技术摘要：
本发明涉及一种肿瘤细胞三维模型的建立方法和应用，建立方法步骤如下：(1)制备富血小板纤维蛋白粉末，无菌保存；(2)制备富血小板纤维蛋白粉末‑生物活性材料复合多孔微球，无菌保存；(3)将肿瘤单细胞与复合多孔微球共培养得到肿瘤细胞三维模型；生物活性材料开始发生降  全部
背景技术：
晚期肿瘤患者的抗肿瘤药物抵抗导致癌症死亡率居高不下。因此，新型抗肿瘤药 物的开发对于提升患者生存至关重要。而新型抗肿瘤药物的快速和有效筛选依赖于更具预 测性的临床前研究模型，并对筛选获得的药物进行后续动物实验和人体临床试验，提升研 究和临床转化效率。肿瘤微环境在调控肿瘤发生、进展和转移中起主导作用，肿瘤细胞与周 围环境的高度动态相互作用表明，在生物材料支架中研究肿瘤可能比传统单层组织培养模 型更仿真可靠，有助于分子通路与新型治疗靶点的研究与探索。回顾既往研究，在各种平面 基板上培养的二维(2D)单层细胞是筛选药物的便捷有效方法。而目前研究表明，在药物进 入动物模型研究或临床试验之前，使用三维(3D)细胞培养体系以及更好的细胞模型(例如 干细胞和原代细胞)可以提高药物作用和毒性的可预测性，同时会降低正在开发的新药物 的损耗率。研究表明，三维培养后的肿瘤细胞团更接近体内肿瘤组织的生长状态，在基因表 达、耐药性及粘附生长方面明显不同于传统平面培养的细胞。 构建肿瘤多细胞球体模型是一种目前常用的体外三维培养模型，常用来形成多细 胞球体的技术有悬浮培养法、微流控法、外加离心力法、重力法及微球培养法。悬浮培养成 团率低，微流控法、外加离心力法、重力法均会对肿瘤细胞产生剪切力，因此微球培养法已 成为一种优选的制备肿瘤多细胞团的技术。 专利CN201910789298.1介绍了一种表面具有微拓扑结构的可降解微球，采用乳化 法制备了表面具有凹陷或褶皱结构的椭圆微球，该专利所述的微球粒径为1～600微米，具 有良好的生物相容性且细胞能在微球表面粘附、生长，但该微球降解时间过长(3个月的降 解残存率仍为85％～98％)，不适于进行肿瘤细胞的三维培养；专利CN201510072086.3介绍 了一种三维复合微球，采用天然或化学合成聚合物制备亚微米级微球，并以人E-钙粘素修 饰微球，制备出表面改性E-钙粘素介导的生物材料微球，该专利所述的微球可通过钙粘素 和黏着连接信号分子促进微球与细胞共培养形成微球/干细胞复合微球，用于干细胞三维 状态下增殖、分化的研究，但是该种方法制备微球采用的蛋白融合及修饰方法较为复杂，且 E-钙粘素只存在于微球表面，不能与微球内部细胞进行作用，在培养细胞时需要借助悬滴 或离心等方法，这些过程会对细胞造成一定损伤；专利CN201910133058.6介绍了一种载细 胞海藻酸盐凝胶微球，采用基质材料为天然高分子材料海藻酸盐溶液与二价金属离子进行 螯合反应制备水凝胶，其中凝胶体系为粒径100～2000微米的球形胶珠，该专利所述的微球 可使细胞呈现三维立体生长方式，且比动物模型更为经济，但是该微球缺少维持细胞活性 的生物因子，在包埋细胞时存在细胞活性不稳定、肿瘤细胞成团性较差等缺点。 3 CN 111599003 A 说　明　书 2/7 页
技术实现要素：
本发明的目的是解决现有技术中存在的问题，提供一种肿瘤细胞三维模型的建立 方法和应用。本发明利用天然材料富血小板纤维蛋白粉末(PRF)及可降解生物活性材料制 备成多孔、可降解且具有生物活性成分的复合多孔微球，通过对肿瘤细胞的三维培养形成 肿瘤多细胞球体，与单一使用生物活性材料的支架相比，可快速建立肿瘤细胞三维培养模 型并维持肿瘤细胞活性。 