技术摘要：
本发明公开了大豆DDT结构域基因GmDDT1及其应用。大豆GmDDT1蛋白编码基因GmDDT1，其核苷酸序列为：SEQ ID NO.1。将构建的植物过量表达载体pMDC83‑GmDDT1在拟南芥的野生型中进行异源表达，发现转基因植株总氨基酸含量显著提高。表明该基因可以作为目的基因导入植物，通  全部
背景技术：
ISWI染色质重塑复合体最初是从果蝇中被鉴定出来的，此后酵母Itc1，果蝇 NURF301和ACF1，以及人ACF1等包含有DDT结构域的蛋白被鉴定为不同的ISWI复合体组分 (Tsukiyama  et  al.,1995；Ito  et  al.,1997；Ito  et  al.,1999；Gelbart  et  al.,2001； Bozhenok  et  al.,2002)。这些DDT蛋白相对保守的是DDT结构域，其他区域差别较大。例如 果蝇的DDT蛋白NURF301和ACF1不仅包含有DDT和WAC结构域，还含有PHD结构域和Bromo结构 域，而酵母的DDT蛋白Itc1仅含有DDT和WAC结构域。在拟南芥中，已经鉴定出至少12个编码 DDT结构域蛋白的基因，基于序列相似性可以将其分为五个亚家族(I至V类)。DDT结构域一 般与WHIM基序一起介导与核小体接头DNA和ISWI蛋白的SLIDE结构域相互作用。在真核生物 中，DDT蛋白与ISWI蛋白之间相互作用的机制已经在果蝇(Fyodorov  et  al.,2002)，拟南芥 (Li  et  al.,2012)和人类(Erdel  et  al.,2010)等几种代表性的物种中都有了相关的报 道，但是对于DDT结构域蛋白具有提高植物氨基酸含量的研究尚未见报道。 本研究通过对大豆子叶折叠突变体(cco)的初步定位结果，并结合基因在各组织 中的表达量情况以及拟南芥同源基因注释，筛选出一个DDT结构域基因，并命名为GmDDT1。 通过生物信息学方法分析该基因的序列以及蛋白质信息。利用荧光定量PCR技术检测 GmUBC1基因组织器官以及在各种非生物胁迫处理(盐碱、干旱、低温、ABA)下的表达特性。采 用酵母双杂技术探究蛋白互作情况。并构建了植物表达载体转化拟南芥，发现过表达 GmDDT1转基因拟南芥种子氨基酸含量显著提高，为进一步研究GmDDT1基因功能奠定了基 础。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供公开一个DDT结构域基因GmDDT1。 本发明的另一目的是提供该基因在植物种子氨基酸含量的基因工程应用。 本发明的目的可通过如下技术方案实现: 大豆DDT结构域基因GmDDT1，核苷酸序列为SEQ  ID  NO.1。 本发明所述的大豆DDT结构域基因GmDDT1编码的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ  ID  NO.2。 含有本发明所述的大豆DDT结构域基因GmDDT1的表达载体。 本发明所述的大豆DDT结构域基因GmDDT1在植物种子氨基酸含量的基因工程应 用。 所述的GmDDT1转基因拟南芥种子氨基酸含量提高。 3 CN 111607598 A 说　明　书 2/4 页 使用GmDDT1构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型 启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选,可对所用植 物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的选择性标记基因(GUS基因、GFP基因等)或 者抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物、潮霉素标记物等)的抗性基因。从转基 因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以表型性状筛选转化植株。 携带有本发明GmDDT1的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、 直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织,并将转 化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦、玉米等单子叶植物,也 可以是烟草、拟南芥、大豆、油菜、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等双子叶植物。 有益效果: 本发明中GmDDT1属于DDT结构域家族，该家族基因具有一个保守的DDT结构域。通 过组织表达分析发现，GmDDT1基因在所有大豆组织中均有表达，但在7d种子和13d种子中表 达最高，在13d荚中表达最低。而且在胁迫处理材料中，基因的表达量在干旱、低温、激素JA、 ABA处理下表达量均有不同程度的变化，均能响应不同处理。亚细胞定位显示GmDDT1蛋白定 位于细胞核中。利用酵母双杂交技术在大豆叶片和荚文库中筛选与GmDDT1互作的蛋白，鉴 定到两个来源于叶片文库，即ISWI染色质重塑复合物ATP酶Glyma15g10370、编码丝氨酸/苏 氨酸蛋白激酶的基因Glyma08g47570和一个来源于荚文库的ISWI染色质重塑复合物ATP酶 Glyma13g28720。拟南芥中过表达GmDDT1，发现与对照野生型拟南芥相比，转基因拟南芥种 子各组分氨基酸含量和总氨基酸含量提高。本发明公开了该基因在促使植株果实氨基酸含 量提高现象的发生。可以通过定向地改造作物的果实氨基酸含量，为农作物提高品质。 利用植物过表达载体pMDC83-GmDDT1，将本发明的GmDDT1导入植物体内,可以调控 植株果实发育，获得转基因植株。 附图说明 下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。 图1  GmDDT1基因的组织表达分析。 采用实时荧光定量PCR技术对GmDDT1在大豆“南农94-16”以及cco的不同组织表达 进行研究，大豆不同组织分别为叶、茎、花、7d荚、13d荚、7d种子、13d种子、子叶。 图2  GmDDT1在胁迫处理下的表达量变化 A为15％PEG干旱处理；B为250mMNaCl处理；C为4℃低温处理；D为100μM  ABA处理。 图3  GmDDT1的亚细胞定位(A)d35s::GFP；(B)d35s::GmDDT1-GFP； 图4  GmDDT1互作蛋白的回转验证结果 A:酵母叶文库，B:酵母荚文库；阳性对照：转pGADT7-T和pGBKT7-53质粒；阴性对 照：pGADT7-T和pGBKT7-lam质粒。 图5转基因拟南芥的PCR鉴定。 图6转基因拟南芥和野生型拟南芥氨基酸含量检测 *表示0.01