技术摘要：
本发明涉及从密花大戟中分离的大环二萜类化合物及其制备方法和用途，以密花大戟（E.glomerulans）的全草为原料，用有机溶剂提取，通过溶剂萃取法、正相硅胶柱层析法、反相硅胶柱层析法、Sephadex LH‑20凝胶柱层析法中的三种至四种方法进行分离，得到式（Ⅰ）、式（Ⅱ  全部
背景技术：
大戟属(Euphorbia  L.)植物具有重要的药用价值，在治疗肿瘤方面也有广泛的应 用。从大戟属植物中分离得到的化合物主要有倍半萜、二萜、三萜等类型，其中研究报道最 多的是二萜类成分。二萜类化合物具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌等活性，对抗癌药物的研究具 有重要价值。密花大戟(Euphoria  Glomerulans)是大戟科大戟属多年生草本植物。现主要 分布于中亚和新疆奇台、乌鲁木齐、霍城、巩留等地。目前为止对密花大戟药效作用的物质 基础尚未阐明。因此，对密花大戟中的大环二萜类成分进行系统的研究，明确其药理活性的 物质基础，发现特异活性的二萜新化合物，具有重要意义。 大戟属(Euphorbia  L.)植物富含大环二萜类成分。大环二萜类化合物，即分子中 含有六元以上环状结构的二萜类化合物，骨架结构丰富多变，生物活性多种多样，包括细胞 毒、多药耐药逆转、抗菌、抗HIV病毒等活性。目前已经发现的假白榄烷(Jatrophane)二萜的 数量最多，假白榄烷二萜的结构特点是骨架由一个五元环和一个十二元环稠合而成，即5/ 12环系。经过前期研究发现，假白榄烷二萜通常是高氧化态并普遍具有分子量700以上的较 大分子结构，其结构之所以丰富，是因为在骨架上常具有各种取代基，如乙酰氧基、丙酰氧 基、苯甲酰氧基、异丁酰氧基、吡啶酰氧-3-基等。这些取代基在环上的位置不同，数目不同， 构型不同，形成了这类化合物的丰富多变性。其构效关系研究表明，骨架上取代基对其药理 作用影响比较大，所以假白榄烷型化合物取代方式决定了该类化合物的新颖性。 肿瘤多药耐药(multidrug  resistance，MDR)，即一种药物作用于肿瘤使之产生耐 药性后，该肿瘤对从未接触、结构无关、靶点不同、机制各异的多种抗肿瘤药也具有交叉耐 药性的现象。MDR有多种形成机制，其中最主要的机制之一是ABC家族转运蛋白(目前研究最 广泛、最深入的为ABCB1基因编码的P-糖蛋白，P-gp)的过表达，导致药物外排增加，形成耐 药性。近年来，许多从大戟属植物中分离得到的大环二萜类化合物被发现具有显著的抗肿 瘤多药耐药逆转活性，因而成为研究热点之一。
技术实现要素：
本发明的目的在于，提供一种从密花大戟中分离的大环二萜类化合物及其制备方 法和用途。以密花大戟(Euphoria  Glomerulans)的全草为原料，用溶剂提取，通过溶剂萃取 法、正相柱层析法、反相柱层析法、Sephadex  LH-20凝胶柱层析法中的两种至三种方法进行 分离，得到式(Ⅰ)、式(Ⅱ)和式(Ⅲ)3个新的假白榄烷型大环二萜类化合物。本发明对所述的 式(Ⅰ)、式(Ⅱ)和式(Ⅲ)假白榄烷型大环二萜类化合物进行了体外细胞毒活性测定及多药 耐药逆转活性测定。结果表明：所述新的式(Ⅰ)、式(Ⅱ)和式(Ⅲ)化合物萜类化合物具有不 同程度的抗肿瘤多药耐药逆转活性，可用于制备抗肿瘤多药耐药逆转药物中的应用，或将 4 CN 111592462 A 说　明　书 2/10 页 其与抗肿瘤药物组合制备抗肿瘤组合药物。 本发明所述的一种从密花大戟中分离的大环二萜类化合物，该化合物的结构式 为： 其中：式(Ⅰ)化合物为(2S*,3S*,4R*,5R*,7S*,8R*,13S*,15R*)-3，7-二苯甲酰氧基- 15-羟基-5,8-二乙酰氧基假白榄烷-6(17) ,11E-二烯-9,14-二酮； 式(Ⅱ)化合物为(2R*,3R*,4R*,5R*,7S*,8R*,13S*,14R*,15R*)-5,7-二苯甲酰氧基- 3,15-二羟基-2,8,14-三乙酰氧基假白榄烷-6(17) ,11E-二烯-9-酮； 式(Ⅲ)化合物为(2S,3S,4R,5R,7S,8R,13S,15R)-3-苯甲酰氧基-15-羟基-8-异丁 酰氧-5,7-二乙酰氧基假白榄烷-6(17) ,11E-二烯-9,14-二酮。 