技术摘要：
本发明公开了一种重组的非洲猪瘟病毒p72亚单位可溶性融合蛋白及其制备方法和应用，所述非洲猪瘟病毒p72亚单位可溶性融合蛋白包括OPTI‑p72蛋白和一种伴侣蛋白，其中所述OPTI‑p72蛋白的核苷酸序列为经优化后的序列OPTI‑p72如SEQ ID NO.1所示。本发明能够在大肠杆菌中 全部
背景技术：
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的猪的急性、热性、高度接触性传染病。猪是ASFV自然感染的唯一哺乳动 物宿主，包括家猪和野猪，尤其是家猪，易感性极高。猪感染非洲猪瘟病毒后临床上以皮肤 充血，内脏器官出血，高热为特征，发病率及死亡率高达100％。世界动物卫生组织将其列为 A类疫病，我国也将其列为一类动物传染病。 2018年8月份以来，非洲猪瘟在我国多个省份爆发，给我国养猪业带来了严重的经 济损失。尽管已经有许多非洲猪瘟的研究性报告，但目前世界上尚未有有效预防非洲猪瘟 的疫苗和治疗该病的药物发现，迫切需要新型疫苗的研发和生产来预防非洲猪瘟。 ASFV病毒是具有囊膜的虫媒DNA病毒。病毒颗粒呈二十面体对称结构，平均直径 200nm，表面有含糖脂类的囊膜覆盖。其病毒基因组为双股线性DNA，大小为170-190kb，整个 基因组大约有150个ORF，编码150-200个蛋白质。P72蛋白由ASFV病毒B646L基因编码的，分 子量大小约32kD的蛋白。是非洲猪瘟病毒粒子形成二十面体衣壳的的主要结构蛋白，约占 整个病毒粒子的32％。研究发现，p72蛋白相对比较保守，有稳定的抗原性。且与病毒进入宿 主细胞的过程有关，针对p72的抗体能够抑制病毒与巨噬细胞的结合。因此，p72是一个很好 的保护性抗原。目前，已经有P72蛋白能成功的表达在原核系统，但表达产量低，且以包涵体 形式存在(具体参见公开号为CN103805615的发明专利)，无法满足基因工程亚单位疫苗的 开发。而利用本发明提供的方法可大量可溶性表达P72蛋白。在当前没有可能大规模制备灭 活疫苗或弱毒疫苗的情况下，确定一种制备该病毒的免疫原性蛋白的方法，以便研究一种 能够预防该疾病的亚单位疫苗或具有能够诊断该疾病的试剂具有重大的意义。
技术实现要素：
在现有技术的基础上，本发明为了克服现有技术中存在的诸多缺陷(如表达产量 低，包涵体表达，纯化困难成本相对较高等)，提供了一种制作成本低廉可在大肠杆菌中直 接可溶性表达p72亚单位可溶性融合蛋白及其制备方法。 根据本发明的一个方面，本发明提供了一种可在大肠杆菌中表达p72蛋白的优化 后的OPTI-p72的核苷酸序列。为了能够在大肠杆菌中高效表达P72蛋白，本发明根据 GenBank:FR682468.1上已经存在公开的序列(密码子优化前的编码P72蛋白的核苷酸序列 如SEQ ID NO.2所示)，我们对p72基因进行分析，首先对p72基因编码的密码子的在原核表 达中的密码子偏好性进行了优化，其次对p72基因的GC含量和mRNA在大肠杆菌的稳定性进 行优化。所述最终优化后OPTI-p72的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。因此，所述非洲猪瘟 3 CN 111607001 A 说 明 书 2/14 页 病毒p72亚单位可溶性融合蛋白包括OPTI-p72蛋白和一种伴侣蛋白，其中所述OPTI-p72蛋 白的核苷酸序列为p72蛋白经优化后的序列OPTI-p72如SEQ ID NO.1所示。 在本发明的优选技术方案中，所述伴侣蛋白为TF蛋白。 在本发明的优选技术方案中，优化后的OPTI-p72直接在原核表达系统中也不能可 溶性表达p72，为了能够得到可溶性表达P72蛋白，本发明在OPTI-p72核苷酸序列3’端或5’ 端加入伴侣蛋白的基因编码序列，其中伴侣蛋白优选为TF，得到OPTI-TF-P72。优选地，5’端 加入TF基因编码OPTI-TF-p72的基因编码序列如SEQ ID NO.3所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。 为了方便使用亲和层析的方法纯化融合蛋白，根据本发明的技术方案，优先地，所 述非洲猪瘟病毒p30亚单位可溶性融合蛋白在如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的氨基末 端或羧基末端连接有poly-His、FLAG、c-myc、HA和poly-Arg中的一种标签。 