技术摘要：
本发明涉及用于纯化和回收一种或多种染色体外核酸序列的新设备和新方法。
背景技术：
和技术现状 多核苷酸的纯化一般从能够产生大量这些多核苷酸的宿主细胞中获得(这可能是 在基因工程之后)。 已知，通过连续的纯化步骤(包括但不限于选择性沉淀、沉降、过滤和在色谱柱上 的特异性保留)，可裂解革兰氏阴性细菌(例如大肠杆菌)的生物量，并将其目的核苷酸序 列，特别是染色体外核酸序列与批量基因组核酸和蛋白质分离。 然而，根据所遵循的方案，这些目的核酸序列与污染物(或杂质)(如内毒素、酚、氯 化铯、溴化乙锭、 结合的蛋白或其他核酸)组合。 由于高纯度的核苷酸序列，特别是染色体外的核酸序列，在实验室中或用于临床 目的的特殊用途是需要的，因此提出了若干种减少污染物量的尝试。 通常，用于分离它们的方法涉及细胞裂解步骤，其中添加碱、表面活性剂或酶，然 后与中和溶液混合，并且最终与沉淀溶液混合，以从溶液中回收与沉淀的污染细胞组分(基 因组DNA、蛋白质和蛋白质-核复合物)分离的一种或多种染色体外序列。 然而，使用碱性溶液、表面活性剂、加热步骤和/或一个或多个长程序将降解这些 核苷酸序列。此外，包括这些一种或多种染色体外核酸序列的DNA分子对机械应力敏感。此 外，高粘性溶液可能导致局部异质性或需要大量混合，两者都具有降解这些核苷酸序列的 潜力。当使用二价金属的浓氯化物(如CaCl2)溶液时尤其如此。 已知分批方法存在污染和/或异质性的风险，特别是在大规模的情况下。 文献WO  2010/0136503描述了一种用于有效纯化DNA质粒的方法和设备，其中DNA 质粒污染物的沉淀是通过在通道中将崩解的细胞与含有一种或多种盐(如CaCl2)的溶液混 合，并通过随后通过重力倾析从溶液中分离沉淀物而获得的。 在该方法和设备中，通过在管件元件中诱导文丘里效应的手段的集成，获得崩解 的细胞和盐的有效混合以及随后的沉淀。这种文丘里效应是通过管件元件中的内径减小约 40％而获得的。术语“诱导文丘里效应”是指从使用的系统获得的流动中的紊流，其中层流 中的流体被迫以这样的程度进入缩小的管件中，所述程度使得流体具有增加的速度，并且 在缩小的直径之后刚好引起凹陷。 在管件元件中产生的文丘里效应导致在不降解DNA质粒和不在液体中产生高剪切 力的情况下获得的有效混合。因此，已知在重搅拌力或重剪切力下没有发生DNA分子的降 解，鉴于在所述方法中观察到5M  CaCl2溶液的高粘度，这是必要的。然而，这种需要整合用 于诱导文丘里效应的手段的方法和设备专用于生产数克质粒，并且不足以将生产提高到更 大量的染色体外核酸序列，即数千克至数吨。 专利申请EP  811055-B1、WO  99/37750和WO  00/05358描述了细胞裂解的方法和设 4 CN 111601889 A 说　明　书 2/16 页 备，其中将细胞与裂解溶液混合到具有足够直径长度并且优选圆形轮廓的小管件或静态混 合器中以获得这种裂解。 此外，在科学文献中描述了各种手段和步骤，以提高从细胞中提取的核酸的纯化 步骤的收率和效率。例如，专利US  5,096,818-B2披露了一种用于从细胞培养基中分离和纯 化核酸序列的方法，所述方法通过在不混合的情况下将裂解/变性剂和脱蛋白和/或中和剂 添加到重悬浮的细胞中，然后进行第一离心，使细胞碎片部分地沉淀，然后混合溶液以最终 完成裂解，然后进行第二离心，使细胞碎片完全沉淀。由于设备的限制，这种离心方法不适 合大规模工艺，导致生产收率不足。 欧洲专利EP  1  593  741-B1披露了生产含有一种或多种染色体外核酸序列的微生 物澄清裂解物的方法，所述方法通过将含有这些核酸序列的微生物悬浮液与反应缓冲液混 合，使混合物反应足够的时间以破坏微生物，将获得的混合物转移到包含中和缓冲液的容 器中以与待去除的污染物形成沉淀，并通过使气体通过容器底部分散而产生气泡以使沉淀 与裂解物(未沉淀的液体级分)分离。