技术摘要：
本发明提出了一种以木聚糖酶和酸性蛋白酶为主的酶制剂及其菌株和应用，其中培养得到以木聚糖酶、蛋白酶、果胶酶、葡聚糖酶、淀粉酶、甘露聚糖酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、糖化酶为主，阿魏酸酯酶、植酸酶、羧肽酶、磷酸酶、过氧化氢酶多种伴生酶为辅的富含天然复杂酶  全部
背景技术：
传统畜牧养殖业都是以追求高饲料报酬、高生长速度，低成本提高经济效益，以牺 牲环境和消耗资源作为代价而发展。我国的畜牧业在一定历史阶段内要在农业经济中占很 大比例。作为畜牧业大国和销售大国，中国的动物饲养产业保持稳定的高水平。 2018年，我国畜牧业总产值主要产品产量保持平稳。根据国家统计局数据显示，牛 肉产量644万吨，增长1.5％；羊肉产量475万吨，增长0.8％；禽肉产量1994万吨，增长0.6％。 禽蛋产量3128万吨，增长1.0％。牛奶产量3075万吨，增长1.2％。同期，据农业农村部定点监 测，国内1—10月产蛋鸡平均存栏同比增加2.1％，鸡蛋价格和淘汰鸡价格均维持相对高位， 全年只鸡盈利再回较大利润区间，同比大幅上升；国际上，美国、日本等国家的蛋鸡存栏量 均较上年增加2.2％以上。以上数据显示，畜牧业的行情看好，畜产品的需求量居高不下，在 畜牧业的饲料养殖、禽畜医药等方向有巨大的增长空间。 传统养殖的粗放模式，以及秸秆等低营养饲料的选用，污染环境，产能低下。随着 科技的发展进步，规模化养殖和处理型饲料成为主流。粉碎、酸碱或氨水浸泡等处理粗饲料 的方式可以部分提高禽畜对营养的吸收效率，但同时带来了污染环境、高耗能、禽畜体内残 留治病等严重问题。大众对食品安全的重视和监督逐年提高，“绿水青山就是金山银山”的 概念也日益深入人心，对畜产品的生产和品质提出了更高的要求。效益与挑战并存，发展高 效无公害养殖生产技术成了我国畜牧业发展的必然之路。生物发酵、酶水解为主的微生物 处理饲料的方法，以其不产生残留、无抗药性、对环境友好等特点，为无公害饲料的生产提 供了新途径新思路，是发展安全、高效、优质的绿色养殖业的有效技术。 酶制剂，作为饲料添加剂中重要的组成部分，主要通过微生物的发酵生产，是为了 提高动物对饲料的消化、利用或改善动物体内的代谢效能而加入饲料中的酶类物质。主要 功能包括但不限于：(1)饲料所含抗营养因子的消除，减少蛋白酶抑制因子、植物凝集素、水 溶性非淀粉多糖、植酸、单宁等多种抗营养因子对禽畜的影响；(2)禽畜肠道菌群的改善，提 高畜禽免疫机能，调节内分泌，促进生长，是饲用抗生素的有力替代品；(3)饲料消化及利用 率的明显提高，禽畜内源分解酶的不足得到有效补充；(4)养殖业对环境的污染程度减轻， 饲料中植酸酶的添加减少了单胃动物对磷酸盐吸收少而导致的排放。酶制剂水解底物的机 理为：专一作用于底物的某一类连接键，使底物分裂为更易吸收利用的片段或小分子。例 如，糖化酶主要作用于淀粉的非还原性末端，依次水解α-1 ,4糖苷键生成葡萄糖；蛋白酶是 作用于蛋白质或多肽，催化肽键水解的酶类；木聚糖水解酶系(xylanolytic  enzyme  systems)是一类降解木聚糖的酶系，可降解自然界中大量存在的木聚糖类半纤维素，包括 β-1,4-内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-D-葡糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酶 和酚酸酯酶。 3 CN 111607574 A 说　明　书 2/12 页 广泛的适用范围、有效的水解底物功能，为酶制剂在饲料上的应用打下基础。安全 可控的使用操作、部分替代抗生素的生物活性，更让酶制剂备受养殖业的青睐，针对生物产 酶的研究与产业也进一步增加。