为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下： 一种肿瘤细胞三维模型的建立方法，步骤如下： (1)制备富血小板纤维蛋白粉末，无菌保存； (2)制备富血小板纤维蛋白粉末-生物活性材料复合多孔微球，无菌保存； (3)将肿瘤单细胞与富血小板纤维蛋白粉末-生物活性材料复合多孔微球共培养 得到肿瘤细胞三维模型，在此过程中，生物活性材料逐渐降解，肿瘤细胞会不断分泌新的胶 原蛋白，逐渐形成肿瘤多细胞球体，在这个肿瘤多细胞球体内，仅有少量的微球物质残留， 但一个微球可形成多个肿瘤多细胞球体； 共培养结束时生物活性材料的降解率为30～99％。 本发明建立肿瘤细胞三维模型的过程中制备微球采用的原料为富血小板纤维蛋 白粉末和生物活性材料，且共培养结束时生物活性材料的降解率为30～99％，使得肿瘤细 胞生长过程中不受阻于材料的限制能够形成多细胞球体，有效解决了现有技术中存在的微 球降解时间过长不适于进行肿瘤细胞的三维培养的问题； 本发明建立肿瘤细胞三维模型的过程中制备微球采用的原料为富血小板纤维蛋 白粉末和生物活性材料，富血小板纤维蛋白(PRF)粉末具有多种生长因子，主要包括血小板 衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、转化生长因子-β2(TGF-β2)、表皮样生长 因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、成纤维细胞生长因子 (FGF)等，血液中还存在三种蛋白质：纤维素、纤连蛋白及玻粘连蛋白，这些生长因子和蛋白 质都能促进肿瘤细胞的增殖与血管化，有效解决了现有技术中存在的微球缺少维持细胞活 性的生物因子，在包埋细胞时存在细胞活性不稳定、肿瘤细胞成团性较差的问题，同时本发 明制备微球采用的方法为小孔挤出法、静电液滴法、微流控法或乳化法，富血小板纤维蛋白 粉末能够均匀分散在微球内外，在进行细胞培养时，细胞不仅能与微球表面的生长因子接 触，还能进入微球内部与微球内部的生长因子接触，有利于肿瘤细胞的增殖，有效解决了现 有技术中存在的生长因子只存在于微球表面不能与微球内部细胞进行作用的问题。 作为优选的技术方案： 如上所述的一种肿瘤细胞三维模型的建立方法，富血小板纤维蛋白粉末的制备过 程为：按需采取适量静脉血，置于无菌离心管中，迅速以2000～4000r/min的转速离心10～ 30min(转速和离心时间过低会影响提取PRF的效率，过高会对PRF产生一定的破坏效果包括 PRF的三维微结构和所含生长因子的量)，静置1～4h(静置时间过短PRF还没有完全交联在 一起，此时取凝胶层制备颗粒会损失部分PRF)后取凝固物中间黄色凝胶层制成颗粒，-20～ 4℃储藏备用。 如上所述的一种肿瘤细胞三维模型的建立方法，富血小板纤维蛋白粉末的平均直 径为200～1000微米。 4 CN 111599003 A 说　明　书 3/7 页 如上所述的一种肿瘤细胞三维模型的建立方法，富血小板纤维蛋白粉末-生物活 性材料复合多孔微球的平均直径为200～2000微米，表面具有凹陷或贯穿孔洞，平均孔径为 10～40微米，孔隙率为40％～70％。 如上所述的一种肿瘤细胞三维模型的建立方法，制备富血小板纤维蛋白粉末-生 物活性材料复合多孔微球是指采用小孔挤出法、静电液滴法、微流控法或乳化法将分散有 富血小板纤维蛋白粉末的生物活性材料溶液制成富血小板纤维蛋白粉末-生物活性材料复 合多孔微球，生物活性材料溶液的浓度为0.25～2wt％(浓度过高制备的微球孔隙率过低， 不利于肿瘤细胞向微球内部生长；浓度过低导致混合溶液粘度不高，不利于制备多孔微 球)，生物活性材料溶液的体积与制备富血小板纤维蛋白粉末采用的静脉血的体积之比为 1:5～20。 