由于中和缓冲液不是连续添加的而是从裂解开始所需 要的总量就存在于悬浮液中，其在悬浮液中的浓度(因此悬浮液中可用的中和能力)随工艺 时间而变化，这导致工艺的可变性。另一个限制是，由于系统设计和批处理，不能容易地处 理非常大量的细胞。 专利US  8,158,348-B2；US  7,771,945-B2和US  7,314,746-B2披露了用于纯化DNA 质粒的方法和设备，其包括在细胞裂解步骤期间添加带有裂解介质的气体微泡，以提高目 的DNA质粒的回收。如这些美国专利的图5所示，鉴于分离后得到的最终液相体积，在裂解期 间不同量的注入气体的相对效果不是很有效，并且表明在处理的非常长的延迟(约16小时) 之后，回收的液体可溶级分的量仅为60％或更低。 发明目的 本发明涉及一种方法和设备，其没有呈现并解决了现有技术的方法和设备的缺 点。 本发明的一个优选目的是获得廉价、稳健和简化的方法和设备，用于特别是通过 改善的分离(倾析或澄清)步骤，有效和快速地从其杂质(或污染物)纯化一种或多种目的染 色体外核酸序列，特别是纯化大量的一种或多种目的染色体外核酸序列，特别是以大于现 有技术的方法和设备所获得的一个或多个量的量。 本发明的另一个目的是获得一种新的方法和设备，其允许完全或几乎完全回收含 有一种或多种目的染色体外核酸序列的液体澄清细胞裂解物，并且其中所获得的液体澄清 细胞裂解物包含较少或不被从沉淀物层获得的杂质(或污染物)污染的一种或多种染色体 外核酸序列。
技术实现要素：
在根据本发明的方法和设备中，通过术语“大约”或“大约”，其优选地是指高于或 低于所述值的加或减20％或10％的值(例如，约5分钟是指从4分钟30秒到5分钟30秒的每一 个值)。 本发明通过连续的生产和/或纯化步骤获得一种或多种目的染色体外核酸序列， 优选DNA质粒(优选具有小于30,000个碱基(或碱基对)的大小)的方法包括以下步骤或由以 5 CN 111601889 A 说　明　书 3/16 页 下步骤组成： a)任选地培养产生(参与合成)一种或多种目的序列的宿主细胞(优选重组宿主细 胞)，并收获这些含有目的序列的细胞，优选含有该目的DNA质粒的细胞； b)在细胞裂解单元中崩解这些细胞，优选通过将细胞连续引入通道中，该连续引 入是在流动装置中连续供给细胞，其中优选通过将(碱性)裂解介质添加到细胞裂解单元中 的细胞来获得该崩解； c)在中和单元中借助中和溶液中和所述裂解的细胞(包括一种或多种目的染色体 外核酸序列)，该中和溶液优选地被添加有并且优选地由乙酸/乙酸盐组合物构成，以产生 包含可溶性级分(包含一种或多种目的染色体外核酸序列，特别是目的DNA质粒)和沉淀物 的细胞裂解物混合物，该沉淀物包含一种或多种目的序列的污染物和/或杂质； d)任选地(进一步)通过混合所述细胞裂解物混合物(由步骤c)获得)沉淀一种或 多种目的染色体外核酸序列的这些污染物和/或杂质，特别是目的DNA质粒的这些污染物 和/或杂质，以有利地纯化该混合物。