所述从密花大戟中分离的大环二萜类化合物的制备方法，按下列步骤进行： a、以密花大戟全草为原料，粉碎后，在室温下，用5-10倍量体积浓度为50-99％的 乙醇溶液、无水乙醇，体积浓度为50-99％的甲醇溶液、无水甲醇、纯丙酮或体积浓度为50- 99％的丙酮溶液进行室温下的渗漉、冷浸或加热回流提取，真空浓缩得到密花大戟粗提物； b、将步骤a得到的粗提物用乙腈分散，再加入环己烷、正己烷或石油醚萃取，再加 入乙腈萃取2-5次，将乙腈萃取液真空蒸干溶剂浓缩，得到萃取物浸膏； 或将步骤a得到的粗提物用石油醚、正己烷或环己烷分散，再加入乙腈萃取2-5次， 将乙腈萃取液真空蒸干溶剂浓缩，得到萃取物浸膏； c、将步骤b得到的乙腈萃取物浸膏经正相硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、Sephadex  LH-20凝胶柱层析，制备反相柱层析法中的三种或四种进行分离，即得到式(Ⅰ)化合物为 (2S*,3S*,4R*,5R*,7S*,8R*,13S*,15R*)-3,7-二苯甲酰氧基-15-羟基-5,8-二乙酰氧基假白 榄烷-6(17) ,11E-二烯-9,14-二酮，式(Ⅱ)化合物为(2R*,3R*,4R*,5R*,7S*,8R*,13S*,14R*, 15R*)-5,7-二苯甲酰氧基-3,15-二羟基-2,8,14-三乙酰氧基假白榄烷-6(17) ,11E-二烯- 9-酮和式(Ⅲ)化合物为(2S,3S,4R,5R,7S,8R,13S,15R)-3-苯甲酰氧基-15-羟基-8-异丁酰 氧-5,7-二乙酰氧基假白榄烷-6(17) ,11E-二烯-9,14-二酮。 步骤c中所用正相硅胶柱层析法为常压或加压柱层析，其填料为硅胶，其洗脱剂为 体积比100:1-0:1的石油醚、环己烷、正己烷、丙酮、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇中至少两种溶 剂的混合物，采用等度洗脱或梯度洗脱。 步骤c中所用反相柱层析法为常压或加压柱层析，洗脱剂为体积浓度为30-99％的 甲醇溶液或10-99％的乙腈溶液或10-99％的乙腈-甲醇-水混合溶液，采用等度洗脱或梯度 洗脱。 步骤c中所用Sephadex  LH-20凝胶柱层析法为常压柱层析，洗脱剂为体积比1:1的 甲醇、二氯甲烷、三氯甲烷中至少两种溶剂的混合物，采用等度洗脱或梯度洗脱。 5 CN 111592462 A 说　明　书 3/10 页 所述从密花大戟中分离的大环二萜类化合物在制备肿瘤多药耐药逆转药物中的 用途。 所述密花大戟中的大环二萜类化合物，式(Ⅰ)、式(Ⅱ)和式(Ⅲ)化合物在制备与抗 肿瘤药物组合的药物中的用途。 本发明所述的从密花大戟中分离的大环二萜类化合物及其制备方法和用途，通过 所述方法获得的3个新的大环二萜类化合物经过肿瘤多药耐药逆转活性测定，实验结果表 明：所述式(Ⅰ)、式(Ⅱ)和式(Ⅲ)化合物能够不同程度地抑制耐药细胞中P-糖蛋白介导的药 物排外作用，从而表现出乳腺癌多药耐药逆转活性，可用于制备抗肿瘤多药耐药逆转药物 或与抗肿瘤药物组合制备抗肿瘤组合药物。 本发明所述的密花大戟中的大环二萜类化合物，可通过从植物中分离纯化得到， 也可以经本领域技术人员熟知的化学修饰方法合成获得。 