhyay AK,Singh SM,Panda AK(2015) Protein recovery from inclusion bodies of Escherichia coli using mild solubilization process.Microb Cell Fact.；25:14-41. 〔非专利文献2〕东端启贵(2013)将大肠杆菌作为宿主的异种蛋白质高表达的ABC (大腸菌を宿主とした異种タンパク質高発現的イロハ) .生物工学,91,96-100 〔非专利文献3〕CHUMANN ,Wolfgang and FERREIRA ,Luis Carlos S .(2004) Production of recombinant proteins in Escherichia coli .Genet .Mol .Biol . [online].,27(3) ,442-453. 〔非专利文献4〕Gomes AR,Byregowda SM,Veeregowda BM,Balamurugan V(2016) .An overview of heterologous expression host systems for the production of recombinant proteins.Adv.Anim.Vet.Sci.4(7):346-356. 〔非专利文献5〕Ferrer-Miralles and Villaverde(2013) .Bacterial cell factories for recombinant proteinproduction；expanding the catalogue.Microbial Cell Factories,12:113 〔非专利文献6〕HERVE′A.et al.How Does Bacillus thuringiensis Produce SO Much Insecticidal Crystal Protein？,J.of Bacteriology 1995,177(21) ,6027-6032 〔非专利文献7〕Deng C,Peng Q,Song F,Lereclus D(2014)Regulation of cry gene expression in Bacillus thuringiensis.Toxins.6:2194-2209 〔非专利文献8〕Yan Hu et al .Bacillus subtilis Strain Engineered for Treatment of Soil-Transmitted Helminth Diseases ,Applied and Environmental Microbiology 2013,79(18):5527-5532 〔非专利文献9〕Durmaz E .et al .Intracellular and Extracellular Expression of Bacillus thuringiensis Crystal Protein Cry5B in Lactococcus lactis for Use as an Anthelminthic ,Applied and Environmental Microbiology 2016,82(4):1286-1294
技术实现要素：
本发明提供以下的1)～2)。 1)一种Cry蛋白质或含有该Cry蛋白质的培养产物的制造方法，其中，所述方法包 括：用将编码Cry蛋白质的基因与包含σA依赖性启动子或σH依赖性启动子的控制区域能够 工作地连接并嵌入而成的表达质粒来转化芽孢杆菌属细菌，培养该转化细胞，其中，上述表 达质粒是包含编码由序列编号9所示的氨基酸序列构成的复制蛋白质、或在氨基酸序列上 与其具有80％以上的同一性并且参与复制起始的蛋白质的多核苷酸的质粒。 2)一种用于在芽孢杆菌属细菌内表达Cry蛋白质的表达质粒，其中，所述表达质粒 包含：编码由序列编号9所示的氨基酸序列构成的复制蛋白质、或在氨基酸序列上与其具有 80％以上的同一性并且参与复制起始的蛋白质的多核苷酸，编码Cry蛋白质的基因与包含σ A依赖性启动子或σH依赖性启动子的控制区域能够工作地连接而成。 6 CN 111601892 A 说 明 书 3/24 页 附图说明 [图1-A]Cry5B表达质粒(pPsScry5B和pPsScry5Bt)的构建。箭头表示引物的位置 和方向，在箭头的上或下标记引物的名称。 [图1-B]Cry5B表达质粒(pPscry5B和pPscry5Bt)的构建。箭头表示引物的位置和 方向，在箭头的上或下标记引物的名称。 [图1-C]Cry5B表达质粒(pPvcry5B和pPvcry5Bt)的构建。箭头表示引物的位置和 方向，在箭头的上或下标记引物的名称。 [图1-D]Cry5B表达质粒(pPvScry5B和pPvScry5Bt)的构建。箭头表示引物的位置 和方向，在箭头的上或下标记引物的名称。 [图2]利用具有分泌信号的质粒的Cry5B和Cry5Bt的表达。 [图3]利用不具有分泌信号的质粒的Cry5B表达。 [图4-A]使用了枯草杆菌突变株的Cry5B表达(1)。 [图4-B]使用了枯草杆菌突变株的Cry5B表达(2)。 [图5]L1 growth分析中线虫的照片。 [图6]线虫的面积。以对照的面积为100％时的各Cry5B蛋白浓度的值。 [图7]利用不具有分泌信号的质粒的Cry5Bt表达。 [图8]灭蚊蛋白质表达质粒(pHY-Pscry4Aa、pHY-Pscry4Ba、pHY-Pscry11Aa、pHY- Pvcry4Aa、pHY-Pvcry4Ba、pHY-Pvcry11Aa)。 [图9]灭蚊蛋白质的表达。