该(进一步)沉淀通过包括在浓度为(约)2M和(约)6M之 间的溶液中以连续方式向优选地崩解的细胞裂解物混合物中添加一种或多种优选水合的 盐来进行，其中所述一种或多种盐选自由以下组成的组(包括)：(优选水合的)CaCl2，(优选 水合的)MgCl2，(优选水合的)ZnCl2，(优选水合的)SrCl2，(优选水合的)BaCl2或(较不优选 的)其他的一种或多种(优选水合的)盐，例如LiCl、乙酸铵、硫酸铵、硫酸钠或硫酸镁，其中 优选的盐是(优选水合的)CaCl2和/或(优选水合的)MgCl2； e)在分离(倾析或澄清)罐中收集由步骤c)或由步骤d)获得的所述细胞裂解物混 合物； f)使包含在所述细胞裂解物混合物中的所述可溶性级分(包含一种或多种目的染 色体外核酸序列，特别是目的DNA质粒)与所述沉淀(包含污染物或杂质)分离(使所述可溶 性级分倾析或澄清)；该分离步骤优选具有包括在(约)5分钟和数小时之间的持续时间；更 优选包括在(约)15分钟和(约)2小时之间。该分离步骤有利地在称为分离(倾析或澄清)罐 的罐或储器中进行； g)优选通过泵出从所述分离罐回收所述分离的可溶性级分，所述可溶性级分包括 在来自该分离罐的该细胞裂解物混合物中存在的一种或多种目的染色体外核酸序列，特别 是目的DNA质粒； h)任选地在一个或多个具有包括在(约)0.2μm和(约)20μm之间的孔径的过滤器上 对所获得的可溶性级分进行一个或多个进一步的分离步骤、倾析步骤和/或过滤步骤，优选 随后在(约)30kDa膜至(约)500kDa膜上，优选在(约)50和(约)250kDa之间，更优选在(约)50 和(约)100kDa之间的超滤步骤，以获得包含所述一种或多种目的染色体外核酸序列，优选 目的DNA质粒的第一膜滞留物； i)任选地对来自步骤g)的可溶性级分或来自步骤h)的第一膜滞留物进行(精制步 骤)色谱，所述可溶性级分或一膜滞留物包含回收的一种或多种染色体外核酸序列，优选目 的DNA质粒，该色谱步骤任选地包括洗涤子步骤以获得色谱洗脱液； j)任选地在(约)3kDa至(约)100kDa膜上对来自步骤i)的色谱洗脱液进行超滤，并 收集获得的第二滞留物；以及任选地在(约)0.2μm膜上对所述第二滞留物进行(甚至进一 步)过滤，以在滤液中回收和收集从其杂质(或污染物)纯化的所述一种或多种目的染色体 6 CN 111601889 A 说　明　书 4/16 页 外核酸序列，优选所述目的DNA质粒。 术语“可溶性级分”(例如细胞裂解物的可溶性级分)是指通过本发明的方法和设 备回收的细胞裂解物混合物的液体和可溶性级分，其中该可溶性级分可以从沉淀物层分 离、倾析或澄清，所述沉淀物层可以包括漂浮在液体裂解物混合物中和上方的絮体，并且其 中该沉淀物层可以包括或含有待回收和纯化的一种或多种目的染色体外核酸序列的杂质 (或污染物)。在下文中，这种分离、倾析和/或澄清后得到的可溶性级分也称为“澄清相”。分 离步骤、即倾析步骤和/或澄清步骤，优选基于经典的连续工艺步骤，但也可以根据分批工 艺进行，而不是添加连续供给的进料。 术语“一种或多种染色体外核酸序列”，其是指超过50个碱基(碱基对)的任何核苷 酸序列。更优选地，所述染色体外核酸序列选自包含以下的组(由以下组成的组)：DNA质粒、 粘粒、BACS、YAC、MAC、微型质粒和微型环，优选(DNA)质粒，例如大小小于30000碱基对的 (DNA)质粒。 根据本发明，分离步骤f)包括至少一次将包含溶解气体的液体水性介质注入到包 含在分离(倾析或澄清)罐中的细胞裂解物混合物中。该注入在细胞裂解期间或裂解的细胞 的中和期间都不进行。所述液体水性介质可以通过在升高的压力下将气体溶解在液体水性 介质中来获得。出人意料地发现，将包含足够量的溶解气体的液体水性介质注入到细胞裂 解物混合物中改善了包含目的染色体外核酸序列的可溶性级分和沉淀物之间的分离(倾析 或澄清)步骤的收率，该分离步骤是在上述分离罐中进行的。所述改善的分离收率显著改善 了回收的可溶性级分的量，特别是回收的一种或多种目的核酸序列的量。在不存在所述注 入的情况下，沉淀物层保持浸没在可溶性级分中，截留了显著体积的该可溶性级分，其在回 收步骤g)期间损失。