饲料添加剂用的酶制剂产品有20余种，纤维酶、果胶酶、蛋 白酶、糖化酶、淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶等单一酶制剂以及将几类 酶按比例混合的复配酶制剂，是目前最常见的市售酶制剂。酶制剂的研究和生产，已发展到 一定的规模，在实际应用中表现较好。 戚永跃等通过液体发酵及序列分析，筛选出一株高产木聚糖酶的拟盘多毛孢属菌 株，粗酶液的木聚糖酶酶活在液体发酵第3天达到峰值49.3U/mL，SDS—PAGE及酶谱分析表 明，该菌株至少能够分泌6种不同分子量的胞外木聚糖酶。李洪兵等人的专利中，公开了一 种酶系全、酶活力高的含中性蛋白酶的饲料复合酶。该中性蛋白酶通过液体发酵制得，发酵 液酶活可达5500-7000U/mL。含该中性蛋白酶的饲料复合酶则由浓缩麦芽酶、酸性蛋白酶、 中性蛋白酶、酸性木聚糖酶、中草药提取物、保护剂、激活剂按比例复配而成。杨育才等对酶 制剂产品溢多酶868B(其主要成分为：木聚糖酶≥6  000u/g、果胶酶≥400u/g、蛋白酶≥ 300u/g)进行了动物实验，发现对蛋鸡的产蛋性能有提高作用。文中推测，显著改善蛋鸡产 蛋性能的原因有二：1)饲料添加木聚糖酶降低肠道食糜粘度，蛋白酶增加蛋白质吸收；2)在 发酵过程中，微生物可能分泌一些维生素、蛋白质以及一些未知促生长因子。王海彦等的专 利中，公开了一种和酵母产品复合的功能性甘露聚糖酶制剂，以豆粕和全株酵母为底物，通 过固体发酵工艺制得，获得富含甘露聚糖酶、葡萄糖氧化酶的多酶谱体系。该酶制剂中，甘 露聚糖酶酶活≥5000U/g、葡萄糖氧化酶酶活≥80U/g、酵母多糖含量≥20％。对禽畜的实际 饲喂中，效果较好，对禽畜的繁殖、生长、免疫性能有一定的改善提高。 上述对酶制剂的研究和实际应用，均有较好表现。但也反应出部分未得到重视的 问题。1)发酵工艺的选取。酶制剂生产运用液体发酵居多，固体发酵偏少。与液体发酵相比， 固体发酵虽然存在发酵周期较长、天然原料成分复杂略不稳定的缺点，但微生物易生长、酶 活力高、酶系丰富、不需严格无菌条件、设备构造简单、投资少、能耗低、易操作、后处理简 便、污染少、基本无废水排放等优点更适合进行环保型多酶系复合酶制剂的生产；2)酶制剂 配伍方式单一。目前市场上，复合酶制剂多以按重量占比搭配为主。饲料原料复杂多样，化 学键链接交错复杂，空间结构稳定。盲目或简单得以降解单一底物的程度和降解酶系的种 类复配，实际应用中无法将这些复杂的化学键全部打开，酶制剂功效不能最大化；3)成品酶 活偏低：发酵或复配的复合酶制剂，因未经过分离纯化、冷冻干燥(高耗能高工艺要求)等浓 缩手段处理，其酶活普遍偏低；4)复合酶制剂中的酶系模糊，协同作用机理不明确：少部分 利用固体发酵工艺生产的复合酶制剂产品，只靠单纯检测部分酶种的酶活来推测成分，靠 实际的禽畜饲喂摸索效果。酶活产生、酶系组成、不同酶系协同作用等机理没有明确，造成 了“知其优，不知其所以优”的困惑局面，限制了酶制剂领域的深层次研究和养殖业的发展。
技术实现要素：
本发明提出一种以木聚糖酶和酸性蛋白酶为主的酶制剂及其菌株和应用，解决了 现有技术中复配酶活低、酶系模糊的问题。 本发明的技术方案是这样实现的： 一种以木聚糖酶和酸性蛋白酶为主的酶制剂的制备，其中： 4 CN 111607574 A 说　明　书 3/12 页 所用菌株为黑曲霉(Aspergillus  niger)BAK200308，CGMCC  No.19615；培养得到 以木聚糖酶、蛋白酶、果胶酶、葡聚糖酶、淀粉酶、甘露聚糖酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、糖 化酶为主，阿魏酸酯酶、植酸酶、羧肽酶、磷酸酶、过氧化氢酶多种伴生酶为辅的富含天然复 杂酶类的多酶系复合酶制剂。 