技术摘要：
本发明公开了一种能特异性识别O‑GlcNAc修饰的单链DNA适配体及其筛选方法和应用，属于生化检测技术领域。具体为以指数富集的配基系统进化技术(SELEX)为基础，以O‑GlcNAc修饰多肽为筛选靶标，以未修饰的多肽作为反筛。经多轮筛选后获得能够特异性识别O‑GlcNAc修饰的DN  全部
背景技术：
蛋白质O-GlcNAc修饰广泛存在于多种蛋白质中，是一种营养及应激反应的翻译后 修饰。自发现以来已经有4000多种蛋白质被鉴定具有O-GlcNAc修饰，这些蛋白几乎参与了 所有生理过程，如蛋白质结构的稳定、信号传导、调节转录活性、调节表观遗传、调节神经元 功能以及蛋白质间的相互作用、应激反应等都具有非常重要的作用。蛋白O-GlcNAc修饰发 生异常时，也会导致多种疾病的发生。如肿瘤、糖尿病、心血管疾病、神经退行性疾病以及其 它慢性疾病等都与O-GlcNAc修饰异常有关。 随着越来越多的研究，O-GlcNAc修饰的重要性不断展现出来。而研究O-GlcNAc修 饰首要的方法就是要鉴定和富集出具有此种修饰的蛋白质，然而在O-GlcNAc修饰的鉴定方 面却有不少困难，因为修饰不仅分子量小，丰度较低而且处于高度动态性变化中，在制备质 谱样品时这种修饰极易脱落等。虽然目前有多种检测鉴定O-GlcNAc修饰的方法，但都无法 满足对O-GlcNAc修饰进行大批量的鉴定研究。例如，凝集素法特异性较低，现有的O-GlcNAc 修饰抗体不仅昂贵而且抗体具有氨基酸序列依赖性等等。开发新的O-GlcNAc修饰检测方法 不仅是对已有方法的补充，也是更系统深入的探究O-GlcNAc修饰的需要。 指数富集配体系统进化技术(SELEX)一种体外筛选针对靶标的单链核酸分子的技 术，该技术应用广泛，能筛选针对多种不同靶标。基于SELEX技术筛选出能够特异性识别O- GlcNAc修饰的ssDNA适配体不仅能够为检测O-GlcNAc修饰提供新方法，也能进一步拓宽核 酸适配体的发展和应用。
技术实现要素：
本发明的目的之一，提供一种识别O-GlcNAc修饰糖肽的单链DNA核酸适配体的筛 选方法。 本发明的另一目的在于提供一种识别O-GlcNAc修饰糖肽的核酸适配体。 本发明的目的还在于提供上述适配体的应用。一种蛋白质O-GlcNAc修饰水平的检 测方法，方法以O-GlcNAc适配体为核心，利用生物素或荧光分子等功能集团对该适配体进 行标记，用于特异性识别蛋白质中或细胞中的O-GlcNAc修饰，利用蛋白印记或免疫荧光等 方法检测蛋白质中的O-GlcNAc修饰水平。 具体的技术方案如下： 第一方面，本发明提供一种能特异性识别O-GlcNAc修饰的单链DNA适配体的筛选 方法，其特征在于：即是基于SELEX技术筛选识别O-GlcNAc修饰的单链DNA核酸适配体的方 法；包含以下步骤： 3 CN 111549035 A 说　明　书 2/7 页 (1)用人工合成的O-GlcNAc修饰多肽，多肽N-端为半胱氨酸其氨基被乙酰基保护， 具体为： 用人工合成的有O-GlcNAc修饰多肽作为SELEX的筛选靶标，多肽信息为多肽序列： CGSGGTGGSGL，其中第三位丝氨酸、第六位苏氨酸和第九位丝氨酸羟基氧原子上被N-乙酰葡 萄糖胺修饰，将修饰多肽通过金巯反应连接到纳米金颗粒表面以便于将结合和未结合的适 配体分离； (2)将多肽通过金巯反应连接到纳米金颗粒表面，用于筛选过程中将结合与未结 合的适配体进行固液分离，具体为： 设计筛选所用单链DNA适配体文库(见序列表文件SEQ  ID  NO.2)，其两端为固定序 列，用于结合引物进行PCR扩增，中间为30个nt的随机序列，用于形成丰富的形态结构； (3)利用DNA寡核苷酸文库与O-GlcNAc修饰多肽进行反复的孵育-洗脱-扩增，获得 每一轮富集后的次级文库，具体为： 通过文库和靶标多肽的共同孵育，去除未结合的适配体，将结合的适配体回收后 进行PCR扩增，再通过不对称PCR得到次级文库，用于后续轮次的使用。