由于沉淀物颗粒之间的空间充满气体而不是(液体)可溶性级分，因此 所述注入实现了沉淀物层在可溶性级分之上的漂浮。 有利地，通过将气体(优选选自由空气、CO2、氧、臭氧、氮或其混合物组成的组的气 体)溶解到液体水性介质(例如水)中来获得包含足够量的溶解气体的液体水性介质。优选 地，通过鼓泡手段将该气体溶解在液体水性介质中。有利地，该溶解在高于大气压的压力下 进行，例如至少1表压(barg)，优选在(约)2表压和(约)50表压之间，优选在(约)3表压和 (约)25表压之间，优选在(约)4表压和(约)15表压之间的压力。通过这样做，可以获得液体 水性介质中较高浓度的溶解气体(亨利定律(Henry’s  law))。液体水性介质中的溶解气体 的浓度有利地接近饱和浓度，例如液体水性介质中的溶解气体的浓度达到指示压力下饱和 浓度的至少50％，有利地达到饱和浓度的至少60％、至少70％、至少80％、至少90％。有利 地，液体水性介质被溶解气体饱和。液体水性介质优选在高于(约)2表压的压力(优选包括 在(约)2表压和(约)50表压之间，更优选在(约)3表压和(约)25表压之间)下在气体方面饱 和。有利地，注入细胞裂解物混合物中的包含溶解气体的液体水性介质的体积量与被处理 的细胞裂解物混合物的体积(例如，罐中细胞裂解物混合物的总体积)相比，包括在(约) 0.2％v/v和(约)25％v/v之间，优选在(约)0.5％v/v和(约)15％之间，更优选在(约)1％v/v 和(约)10％之间，注入一次或多次。 优选地，在将包含溶解气体的液体水性介质注入到细胞裂解物混合物中之前，将 包含溶解气体的液体水性介质制备到储器或罐中。 有利地，包含溶解气体的液体水性介质在高于大气压的压力下注入到细胞裂解物 7 CN 111601889 A 说　明　书 5/16 页 混合物中，所述细胞裂解物混合物有利地在大约大气压附的压力下注入。有利地，这种液体 水性介质在与气体溶解的压力基本相同的压力下注入。优选的注入压力为至少(约)2表压， 优选在(约)3表压和(约)50表压之间，优选在(约)4表压和(约)15表压之间。有利地将液体 水性介质间歇地注入到细胞裂解物混合物中。这意味着两个连续注入周期之间的静态休止 周期有利地至少具有持续时间，所述持续时间等于在该静态休止周期之前和之后的注入周 期的持续时间。例如，进行注入的时间周期(注入周期)在(约)5秒和(约)10分钟之间，更优 选为在(约)5秒和(约)5分钟之间。两个连续注入周期之间的静态休止周期有利地在(约)5 秒和(约)10分钟之间，有利地至少等于注入周期的持续时间。 根据本发明，在存在于分离(倾析或澄清)罐中的细胞裂解物混合物中注入包含溶 解气体的液体水性介质可以是单次注入或间歇注入的一系列一次或多次连续注入。包含溶 解气体的液体水性介质的间歇注入，随后是静态休止期，这样允许在静态休止时间期间沉 淀物上升和可溶性级分澄清。同时，气泡取代了截留在沉淀物层的絮体内的可溶性级分，导 致沉淀物层漂浮在可溶性级分之上，而不是沉淀物浸没在可溶性级分中。结果，可回收更大 体积的可溶性级分。 用于本发明的方法和整合在设备中的宿主细胞是原核细胞，例如细菌，特别是大 肠杆菌细胞。 优选地，在根据本发明的方法中，步骤b)包括将细胞与添加的(碱性)裂解介质混 合。优选地，混合在静态混合器中进行，该静态混合器优选包括至少6个混合元件，优选在12 个混合元件和24个混合元件之间，更优选18个混合元件。优选地，混合线速度等于或高于 150cm/min；优选地包括在(约)150cm/min和(约)2000cm/min之间，更优选地包括在(约) 500cm/min和(约)1500cm/min之间。 