技术摘要：
本发明公开了TPN分子在制备循环肿瘤细胞检测试剂中的用途及包含该TPN分子的检测试剂和试剂盒。本发明的TPN分子具有如下所示的结构，可以作为线粒体荧光探针，基于肿瘤细胞和正常细胞的线粒体差异，用于制备循环肿瘤细胞检测试剂，实现对外周血中少量循环肿瘤细胞的检测  全部
背景技术：
循环肿瘤细胞(circulating  tumor  cells，CTCs)主要指为自发或因诊疗操作脱 离实体瘤原发灶或转移灶而进入外周血循环的肿瘤细胞。透过基底膜进入血液后，少数 CTCs能逃避机体的免疫杀伤而存活下来，部分肿瘤细胞团也可以直接从原发灶脱离并进入 循环系统，形成循环肿瘤微栓(circulating  tumor  microemboli，CTM)。这些CTCs和CTM随 血液播散后可在其他部位形成新的转移灶，与肿瘤的转移和复发密切相关。因而CTC的检测 及分析在微转移灶早期发现、疗效评估与个体化治疗等方面具有重要临床应用价值。 但是，CTCs在外周血中十分稀少，癌症早期大约为每1010(100亿)个血细胞或每 108-9个白细胞中存在1个CTC，且在形态和类别上有一定的异质性。目前，较为经典的CTC鉴 定方法就是根据显色剂标记的CTC表面蛋白特异性抗体与肿瘤细胞通过抗原抗体反应进行 定性、定位和定量，包括由此衍生出的流式细胞术鉴定及包被抗体的CTC芯片等相关鉴定技 术，常用的抗体有EpCAM抗体、细胞角蛋白CK-8、CK-18和CK-19、抗肿瘤相关糖蛋白(TAG)或 特异性标志物(如HER2、抗乳球蛋白等)等。此外，使用逆转录聚合酶链反应检测的方法,基 于组织或肿瘤特异性mRNA的异常表达或某些基因突变后DNA水平的改变，检测这些不表达 于正常外周血细胞mRNA，能间接提示CTCs的存在。 对上皮型标志物如蛋白或DNA、mRNA进行免疫荧光分析是CTC鉴定最常用的方法， 但这类标志物的缺陷十分突出： 1)受肿瘤类型和肿瘤细胞EMT的影响； 基于抗原抗体结合从而进行鉴定的方法如细胞表面蛋白EpCAM、E钙黏素、细胞角 蛋白(CK)等这类标志物检测CTC的特异性欠佳，部分正常内皮细胞也会表达上皮型标志物， 甚至有研究表明极少数中性粒细胞也会表达；而且这类标志物只表达在部分上皮源性的恶 性肿瘤(癌)中，无法用于间叶组织源性的恶性肿瘤，并且即使是源自上皮组织的恶性肿瘤， 研究也证实肿瘤细胞亦会在转移、进展和治疗等情况下发生EMT而导致该类标志物的表达 降低甚至缺失，从而导致漏检； 2)影响CTC的下游分析应用； 无论是基于抗体还是荧光原位杂交的CTC鉴定方法，大部分须对CTC进行固定、穿 膜等繁琐步骤，固定后的细胞难以单细胞分离，并且会很大程度地影响CTC的活性和DNA/ RNA质量，给CTC的单细胞分析或培养带来困难； 3)稳定性欠佳； 基于抗体或荧光原位杂交的CTC鉴定方法操作步骤均较为复杂繁琐，使用的试剂 及检测平台成本较高，导致CTC的检测价格水涨船高，且难以控制假阳性。这些缺陷极大地 4 CN 111596053 A 说　明　书 2/8 页 限制了CTC的临床推广应用。 此外，对于使用mRNA对细胞进行鉴定的方法而言，尽管RT-PCR技术的灵敏度已经 很高，但由于mRNA的不稳定性、取样时上皮细胞的污染、肿瘤标志物在外周血的非正常表达 以及假基因干扰等因素的影响，可导致假阳性。同时该方法无法进行形态学观察以及肿瘤 细胞的定量，限制了该技术的应用。