在一些实施例中，所述酶制剂的制备包括：斜面培养步骤、种子制备步骤和固体培 养基接种培养步骤； 其中， (1)斜面培养步骤为： 将黑曲霉(Aspergillus  niger)BAK200308接种至改良察氏斜面培养基上，28℃～ 30℃培养5～7d，得到长满黑曲霉孢子的斜面； (2)种子制备步骤： 将上述步骤(1)中斜面上的孢子于无菌室中接种至摇瓶中的麸皮培养基上，28℃ ～32℃，培养6～7d，得到大量黑曲霉孢子； 所述麸皮培养基按下述重量比例配制(％)：麸皮50～60％，氯化铵0.5～1.5％，含 水量40～50％，pH自然； (3)固体培养基接种培养步骤 取上述步骤(2)中得到的孢子培养基按1％～15％的重量比接入固体发酵培养基 中，静置发酵培养，曲房相对湿度保持在85％～95％，料温控制在30℃～45℃，发酵周期3～ 5天； 所述固体发酵培养基按下述比例配制：麸皮30～40％，玉米芯30～40％，豆粕粉25 ～35％，轻质碳酸钙2～5％，初始水分55～65％，pH自然。 在一些实施例中，还包括发酵产物的烘干步骤和粉碎步骤；其中，烘干至含水量5 ～15％停止。 在一些实施例中，所述的固体发酵培养基的灭菌要求：121℃，50～70min。 本发明还提供了一种黑曲霉(Aspergillus  niger)，命名为黑曲霉BAK200308，其 保藏号为CGMCC  No.19615。 本发明还提供了一种畜禽饲料，包括上述黑曲霉BAK200308的培养产物。 本发明相比于现有技术具有以下有益效果： (1)本发明产出的酶之间具有很好的补充和配合作用，对裂解植物细胞壁中的大 分子化学键、松散致密有序的空间结构变得具有重要的协同作用。 (2)黑曲霉BAK200308由保安康固体发酵研发中心筛选，可一菌产多酶，具有生长 稳定、产酶种类多、安全的特性。 (3)本发明提供的多酶系复合酶，产酶经特定底物诱导更具有针对性，酶蛋白种类 更多，共14大类，105种酶蛋白。代表酶系包括：木聚糖酶、蛋白酶、果胶酶、葡聚糖酶、淀粉 酶、甘露聚糖酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、糖化酶、阿魏酸酯酶、植酸酶、羧肽酶、磷酸酶、过 氧化氢酶等。 (4)本发明中，采用现代固体发酵工艺和蛋白质组学检测理论的组合模式，以现代 固体发酵理论指导下的生产工艺为基础：针对性底物诱导发酵，通过浅盘静置发酵，发酵期 间较严格控制培养参数，以蛋白质组学检测方法进行研究：高效率检测酶制剂中的所有酶 5 CN 111607574 A 说　明　书 4/12 页 蛋白及有益于禽畜的代谢产物。与传统的固液发酵工艺、检测单一蛋白质的检测方法相比， 操作更简单，研究更深入明确，功能更明确。 (5)本发明提供的多酶系复合酶具有很强的稳定性，可以避免在运输、加工、贮存 过程中的酶活损失。 (6)本发明的现代固体发酵工艺属于环境友好型工艺，节能减排更到位。在合理的 培养条件把控下，设备投资减少，能耗降低；不产生废气废水废渣，环境污染小。该工艺符合 政策导向，适合大规模推广应用。 (7)本发明提供的多酶系复合酶制剂可有效促进禽畜生产性能的提高，减少养殖 成本的同时，增加收入。 附图说明 为了更清楚地说明本发明实施方案或现有技术中的技术方案，下面将对实施方案 或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅 是本发明的一些实施方案，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提 下，还可以根据这些附图获得其他的附图。 图1：饲料原料溶胀度程度比较；A-市售复合酶、B-本发明酶制剂、C-对照组； 图2：酶制剂对母猪便秘的影响； 图3：对霉菌毒素降解的效果：a、b为使用前，c为使用后。