如上所述的一种肿瘤细胞三维模型的建立方法，共培养的过程为：将平面培养的 肿瘤细胞消化重悬得到肿瘤单细胞悬浮液后，采用注射器或移液枪将肿瘤单细胞悬浮液植 入到富血小板纤维蛋白粉末-生物活性材料复合多孔微球中，在温度为37℃且二氧化碳体 积浓度为5％的条件下培养1～3天，两天换液一次。 如上所述的一种肿瘤细胞三维模型的建立方法，肿瘤单细胞悬浮液的植入密度为 1～5×106/200μl；肿瘤细胞为前列腺癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、肾癌细胞、红白血 病K562细胞、人早幼粒白血病细胞、肝癌细胞或宫颈癌细胞，包括但不限于此；培养基为本 领域内技术人员熟知的相应细胞所对应的培养基。 如上所述的一种肿瘤细胞三维模型的建立方法，生物活性材料为胶原蛋白、明胶、 海藻酸类材料、壳聚糖、透明质酸和聚乙二醇中的一种以上，包括但不限于以上几种材料， 在使用这些材料进行三维培养时发现，肿瘤细胞血管生成因子(VEGF、bFGF、IL-8)和基质金 属蛋白酶(MMPs)的分泌相比于平面培养明显增加。 本发明还提供了采用如上任一项所述的一种肿瘤细胞三维模型的建立方法建立 的肿瘤细胞三维模型的应用，用作抗肿瘤药物筛选模型；抗肿瘤药物筛选过程为：首先确定 目标药物及其对应的药物敏感性测试方法，然后按目标药物对应的药物敏感性测试方法对 抗肿瘤药物筛选模型进行测试，得到抗肿瘤药物筛选模型的基因表达、蛋白表达及基质金 属蛋白酶活性，最后判断基因表达、蛋白表达及基质金属蛋白酶活性是否满足要求。 本发明还提供了采用如上任一项所述的一种肿瘤细胞三维模型的建立方法建立 的肿瘤细胞三维模型的应用，用于建立小鼠肿瘤病理模型，具体过程为：将肿瘤细胞三维模 型植入小鼠皮下，即完成建立小鼠肿瘤病理模型。 有益效果： (1)本发明的肿瘤细胞三维模型使用PRF与生物活性材料组分共同制备富血小板 纤维蛋白粉末-生物活性材料复合多孔微球，在成分上，PRF制备简单且含有对肿瘤细胞生 长起积极作用的生长因子，生物活性材料可快速降解且具有生物活性，无免疫排斥反应，对 肿瘤ECM有极好的成分模拟；在结构上，这种具有凹陷或贯穿孔洞的多孔复合多孔微球结构 为肿瘤细胞培养提供了三维环境，因此使得细胞能在较短的时间内就获得可用肿瘤多细胞 球体，而且成本低、效率高； (2)本发明提供一种利用富血小板纤维蛋白粉末-生物活性材料复合多孔微球进 行细胞培养的三维培养方法，肿瘤细胞在生长时还可通过微球的孔进入微球内部生长，相 5 CN 111599003 A 说　明　书 4/7 页 较于平面培养，细胞的生理状态、所处环境及基因表达更接近体内生长情况；相较于动物实 验，成本更加低廉； (3)本发明所制得富血小板纤维蛋白粉末-生物活性材料复合多孔微球在与细胞 共培养时随着细胞不断增殖会逐渐降解，微球内外的细胞逐渐长成肿瘤多细胞球体，肿瘤 多细胞球体内少有微球组分残留，进行药物筛选时不会出现成分干扰； (4)制备工艺上，PRF并非通过简单的涂层或接枝到生物活性材料微球表面，而是 通过将PRF与生物活性材料充分混合制备成富血小板纤维蛋白粉末-生物活性材料复合多 孔微球，富血小板纤维蛋白粉末能够均匀分散在微球内外，在进行细胞培养时，细胞不仅能 与微球表面的生长因子接触，还能进入微球内部与微球内部的生长因子接触，这种充分接 触有利于肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤多细胞球体的形成； (5)制备工艺上，本发明所述肿瘤细胞三维模型制备绿色无毒，肿瘤多细胞球体回 收简单便捷利于后续表征分析，可用于大规模生产，还可用于建立小鼠肿瘤病理模型。 附图说明 图1是本发明提供的富血小板纤维蛋白的扫描电镜图； 图2是本发明提供的富血小板纤维蛋白-胶原蛋白复合多孔微球图。