优选地，在根据本发明的方法中，步骤c)包括将细胞裂解物混合物与中和溶液混 合。优选地，混合在静态混合器中进行，该静态混合器优选包括至少4个混合元件，优选在6 个混合元件和16个混合元件之间，更优选10个混合元件。优选地，混合线速度等于或高于 100cm/min，优选地包括在(约)100cm/min和(约)2000cm/min之间，更优选地包括在(约) 340cm/min和(约)1025cm/min之间。 优选地，在根据本发明的方法中，步骤d)包括将由步骤c)获得的细胞裂解物混合 物与一种或多种盐混合。优选地，混合在静态混合器中进行，该静态混合器优选包括至少2 个混合元件，优选在2个混合元件和18个混合元件之间，更优选4个混合元件。优选地，混合 线速度等于或高于100cm/min，优选地包括在(约)100cm/min和(约)1500cm/min之间，更优 选地在(约)400cm/min和(约)1200cm/min之间。 在本发明的方法和设备中，细胞优选保持在悬浮液中，并通过添加(碱性)裂解介 质而崩解。 根据本发明，用于崩解细胞的裂解介质可以是pH值包括在(约)11和(约)12.5之 间，优选pH值包括在(约)12和(约)12.5之间的碱性溶液。裂解介质可包含足够量的一种或 多种洗涤剂。 在根据本发明的方法和设备中，(碱性)裂解介质可以通过将至少足够量的NaOH与 足够量的至少一种洗涤剂混合来获得。在根据本发明的方法和设备中，本领域技术人员根 据需要裂解的细胞的一个或多个量来选择足够量的NaOH和洗涤剂。更优选地，混合可以通 8 CN 111601889 A 说　明　书 6/16 页 过将足够量的每种反应性产物溶液(NaOH和至少一种洗涤剂)引入静态混合器中并在将该 (碱性)裂解介质添加到细胞中之前混合所述组分以形成(碱性)裂解介质来进行。所述静态 混合器优选包括至少至少6个混合元件，优选在12个混合元件和24个混合元件之间，更优选 18个混合元件。优选地，混合线速度等于或高于100cm/min。 所述(碱性)裂解介质可包含(约)0.01％和(约)5％之间，优选(约)0.1％和(约) 3％之间，更优选(约)0.5％和(约)3％(w∶v)之间的一种或多种洗涤剂。优选地，洗涤剂选自 由以下组成的组：十二烷基硫酸钠(SDS)、脱氧胆酸钠、 X-100、 X-114、 P-40、辛基-葡萄糖苷、 35、 56、 20、CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙 基)二甲基铵基]-1-丙磺酸)或其混合物。 有利地，在该工艺的崩解步骤(步骤b))中，使细胞与(碱性)裂解介质混悬。优选 地，细胞和(碱性)裂解介质之间的最佳接触时间包括在(约)15秒和(约)15分钟之间，优选 在(约)0.5分钟和(约)5分钟之间，更优选(约)2分钟。 优选地，中和溶液是pH值包括在(约)5.0和(约)6.0之间，优选为(约)5.5的乙酸/ 乙酸盐溶液。优选地，中和溶液具有约3M(mol/L)乙酸盐和约15％(v∶v)乙酸的浓度。 优选地，将中和溶液，特别是上述乙酸/乙酸盐溶液从室温冷却到包括在(约)2℃ 和(约)8℃之间的温度，优选为(约)4℃。该步骤通过本领域技术人员公知的方法获得，优选 通过将缓冲液储存在冷室中足够长的时间，或者通过使用连接到围绕携带中和溶液的管件 元件的热交换器的足够的低温恒温器。 有利地，包含目的染色体外核酸序列的裂解的细胞与中和溶液的最佳接触时间包 括在(约)15秒和(约)5之间，优选(约)30秒和(约)2分钟之间，更优选(约)1分钟。 有利地，中和的裂解物和沉淀溶液的最佳接触时间多于1分钟，该时间段适合于获 得所需的沉淀。 