技术实现要素：
针对现有技术存在的上述缺陷，本发明提供TPN分子在制备循环肿瘤检测试剂中 的用途、检测试剂和试剂盒。 本发明提供如下技术方案： TPN分子在制备循环肿瘤细胞检测试剂中的用途，所述TPN分子具有式(I)所述结 构： 根据本发明，所述循环肿瘤细胞检测试剂包括所述TPN分子。 根据本发明，所述TPN分子作为线粒体荧光探针标记待测样品中的循环肿瘤细胞。 根据本发明，所述循环肿瘤细胞的来源并没有特别限定，可用于检测，例如可以为 来源于肺癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌中一种或两种以上的肿瘤 细胞。 根据本发明，所述待测样品可以为血液、细胞悬浮液、胸水、腹水、脑脊液中的一 种。 根据本发明，所述检测试剂还包括细胞裂解液、细胞重悬液。 进一步地，所述检测试剂还包括CD45分子。 根据本发明，所述检测试剂的使用方法包括如下步骤:将待测样品加入CD45抗体； 然后加入所述TPN分子，混匀。 根据本发明，所述检测试剂的使用方法还包括添加TPN分子后，用荧光显微镜检测 的步骤。 根据本发明，所述检测试剂的使用方法包括待测样品预处理的步骤；在一个实施 方式中，所述待测样品为血液样品，所述预处理包括将血液样品用红细胞裂解液处理、离 心、重悬、富集处理。 作为本发明的一种实施方式，所述检测试剂的使用方法包括：(1)血液样品加入红 细胞裂解液，静置后离心；弃去上清后加入细胞重悬液混匀后进行富集处理； 5 CN 111596053 A 说　明　书 3/8 页 (2)回收富集的样品，弃去上清，保留管底液体；加入CD45抗体，混匀后孵育，例如 30-45min；然后加入TPN分子，混匀后共同孵育一定时间，例如5-15min； (3)加入PBS吹打混匀后离心，弃去上清后转移至多孔板中，于荧光显微镜下观察； (4)在405nm激发波长下进行观察，TPN阳性、细胞体积较大、CD45阴性的细胞，作为 样品中CTC的数量。 根据本发明，所述多孔板没有特别限定，可以为本领域已知的用于镜下观察细胞 的多孔板，例如各种类型和规格的细胞培养板或者玻片。优选地，所述多孔的细胞培养板可 以为96孔板。 本发明还提供一种循环肿瘤细胞检测试剂，其包括上述TPN分子。 本发明进一步提供一种循环肿瘤细胞检测试剂盒，其包括上述检测试剂。 根据本发明的检测试剂盒，所述试剂盒还包括储存所述检测试剂的容器。 进一步地，所述试剂盒还包括使用所述试剂盒的指导说明，例如产品说明书、使用 示意图等。 因肿瘤细胞生长活跃，其体内线粒体的数量远多于血液中白细胞的线粒体数量， 故本发明使用TPN对血液细胞进行染色时，白细胞的荧光强度较弱，而肿瘤细胞的荧光强度 较强，基于二者荧光强度的差异结合CD45抗体对白细胞的区分，从而在血液中检测循环肿 瘤细胞。 有益效果 (1)本发明利用TPN靶向线粒体的独特性质基于肿瘤细胞与正常血细胞线粒体差 异进行CTC鉴定，不依赖蛋白标志物，不受肿瘤细胞类型、表面标志物以及EMT的限制，可用 于泛癌检测，扩展临床应用范围，不易造成CTC漏检。 (2)TPN具有低毒性、高荧光强度、高光稳定性等优点，且TPN可以快速聚集于细胞 线粒体中，激活RIM，产生明亮的黄光，使得肿瘤细胞与白细胞可以很好地区分。且TPN对肿 瘤细胞的毒性较低，可很大程度地保留CTC的活性和基因完整性，本发明的检测试剂用于检 测时无需固定、穿膜等复杂操作，可最大程度保留CTC的活性和基因组完整性，便于CTC的下 游单细胞分析以及体外培养。