根据本发明的另一个方面，为了能够在大肠杆菌中高效可溶性表达P72蛋白，本发 明将OPTI-TF-p72-6His核苷酸序列导入原核表达载体。所述表达载体可以是任何一种原核 表达载体，所述的表达载体具体但不限于pET30a表达载体、pBAD载体、pcold载体、pQE载体、 pKK载体等。优先地，所述的载体为pET30a载体。 根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种重组的非洲猪瘟病毒p72亚单位可 溶性融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：1)将含有OPTI-p72蛋白和一种伴 侣蛋白的基因克隆到原核表达载体中，得到含有非洲猪瘟病毒OPTI-p72蛋白和一种伴侣蛋 白编码基因的重组质粒；其中，所述OPTI-p72蛋白的核苷酸序列为p72蛋白经优化后的序列 OPTI-p72如SEQ ID NO.1所示；2)再将步骤1)所述重组质粒转化至大肠杆菌菌株的细胞中， 得到重组表达的菌株；3)通过培养、筛选、步骤2)中所述重组表达的菌株，得到高度表达的 菌株；4)发酵培养步骤3)中所述高度表达的菌株，纯化后得到重组的非洲猪瘟病毒p72亚单 位可溶性融合蛋白。 在本发明的优选技术方案中，步骤1)中，所述伴侣蛋白为TF蛋白。 在本发明的优选技术方案中，含有非洲猪瘟病毒OPTI-p72蛋白和TF蛋白的核苷酸 序列OPTI-TF-p72是OPTI-p72蛋白的5’端插入TF蛋白的核苷酸序列，所述OPTI-TF-p72蛋白 的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。 在本发明的优选技术方案中，含有非洲猪瘟病毒OPTI-p72蛋白和TF蛋白的氨基酸 序列如SEQ ID NO.4所示。 在本发明的优选技术方案中，含有非洲猪瘟病毒OPTI-p72蛋白和TF蛋白在如SEQ ID NO .4所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接有poly-His、FLAG、c-myc、HA和 poly-Arg中的一种标签。 在本发明的优选技术方案中，为了能够在大肠杆菌中高效可溶性表达P72蛋白，本 发明将OPTI-TF-p72-6His核苷酸序列导入原核表达载体。所述表达载体可以是任何一种原 核表达载体，所述的表达载体具体但不限于pET30a表达载体、pBAD载体、pcold载体、pQE载 体、pKK载体等。更优选地，所述载体为pET30a载体。 在本发明的优选技术方案中，步骤2)中，所述大肠杆菌菌株选自BL21(DE3)、BL21 star(DE3)、arcticexpress中的一种菌株。更优选地，步骤2)中所述大肠杆菌菌株使用BL21 (DE3)。 4 CN 111607001 A 说 明 书 3/14 页 在本发明的技术方案中，优先地，所述的步骤3)中使用IPTG的浓度为0.2mmol/L。 在本发明的技术方案中，优先地，所述的步骤4)中使用裂解液：20mM Tris(pH 8.7)，500mM NaCl，0.2％TritonX-114，5％甘油，1mMβ-ME。 根据本发明的再一个方面，本发明提供了一种所述非洲猪瘟病毒p72亚单位可溶 性融合蛋白在制备诊断、预防和治疗非洲猪瘟的疫苗中的应用。 与现有技术相比，本发明公开的表达序列、表达载体以及相应的纯化制备方法克 服了现有技术中的缺陷，解决了大肠杆菌中不能直接大量可溶性表达P72蛋白且产量低的 问题。本发明能够在大肠杆菌中直接可溶性表达P72，克服了现有技术中的诸多问题，且制 备方法简单、成本低。 附图说明 图1 P72蛋白编码的核苷酸优化前后序列比对结果。 图2 pET30-OPTI-TF-p72-6His构建示意图。 图3 pET30-OPTI-TF-p72-6His酶切鉴定结果。1-4：pET30a-OPTI-TF-P72质粒SacI 和SalI双酶切，条带大小分别为6673bp，1979bp，质粒酶切正确。M：DL10000Marker 图4 SDS-PAGE检测TF-P72蛋白诱导表达的结果。1：诱导前上清；2：诱导前沉淀；3： 诱导后上清；4：诱导后沉淀。M：蛋白Marker 26619。 图5 SDS-PAGE检测TF-P72蛋白纯化后的结果。1：蛋白Marker 26619，2：纯化后的 TF-P72蛋白纯度85％。 图6 SDS-PAGE检测第十次取样4℃和-20℃保存的TF-P72蛋白。1是蛋白Marker 26619，2，3:第十次样品4℃和-20℃蛋白样品，上样量3ug。