有利地，根据本发明的方法的步骤f)的分离(倾析或澄清)的最佳时间包括在(约) 5分钟和数小时之间，优选在(约)15分钟和(约)2小时之间。 本发明的方法可任选地包括步骤a)和步骤b)之间的预备步骤，所述预备步骤包括 以下(或由以下组成)：向包含一种或多种目的染色体外核酸序列的(整个)细胞悬浮液中添 加足够量的RNA酶。所添加的RNA酶的量由本领域技术人员根据待纯化的一种或多种目的序 列的类型和量来定义，并且该RNA酶处理对于具有小于3000个碱基(碱基对)的大小的质粒 DNA的纯化特别有用。 根据本发明的方法的优选添加的水合盐是CaCl2.5H2O，其以包括在(约)2M和(约) 6M之间的浓度添加，优选以约5M的浓度添加。 在本发明的方法或设备中，通过入口/出口、泵或阀的打开和关闭来执行连续工艺 或连续添加步骤，并且这些泵的输出有利地通过称量本发明的进料溶液的罐、储器、小瓶或 接收器或通过将流量计集成到连接这些罐的一个或多个管件来控制。 在本发明的方法和设备中，过滤步骤是在深度过滤器或表面过滤器上完成。 任选存在于本发明方法中的色谱步骤(步骤i))包括以下(或由以下组成)：一个或 多个本领域技术人员公知的经典纯化步骤。 任选地，在该洗涤子步骤之后和在洗脱子步骤之前，可以用补充有一种或多种中 性洗涤剂的相同溶液进行另一洗涤子步骤。优选地，该中性洗涤剂选自由以下组成的组： 9 CN 111601889 A 说　明　书 7/16 页 X-100、 X-114、 20、 P-40、辛基葡萄糖苷、 35、 56或其混合物。优选地，所述中性洗涤剂以(约)0.1％至(约)1％存在于溶液中。在该 任选的第二洗涤子步骤之后可以接着进一步的洗涤子步骤，并且该进一步的子步骤优选地 在不存在任何中性洗涤剂的情况下进行。 本发明的方法和设备允许生产和纯化大量的一种或多种目的染色体外核酸序列， 从少于一克到数百克、数千克、直至数吨。然而，在根据本发明的工艺中，任选的沉淀步骤 (步骤d))可以在步骤h)至j)之前或之后被其他纯化步骤取代，以获得所需纯度的一种或多 种目的染色体外核酸序列。 本发明还涉及用于执行根据本发明的方法的设备。本发明的设备包括以下(或由 以下组成)：用于获得连续流的手段，例如圆管或管件元件，其可能连接到合适的罐、一个或 多个储器、小瓶或一个或多个接收器并且具有入口或开口手段和出口或离口手段。 有利地，设备的一个或多个管件符合用于人类医学的要求，特别是符合药品质量 的要求，并且优选地是不可浸出的并且通过“Y型连接”连接。 本发明的设备包括或优选地由以下组成： -制备单元，其包括一个或多个包含(碱性)裂解介质化合物的罐，所述一个或多个 罐包括一个或多个出口，所述一个或多个罐优选地经由一个或多个管件流体地连接到细胞 裂解单元的入口，该入口优选不同于用于将细胞从细胞悬浮液罐引入到细胞裂解单元的入 口， -细胞裂解单元，所述细胞裂解单元包括细胞悬浮液罐，所述细胞悬浮液罐包含具 有一种或多种目的染色体外核酸序列的细胞，所述细胞裂解单元包括至少一个入口，所述 至少一个入口优选地经由一个或多个管件流体地连接到所述细胞悬浮液罐和所述制备单 元的一个或多个出口，所述细胞裂解单元还包括至少一个出口，所述至少一个出口优选地 经由一个或多个管件流体地连接到中和单元的一个或多个入口， -中和单元，所述中和单元包括中和介质罐、至少一个入口和至少一个出口或离 口，所述入口优选地经由一个或多个管件流体地连接到所述中和介质罐并连接到所述细胞 裂解单元的一个或多个出口或一个或多个离口，并且所述一个或多个出口流体地连接到分 离(倾析或澄清)单元的一个或多个入口或连接到任选的沉淀单元. -任选地，沉淀单元，所述沉淀单元包括至少一个入口、至少一个出口或离口和包 