技术摘要：
本发明公开了高特异性生产麦芽三糖的麦芽三糖淀粉酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。本发明对来源于Thermobifidafusca NTU22的TfAmyA进行改造，对TfAmyA进行了一项截短和，并在此基础上对47位的亮氨酸，101位的甘氨酸，103位的甘氨酸，153位的甘氨酸，进行定点突变  全部
背景技术：
麦芽三糖(Maltotriose，α-D-Glc-(1→4)-α-D-Glc-(1→4)-D-Glc，简称G3)属于 一种功能性低聚糖，由三个葡萄糖单元经α-(1→4)糖苷键连接而成。其分子式为C18H32O16， 相对分子质量为504.438，密度为1.8±0.1g·cm-3，熔点为132-135℃，常温下为白色固体粉 末。G3具有多种优异的物理化学和生理学性质，其是可消化的营养甜味品，具有非致龋、低 甜度、低粘度、低热量、抗结晶和低渗透压的特点，可用于改变冷冻食品的冷冻温度，并控制 热加工食品中美拉德反应引起的褐变量。G3提供高保湿能力，防止过度干燥和低水分活度， 便于控制微生物污染，具有强稳定性，是淀粉回生的强抑制剂。G3在食品、饮料、化工、医药 等行业应用广泛。市场上的G3产品大都来自日本。日本食品化工公司的“富士低聚G3”、日本 玉米淀粉公司的“新型麦芽低聚糖”、日本三菱化学食品株式会社的“线性寡糖origo”、群荣 化学工业株式会社的“puretose”，主要成分都为G3。 麦芽三糖淀粉酶(EC  3.2.1.116，maltotriose  formingα-amylase，简称AmyA)由 基因tfa编码，是一种具有形成麦芽三糖能力的α-淀粉酶。AmyA以淀粉或糊精为底物，通过 内切或外切作用水解糖链中的α-(1→4)糖苷键，产生麦芽三糖及少量副产物。该种酶的发 现为G3的制备提供了新思路。 目前G3的制备工艺分为化学法和酶法两种。化学法以普鲁兰多糖为起始原料，通 过乙酰解、脱乙酰基两个步骤即可制备G3。在两步反应中，需要用到浓硫酸、石油醚、甲醇和 甲醇钠等高危试剂，虽然步骤简短、操作简单，但是底物成本高、环境危害大。酶法作为一种 绿色节能高效安全的替代方法可显著降低生产成本、提高产品品质、满足大众消费需求，是 推动麦芽三糖产业可持续发展的原动力。因为所用酶的不同，酶法制备又分为两种。酶法制 备因为所用酶的不同又分为两种。第一种酶法是通过普鲁兰酶水解普鲁兰多糖，可连续化、 自动化制备医药级的G3(纯度99％以上)，但是这种方法存在着底物成本高的问题。与普鲁 兰多糖相比，淀粉是一种丰富的天然可再生资源，是许多重要粮食作物(如大米、玉米、小 麦、水稻、马铃薯和木薯)的种子、根或块茎中的主要储存碳水化合物，更加经济实惠。麦芽 糊精是淀粉糊化后添加α-淀粉酶的液化产物。因α-淀粉酶的作用，麦芽糊精的聚合度低，溶 解度大，有利于其他酶进行作用。第二种方法就是以AmyA作为主要用酶，以淀粉或麦芽糊精 等廉价原料作为底物生产G3。通常而言，在反应体系中还需添加普鲁兰酶进行脱支作用。但 是目前AmyA存在着副产物葡萄糖和麦芽糖多的问题，增加了分离纯化的难度和成本。因此， 通过分子改造等手段获得高G3特异性的AmyA，可提高G3产量，简化生产工艺，降低生产成 本。 3 CN 111718921 A 说　明　书 2/7 页
技术实现要素：
为了解决目前存在的问题，本发明提供了麦芽三糖淀粉酶突变体。本发明所使用 的来源于Thermobifidafusca  NTU22的麦芽三糖淀粉酶TfAmyA在酶转化反应初期就产生了 G1-G3的产物，属于一种内切酶，这降低了TfAmyA生产G3时对底物的得率，同时也增加了分 离纯化的难度。因此，进一步提高该酶的产G3能力与特异性有利于G3生产成本的降低与规 模化生产。 本发明提供了一种高特异性生产麦芽三糖的麦芽三糖淀粉酶突变体，是相对于亲 本TfAmyA在羧基末端截短，或截短的突变体氨基酸的第47位、第101位、第103位、第153位任 一位点的氨基酸发生突变。 在本发明的一种实施方式中，所述亲本TfAmyA的氨基酸序列如SEQ  ID  NO.1所示。 在本发明的一种实施方式中，所述突变体为以下(a)～(e)任一： (a)将亲本的第451-572位氨基酸截去，氨基酸序列如SEQ  ID  NO.4所示； (b)将序列如SEQ  ID  NO.4所示氨基酸的第47位的亮氨酸突变为赖氨酸或精氨酸， 分别将突变体命名为L47K、L47R； (c)将序列如SEQ  ID  NO.4所示氨基酸的第101位的甘氨酸突变为丝氨酸、苏氨酸、 天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、或谷氨酰胺，分别将突变体命名为G101S、G101T、G101D、 G101N、G101E、G101Q； (d)将序列如SEQ  ID  NO.4所示氨基酸的第103位的甘氨酸突变为组氨酸，将突变 体命名为G103H； (e)将序列如SEQ  ID  NO.4所示氨基酸的第153位的甘氨酸突变为丝氨酸、天冬氨 酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺或组氨酸，分别将突变体命名为G153S、G153D、G153N、 G153E、G153Q、G153H。 本发明提供了编码所述突变体的基因。 本发明提供了携带所述基因的重组表达载体，所述表达载体为pET系列、Duet系 列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K系列中的任意一种。 本发明提供了表达所述突变体，或携带所述基因的微生物细胞。 在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞为原核细胞或真核细胞。 本发明提供了一种提高麦芽三糖生产特异性的方法，所述方法以糊精为底物，以 所述突变体为催化剂，生产麦芽三糖。 在本发明的一种实施方式中，所述糊精以大米、玉米、小麦、水稻、马铃薯、番薯、葛 根和/或木薯为原料。 本发明还保护所述突变体，或所述基因，或所述重组表达载体，或权利要求6或7所 述微生物细胞，或提高麦芽三糖生产特异性的方法在制备麦芽三糖中的应用。 本发明的有益效果：本发明通过对TfAmyA进行截短突变及定点突变，获得了多种 突变体，麦芽三糖淀粉酶的活力增强；产物中麦芽三糖的比例提高，有利于简化麦芽三糖的 后续纯化工艺与实现规模化生产，并且能显著降低麦芽三糖的生产成本，具备广泛的工业 化应用前景。 4 CN 111718921 A 说　明　书 3/7 页 附图说明 图1为截短前后的SDS-PAGE图；a为野生型，b为截短后的突变体。