经TPN标记后的CTC可用于下游的单细胞基因组和转录组分 析，获得肿瘤病人的分期分型、药物耐受等信息，优于市场上的大多数可能造成CTC基因信 息丢失的鉴定方法，具有极高的临床应用价值。 (3)本发明将TPN分子用于循环肿瘤细胞检测，具有高度灵敏性，可精确检出受试 者外周血中的少数循环肿瘤细胞，稳定性佳，准确性好，可为肿瘤患者的临床诊断提供参 考。 术语定义和说明 术语“循环肿瘤细胞”或“CTCs”，是指从肿瘤脱落并在血液中(即在循环中)存在的 肿瘤细胞，包括自发或因诊疗操作脱离实体瘤原发灶或转移灶而进入外周血循环的肿瘤细 胞。 术语“样品”或“标本”是指从生物有机体获取或分离的试样，例如来自受试者的血 液试样，示例性的生物学试样包括但不限于：生物流体试样、血清、血浆、尿液、唾液、肿瘤组 织、肿瘤活检物和/或组织试样等；还包括未处理或预处理的生物学试样。在一些实施方式 中，还可以包括来自受试者的细胞，例如来自受试者肿瘤细胞的试样。 6 CN 111596053 A 说　明　书 4/8 页 术语“癌症”或“肿瘤”是指干扰机体器官和系统的正常功能的不受控的细胞生长， 包括良性和恶性。患有癌症或肿瘤的受试者是在受试者体内存在客观上可测量的癌细胞的 受试者。 术语“线粒体荧光探针”是指能进入细胞内，选择性与线粒体进行结合的荧光物 质。 术语“EMT”是指上皮细胞-间充质转化，包括上皮细胞通过特定转化程序转化为具 有间质表型细胞的生物学过程。 术语“RIM”代表Restriction  of  intramolecular  motions，即分子内振转受限， 指的是在聚集过程中振动受限和转动受限同时存在时，表现出聚集诱导发光(AIE)效应。 附图说明： 图1：HeLa细胞的荧光图像。A为TPN(0 .75×10-6M)染色5分钟，呈黄色荧光；B为 MitoTracker  red  FM(MT，50×10-9M)染色15分钟，呈红色荧光；C为A和B的合并图像，呈橙色 荧光；D为HeLa细胞的明场图像。 图2：相同染色条件下(TPN  2μM，CD45  1:50)相同荧光条件下肿瘤细胞及血液白细 胞(WBC)的荧光成像效果。 图3：在加标实验中通过TPN鉴定肿瘤细胞；A为肿瘤细胞发出强的黄色荧光，B为预 标记的CFDA  SE的绿色荧光，C为白细胞(CD45 )呈红色荧光，D为明场图像；比例尺30μm； 图4：A549、H1975、HepG2、SMMC-7721、HT29、MDA-MB-231细胞和白细胞用2μM的TPN 染色15分钟的荧光图像；比例尺200μm。 图5：TPN检测H1975细胞和HepG2细胞的回收率分布。 图6：来自27名肺癌患者和10名健康受试者的5mL全血中TPN阳性细胞计数结果；*P <0.05。 图7：PI法检测TPN对HeLa细胞的细胞毒性。 图8：通过MDA(左)和MALBAC(右)从单个A549细胞扩增的10个靶基因的PCR产物的 琼脂糖凝胶电泳。 图9：MDA对A549单细胞扩增后，通过Sanger测序证实有KRAS突变(p.G12S  c.34G> A)。 图10：Agilent  2100生物分析仪对单个A549细胞转录组扩增产物的质量评估。 图11：TPN分子和2-NBDG探针对于A594肿瘤细胞的荧光强度对比。