含盐溶液的罐，所述一个或多个入口优选地经由一个或多个管件流体地连接到包含盐溶液 的罐并连接到所述中和单元的一个或多个出口或一个或多个离口，并且所述出口优选地经 由一个或多个管件流体地连接到分离单元的入口， -分离(倾析或澄清)单元，所述分离(倾析或澄清)单元包括用于细胞裂解物混合 物的分离(倾析或澄清)罐，所述分离(倾析或澄清)罐具有至少一个入口和至少一个出口， 所述一个或多个入口流体地连接到所述中和单元的出口，或视情况而定连接到所述沉淀单 元的出口，所述分离罐优选包括用于从所述细胞裂解物混合物中回收包含一种或多种目的 染色体外核酸序列的可溶性级分的手段，以及 -注入单元，特别是漂浮单元，其包括用于在高于大气压的压力下将气体溶解在液 体水性介质中的手段和用于将包含溶解气体的液体水性介质注入所述分离罐中的手段。 优选地，液体水性介质是水，并且该液体水性介质有利地被溶解气体饱和，该气体 10 CN 111601889 A 说　明　书 8/16 页 优选地是空气、CO2、N2、O2、臭氧或其混合物。更优选地，用于将包含溶解气体的液体水性介 质注入分离罐中的手段包括至少一个具有离口的注入管道，优选朝向分离(倾析或澄清)罐 的底表面定向的离口喷嘴。优选地，离口，优选地是离口喷嘴设置在分离罐中从罐底表面测 量的高度处，所述高度包括在罐总高度的(约)1/6和(约)5/6之间，更优选地包括在罐总高 度的(约)1/4和(约)2/4之间。这种位置有利地避免了已经被分离的沉淀污染物和杂质的再 悬浮。 优选地，用于将气体溶解在液体水性介质中的手段包括液体水性介质罐，优选水 罐和鼓泡装置。该鼓泡装置优选地包括连接到气体容器的管件(tubing)，例如管道(pipe)， 并且优选地，流量计也连接到管件，并且泵流体地连接在管件和该气体容器之间。所述鼓泡 装置提供来自所述气体容器的气体到所述液体水性介质中的受控鼓泡，以获得包含溶解气 体的液体水性介质。优选地，该鼓泡装置构造成在高于或等于1表压，优选在2表压和50表压 之间，优选在3表压和25表压之间的压力下并且有利地以与待处理的细胞裂解物混合物的 体积相比包括在(约)5％和(约)20％v/v之间的体积将气体注入液体水性介质罐中。 在根据本发明的设备中，液体水性介质注入管道内径与其离口喷嘴直径之间的比 率可以是(约)1或接近1的值，但优选地高于(约)3，更优选地高于(约)5，但优选地低于50。 这种特定的注入管道和喷嘴组合确保在注入包含溶解气体的液体水性介质期间，注入管道 内部的压力不会下降到初始值的90％以下。这防止了注入管道内而不是细胞裂解物混合物 内的早期脱气，并改善了纯化的质量和数量。在将包含溶解气体的液体水性介质注入到保 持在大气压下的分离罐中之后，液体水性介质失去其溶解气体，这在细胞裂解物混合物中 产生平均直径小于或等于1.5mm，优选小于或等于1mm或甚至小于或等于0.5mm的(雾状) (微)气泡。 在根据本发明的设备中，注入单元的注入管道与入口分离，所述入口通向分离单 元或罐与中和单元或沉淀单元的一个或多个出口之间的管件。因此，包含溶解气体的含水 液体介质经由与细胞裂解物混合物的入口相比单独的入口或管件被注入分离罐中。 根据本发明的设备还可以包括公知的混合元件，例如产生文丘里效应的手段(即， 如在本文中通过引用描述的国际专利申请WO  2010/0136503中所述)，任选地与用于有效地 混合流体的一个或多个静态混合器组合。 在根据本发明的设备中，所述制备单元包括包含裂解介质的单个罐或包含其不同 组分的两个或更多个分离罐，所述一个或多个罐通过第一(组)管件，经由一个(或若干个) 泵、优选包括至少6个混合元件的第一静态混合器连接到细胞裂解单元，该第一静态混合器 具有入口和出口或离口，其中该入口连接到来自(碱性)裂解介质或其分离组分的一个或多 个泵的一个或多个管件，并且其中所述出口或离口经由第二管件或更多个管件连接到细胞 裂解单元。