本发明公开了一种重组的非洲猪瘟病毒p72亚单位可溶性融合蛋白及其制备方法和应用，所述非洲猪瘟病毒p72亚单位可溶性融合蛋白包括OPTI‑p72蛋白和一种伴侣蛋白，其中所述OPTI‑p72蛋白的核苷酸序列为经优化后的序列OPTI‑p72如SEQ ID NO.1所示。本发明能够在大肠杆菌中 全部
背景技术：
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的猪的急性、热性、高度接触性传染病。猪是ASFV自然感染的唯一哺乳动 物宿主，包括家猪和野猪，尤其是家猪，易感性极高。猪感染非洲猪瘟病毒后临床上以皮肤 充血，内脏器官出血，高热为特征，发病率及死亡率高达100％。世界动物卫生组织将其列为 A类疫病，我国也将其列为一类动物传染病。 2018年8月份以来，非洲猪瘟在我国多个省份爆发，给我国养猪业带来了严重的经 济损失。尽管已经有许多非洲猪瘟的研究性报告，但目前世界上尚未有有效预防非洲猪瘟 的疫苗和治疗该病的药物发现，迫切需要新型疫苗的研发和生产来预防非洲猪瘟。 ASFV病毒是具有囊膜的虫媒DNA病毒。病毒颗粒呈二十面体对称结构，平均直径 200nm，表面有含糖脂类的囊膜覆盖。其病毒基因组为双股线性DNA，大小为170-190kb，整个 基因组大约有150个ORF，编码150-200个蛋白质。P72蛋白由ASFV病毒B646L基因编码的，分 子量大小约32kD的蛋白。是非洲猪瘟病毒粒子形成二十面体衣壳的的主要结构蛋白，约占 整个病毒粒子的32％。研究发现，p72蛋白相对比较保守，有稳定的抗原性。且与病毒进入宿 主细胞的过程有关，针对p72的抗体能够抑制病毒与巨噬细胞的结合。因此，p72是一个很好 的保护性抗原。目前，已经有P72蛋白能成功的表达在原核系统，但表达产量低，且以包涵体 形式存在(具体参见公开号为CN103805615的发明专利)，无法满足基因工程亚单位疫苗的 开发。而利用本发明提供的方法可大量可溶性表达P72蛋白。在当前没有可能大规模制备灭 活疫苗或弱毒疫苗的情况下，确定一种制备该病毒的免疫原性蛋白的方法，以便研究一种 能够预防该疾病的亚单位疫苗或具有能够诊断该疾病的试剂具有重大的意义。
技术实现要素：
在现有技术的基础上，本发明为了克服现有技术中存在的诸多缺陷(如表达产量 低，包涵体表达，纯化困难成本相对较高等)，提供了一种制作成本低廉可在大肠杆菌中直 接可溶性表达p72亚单位可溶性融合蛋白及其制备方法。 根据本发明的一个方面，本发明提供了一种可在大肠杆菌中表达p72蛋白的优化 后的OPTI-p72的核苷酸序列。为了能够在大肠杆菌中高效表达P72蛋白，本发明根据 GenBank:FR682468.1上已经存在公开的序列(密码子优化前的编码P72蛋白的核苷酸序列 如SEQ ID NO.2所示)，我们对p72基因进行分析，首先对p72基因编码的密码子的在原核表 达中的密码子偏好性进行了优化，其次对p72基因的GC含量和mRNA在大肠杆菌的稳定性进 行优化。所述最终优化后OPTI-p72的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。因此，所述非洲猪瘟 3 CN 111607001 A 说 明 书 2/14 页 病毒p72亚单位可溶性融合蛋白包括OPTI-p72蛋白和一种伴侣蛋白，其中所述OPTI-p72蛋 白的核苷酸序列为p72蛋白经优化后的序列OPTI-p72如SEQ ID NO.1所示。 在本发明的优选技术方案中，所述伴侣蛋白为TF蛋白。 在本发明的优选技术方案中，优化后的OPTI-p72直接在原核表达系统中也不能可 溶性表达p72，为了能够得到可溶性表达P72蛋白，本发明在OPTI-p72核苷酸序列3’端或5’ 端加入伴侣蛋白的基因编码序列，其中伴侣蛋白优选为TF，得到OPTI-TF-P72。优选地，5’端 加入TF基因编码OPTI-TF-p72的基因编码序列如SEQ ID NO.3所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。 为了方便使用亲和层析的方法纯化融合蛋白，根据本发明的技术方案，优先地，所 述非洲猪瘟病毒p30亚单位可溶性融合蛋白在如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的氨基末 端或羧基末端连接有poly-His、FLAG、c-myc、HA和poly-Arg中的一种标签。 根据本发明的另一个方面，为了能够在大肠杆菌中高效可溶性表达P72蛋白，本发 明将OPTI-TF-p72-6His核苷酸序列导入原核表达载体。