通过加入未修饰的多 肽进行反筛以增强筛选压力，经过多轮筛选将能与O-GlcNAc修饰糖肽结合的适配体进行富 集； (4)得到各轮富集的ssDNA亚文库通过酶联免疫吸附试验和微热量泳动技术测定 亲和力最佳的次级分库，随后通过鉴定单个核酸适配体的亲和力筛选出具有较好特异性和 亲和力的几条候选核酸适配体，具体为： 比较各轮筛选的次级文库与O-GlcNAc修饰多肽亲和力，将亲和力最高的次级文库 进行高通量测序分析，选出富集较多且具有代表性的候选适配体进行验证，得到能特异性 结合O-GlcNAc修饰的适配体。 作为优选方案，还包括以下步骤(5)：选出具有代表性的候选适配体以后，分别用 微热量泳动技术(MST)和酶联寡聚核苷酸吸附试验(ELONA)法检测候选适配体的特异性和 亲和力，选出特异性好，亲和力高的适配体。最后利用适配体检测蛋白质中的O-GlcNAc修饰 水平。 通过上述方法，得到识别O-GlcNAc修饰的单链DNA核酸适配体，命名为aptO-19。 进一步地，所述步骤(4)中筛选得到的候选核酸适配体的鉴定方法如下：通过高通 量测序分析筛选结果得到结合的适配体群体信息并通过微热量泳动技术鉴定适配体与靶 标的结合情况，筛选出特异性较好亲和力较高的适配体；结合解离常数及特异性结合情况， 鉴定出其中最佳的DNA核酸适配体。 第二方面，本发明还提供一种能特异性识别O-GlcNAc修饰的单链DNA适配体，其特 征在于：所述单链DNA适配体通过权利要求2中筛选选方法得到，并利用权利要求3中的方法 进行鉴定；所述单链DNA适配体的序列如SEQ  ID  NO.1所示。 第三方面，本发明提供一种如上述的单链DNA适配体在检测O-GlcNAc修饰水平中 的应用，其特征在于：利用生物素/荧光/酶标/化学发光或多价化等标记的适配体用于检测 细胞或组织中蛋白质O-GlcNAc修饰水平。 上述适配体在蛋白质O-GlcNAc修饰水平检测中的应用，具体为以该适配体为核 心，利用生物素或者荧光分子标记该适配体作为检测试剂，再利用HRP标记的链霉亲和素或 4 CN 111549035 A 说　明　书 3/7 页 者共聚焦显微镜等观察蛋白质的O-GlcNAc修饰水平。 本发明的优点及有益效果如下： (1)本发明应用了微热量泳动技术检测了核酸适配体与O-GlcNAc修饰多肽的结 合，并用未修饰的多肽进行验证，保证了适配体结合的特异性，而且为微热量泳动技术在适 配体筛选中的进一步应用提供了支持； (2)本发明以从核酸适配体的角度出发，尝试了一种新的检测O-GlcNAc修饰的方 法，同时拓宽了适配体的应用范围。 附图说明 图1、各轮次级文库与O-GlcNAc修饰多肽的亲和力比较。用ELONA法检测次级文库 亲和力。 图2、候选适配体与O-GlcNAc修饰多肽结合情况检测。MST检测各适配体与修饰多 肽结合的适配体。筛选出6种能够结合O-GlcNAc修饰多肽的适配体。 其中：图2为各候选适配体与O-GlcNAc修饰多肽相互作用的剂量-反应曲线(基线 校正归一化荧光曲线)(注：信噪比(S/N)<5为配体和受体之间无特异性结合；>5为具有可信 的的结合信号；S/N>12表示结合信号良好；“/”为未检测到结合信号无对应拟合曲线) 图3为6种与修饰多肽结合的适配体的MST剂量-反应曲线(结合分数曲线) 图4、与O-GlcNAc修饰多肽结合的6种适配体与未修饰多肽相互作用的剂量-反应 曲线(基线校正归一化荧光曲线) 图中：能与修饰多肽结合的适配体与未修饰多肽的结合情况检测。从6种能够结合 O-GlcNAc修饰多肽的适配体中筛选出三种仅结合O-GlcNAc修饰多肽结合的适配体。 图5、用ELONA法比较适配体aptO-14与O-GlcNAc修饰多肽的亲和力大小。 图6、用ELONA法比较适配体aptO-19与多肽的亲和力大小。 图7、用ELONA法比较适配体aptO-31与O-GlcNAc修饰多肽的亲和力大小。 图8、aptO-19适配体二级结构预测。用软件DNAMAN分析仅识别O-GlcNAc修饰多肽 且亲和力最高的适配体aptO-19的二级结构。 图9、aptO-19适配体检测蛋白质中的O-GlcNAc修饰。蛋白印记法检测人PKM2中O- GlcNAc修饰水平。