选择第一静态混合器的尺寸(即，引入的混合元件的数量，以及该第一静态混合 器的直径和长度以及一个或多个泵的一个或多个输出，以允许引入第一静态混合器的元件 的优选高于100cm/min的混合线速度。 根据本发明的设备还可以包括由第二静态混合器(优选为包括12和24个之间的混 合元件，优选18个混合元件的第二静态混合器)制成的细胞裂解单元，该第二静态混合器具 有入口和出口或离口，所述入口通过一个或多个第二管件连接到制备单元的出口，并且经 由第三管件或更多个管件和泵连接到包含细胞悬浮液的细胞悬浮液槽的出口，并且所述第 11 CN 111601889 A 说　明　书 9/16 页 二静态混合器的出口或离口连接到第四管件或更多个管件。选择第二静态混合器和泵输出 的尺寸以允许引入第二静态混合器的溶液的包括在(约)1000cm/min和(约)1500cm/min之 间的混合线速度。 根据本发明的设备还可以包括第三静态混合器，优选为包括6个混合元件和16个 混合元件之间，优选10个混合元件的第三静态混合器，该第三静态混合器具有入口和出口 或离口，所述入口连接到来自细胞裂解单元的出口的第四管件，并且经由第五管件和泵连 接到中和介质罐，所述第三静态混合器的出口或离口连接到第六管件或更多个管件。选择 第三静态混合器和泵输出的尺寸以允许引入第三静态混合器的溶液的优选包括在(约) 340cm/min和(约)1025cm/min之间的混合线速度。 根据本发明的设备还可以包括第四静态混合器，优选为包括4和18个之间的混合 元件的第四静态混合器，该第四静态混合器具有入口和出口或离口，所述入口连接到来自 中和单元的第六管件并经由第七管件和泵连接到包含(二价)盐溶液的罐，并且其中所述出 口或离口经由第八管件连接到分离(或倾析)罐。选择第四静态混合器和泵输出的尺寸以允 许引入第四静态混合器的溶液的优选包括在(约)400cm/min和(约)1200cm/min之间的混合 线速度。 如图中所示的泵的位置也改善了处理效率，因为如图中所示的泵的相应位置可以 有利地允许流体在一个或多个管件中的推动(流动)，而不是在这一个或多个管件中存在的 流体的拉动，这意味着处理的产物不会受到发生在泵头部中的剪切力的冲击，所述剪切力 会损坏产物并降低产物的质量。 优选地，本发明的设备还包括称重存在于不同罐、储器、袋或接收器中的所谓进料 溶液(即中和溶液，裂解溶液......)的手段和/或包括一个或多个流量计，用于控制不同介 质或细胞或细胞级分在一个或多个管件中的引入。这意味着本发明的方法可以包括连续执 行的步骤和以一批接一批的顺序执行的步骤。优选地，中和步骤以一批接一批的顺序进行。 本发明的方法或设备的替代方案涉及所述的方法和设备，其包括所述的分离步骤 和分离单元，而不注入包含溶解气体的液态水性介质并且没有用来注入包含溶解气体的液 态水性介质的注入单元，但是其将与上述技术特征一起包括一个或多个上述静态混合器和 一个或多个或所有混合步骤，所述混合步骤包括使用一个或多个静态混合器。 在作为非限制性优选实施例呈现的以下详细描述中，参考附图描述了根据本发明 的方法和设备。 附图简要说明 图1示意性地表示本发明的设备。 图2和图3表示根据本发明的设备的分离单元的不同构造。 图4表示连接到根据本发明的设备的分离单元的注入单元。 图5表示连接到根据本发明的设备的分离单元的过滤单元。 图6表示用现有技术的方法和设备获得的分离结果。 图7表示用根据本发明的方法和设备获得的分离结果。