所述表达载体可以是任何一种原核 表达载体，所述的表达载体具体但不限于pET30a表达载体、pBAD载体、pcold载体、pQE载体、 pKK载体等。优先地，所述的载体为pET30a载体。 根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种重组的非洲猪瘟病毒p72亚单位可 溶性融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：1)将含有OPTI-p72蛋白和一种伴 侣蛋白的基因克隆到原核表达载体中，得到含有非洲猪瘟病毒OPTI-p72蛋白和一种伴侣蛋 白编码基因的重组质粒；其中，所述OPTI-p72蛋白的核苷酸序列为p72蛋白经优化后的序列 OPTI-p72如SEQ ID NO.1所示；2)再将步骤1)所述重组质粒转化至大肠杆菌菌株的细胞中， 得到重组表达的菌株；3)通过培养、筛选、步骤2)中所述重组表达的菌株，得到高度表达的 菌株；4)发酵培养步骤3)中所述高度表达的菌株，纯化后得到重组的非洲猪瘟病毒p72亚单 位可溶性融合蛋白。 在本发明的优选技术方案中，步骤1)中，所述伴侣蛋白为TF蛋白。 在本发明的优选技术方案中，含有非洲猪瘟病毒OPTI-p72蛋白和TF蛋白的核苷酸 序列OPTI-TF-p72是OPTI-p72蛋白的5’端插入TF蛋白的核苷酸序列，所述OPTI-TF-p72蛋白 的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。 在本发明的优选技术方案中，含有非洲猪瘟病毒OPTI-p72蛋白和TF蛋白的氨基酸 序列如SEQ ID NO.4所示。 在本发明的优选技术方案中，含有非洲猪瘟病毒OPTI-p72蛋白和TF蛋白在如SEQ ID NO .4所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接有poly-His、FLAG、c-myc、HA和 poly-Arg中的一种标签。 在本发明的优选技术方案中，为了能够在大肠杆菌中高效可溶性表达P72蛋白，本 发明将OPTI-TF-p72-6His核苷酸序列导入原核表达载体。所述表达载体可以是任何一种原 核表达载体，所述的表达载体具体但不限于pET30a表达载体、pBAD载体、pcold载体、pQE载 体、pKK载体等。更优选地，所述载体为pET30a载体。 在本发明的优选技术方案中，步骤2)中，所述大肠杆菌菌株选自BL21(DE3)、BL21 star(DE3)、arcticexpress中的一种菌株。更优选地，步骤2)中所述大肠杆菌菌株使用BL21 (DE3)。 4 CN 111607001 A 说 明 书 3/14 页 在本发明的技术方案中，优先地，所述的步骤3)中使用IPTG的浓度为0.2mmol/L。 在本发明的技术方案中，优先地，所述的步骤4)中使用裂解液：20mM Tris(pH 8.7)，500mM NaCl，0.2％TritonX-114，5％甘油，1mMβ-ME。 根据本发明的再一个方面，本发明提供了一种所述非洲猪瘟病毒p72亚单位可溶 性融合蛋白在制备诊断、预防和治疗非洲猪瘟的疫苗中的应用。 与现有技术相比，本发明公开的表达序列、表达载体以及相应的纯化制备方法克 服了现有技术中的缺陷，解决了大肠杆菌中不能直接大量可溶性表达P72蛋白且产量低的 问题。本发明能够在大肠杆菌中直接可溶性表达P72，克服了现有技术中的诸多问题，且制 备方法简单、成本低。 附图说明 图1 P72蛋白编码的核苷酸优化前后序列比对结果。 图2 pET30-OPTI-TF-p72-6His构建示意图。 图3 pET30-OPTI-TF-p72-6His酶切鉴定结果。1-4：pET30a-OPTI-TF-P72质粒SacI 和SalI双酶切，条带大小分别为6673bp，1979bp，质粒酶切正确。M：DL10000Marker 图4 SDS-PAGE检测TF-P72蛋白诱导表达的结果。1：诱导前上清；2：诱导前沉淀；3： 诱导后上清；4：诱导后沉淀。M：蛋白Marker 26619。 图5 SDS-PAGE检测TF-P72蛋白纯化后的结果。1：蛋白Marker 26619，2：纯化后的 TF-P72蛋白纯度85％。 图6 SDS-PAGE检测第十次取样4℃和-20℃保存的TF-P72蛋白。1是蛋白Marker 26619，2，3:第十次样品4℃和-20℃蛋白样品，上样量3ug。