本发明所述的密花大戟中的大环二萜类化合物，采用高分辨质谱、一维和二维核 磁共振谱等现代波谱手段确定其结构，结构鉴定过程如下： 式(Ⅰ)化合物为白色无定型粉末，[α]25D 87(c  0.2,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε) 230(4.06)nm；ECD(MeOH)214(Δε-4.31)，235(Δε 7.61)，255(Δε 0.22)，301(Δε 3.13) nm；HRESI( )MS给出准分子离子峰m/z  697.2610[M Na] (计算值为C38H42O11Na  697.2625)， 确定其分子式为C H O ；根据1H，1338 42 11 C  NMR以及二维核磁共振数据确定其结构，骨架类型为 假白榄烷(Jatrophane)型，命名为(2S*,3S*,4R*,5R*,7S*,8R*,13S*,15R*)-3,7-二苯甲酰氧 基-15-羟基-5,8-二乙酰氧基假白榄烷-6(17) ,11E-二烯-9,14-二酮，其1H和13C  NMR数据归 属见表1[600MHz(1H)，150MHz(13C)，溶剂：CDCl3]。 式(Ⅱ)化合物为白色无定型粉末，[α]25D-5(c  0.1 ,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε) 230(4.04)nm；ECD(MeOH)218(Δε-1.69) ,220(Δε-1.77) ,237(Δε 2.08) ,254(Δε-0.47) , 301(Δε 0 .69)nm；根据HRESI( )MS(m/z  757 .2831[M Na] ，计算值为C40H46O13Na  757.2836)确定其分子式为C40H46O13；根据1H，13C  NMR以及二维核磁共振数据确定其结构，骨 架类型为假白榄烷(Jatrophane)型，命名为(2R*,3R*,4R*,5R*,7S*,8R*,13S*,14R*,15R*)-5, 7-二苯甲酰氧基-3,15-二羟基-2,8,14-三乙酰氧基假白榄烷-6(17) ,11E-二烯。其1H和13C  NMR数据归属见表1[600MHz(1H)，150MHz(13C)，溶剂：CDCl3]。 式(Ⅲ)化合物为白色无定型粉末，[α]25D 91(c  0.1,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε) 229(4 .26)nm；ECD(MeOH)203(Δε 0 .81) ,217(Δε-12 .94) ,236(Δε-0 .43) ,245(Δε- 0 .83) ,299(Δε 4.71)nm；根据其13C  NMR和HRESI( )MS(m/z  663 .2771[M Na] ，理论值 C35H44O11Na  663.2781)数据确定其分子式为C H 1 1335 44O11；根据 H，C  NMR以及二维核磁共振数 据确定其结构，骨架类型为假白榄烷(Jatrophane)型，命名为(2S,3S,4R ,5R ,7S,8R ,13S, 15R)-3-苯甲酰氧基-15-羟基-8-异丁酰氧基-5,7-二乙酰氧基假白榄烷-6(17) ,11E-二烯。 其1H和13C  NMR数据归属见表1[400MHz(1H)，100MHz(13C)，溶剂：CDCl3]。 表1.(Ⅰ)、式(Ⅱ)和式(Ⅲ)化合物的1H和13C  NMR数据[δ(ppm) ,J(Hz)] 6 CN 111592462 A 说　明　书 4/10 页 7 CN 111592462 A 说　明　书 5/10 页 附图说明 图1为本发明所述式(Ⅰ)化合物的1H  NMR(600MHz,CDCl3)谱图； 图2为本发明所述式(Ⅰ)化合物的13C  NMR(150MHz,CDCl3)谱图； 图3为本发明所述式(Ⅱ)化合物的1H  NMR(600MHz,CDCl3)谱图； 图4为本发明所述式(Ⅱ)化合物的13C  NMR(150MHz,CDCl3)谱图； 图5为本发明所述式(Ⅲ)化合物的1H  NMR(400MHz,CDCl3)谱图； 图6为本发明所述式(Ⅲ)化合物的13C  NMR(100MHz,CDCl3)谱图。