技术摘要：
本发明为一种疣孢霉菌新种的分子检测引物及应用，公开一种引起双孢蘑菇湿泡病的疣孢霉菌新种的快速检测方法及其在双孢蘑菇湿泡病早期诊断中的应用。具体公开了一种快速检测和鉴定疣孢霉菌新种的特异引物及检测方法，以样品DNA为模板，通过设计的一对鉴别疣孢霉菌新种的  全部
背景技术：
双孢蘑菇又称白蘑菇，由于其口感好，兼具营养价值和药用价值，是一种重要的食 药用菌。我国是世界上最大的双孢蘑菇生产国，2013年我国的双孢蘑菇产量达到全世界总 产量的54％。随着我国双孢蘑菇栽培面积的增长和栽培方式多样化，病害问题逐步呈现，主 要表现为：病害发生较为普遍，采用传统栽培方式的菇房管理不到位，病害严重发生；部分 常见病害出现了加重趋势。其中由丛梗孢科(Moniliaceae)疣孢霉属(Mycogone)真菌引起 的双孢蘑菇湿泡病已成为危害双孢蘑菇最主要的病害之一。对该病害的防治呈现两个特 点：缺少具有抗病性的双孢蘑菇商业栽培品种；疣孢霉菌与其寄主双孢蘑菇同属真菌，杀菌 剂对两者均有抑制作用，评价杀菌剂药效的同时还需考虑对双孢蘑菇的安全性，迄今登记 用于防治双孢蘑菇湿泡病的杀菌剂较少。因而双孢蘑菇湿泡病的早期检测对预防该病害具 有重要意义。 前期，我们大量研究了全国双孢蘑菇湿泡病的病原菌。结果表明，除菌盖疣孢霉和 红丝疣孢霉外，还有一个新种同样造成我国双孢蘑菇湿泡病，并且该病原菌在我国上海、新 疆等多个双孢蘑菇产区发生为害，我们将其命名为Mycogone  huxienia，这是世界范围内首 次发现。该病原菌对双孢蘑菇的致病力强，造成重大的质量和产量损失。但是，Mycogone  huxienia在形态学上与菌盖疣孢霉、红丝疣孢霉极其相似，造成的病害症状也相似。因此， 利用传统的形态学方法难以区分和辨别疣孢霉属属下菌盖疣孢霉、红丝疣孢霉和Mycogone  huxienia，且工作量大，鉴定成本高，周期长，对经验的依赖程度高，且准确性低。通过形态 学和多基因联合的系统发育分析方法，由于需要对多个基因进行测序，工作量更大，鉴定周 期更长，实用性也较差，影响病原菌的诊断速度。 因此，发明一种快速准确的检测和鉴定方法尤为重要，不仅可有效快速地从引起 双孢蘑菇湿泡病的各病原菌中检测和鉴定出Mycogone  huxienia，而且这将对疣孢霉菌的 分类、群体多样性及科学防治具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术中根据形态学特征鉴定疣孢霉菌对经验依赖度高， 程序繁琐，准确性低的问题，以及现有分子检测技术以ITS序列设计检测引物，造成因rDNA- ITS序列差异小，难以区分近缘种的技术缺陷，提供了一种基于Tef-1α基因的疣孢霉菌新种 的分子检测引物及应用。利用本发明所述的特异引物及检测方法可实现对疣孢霉菌新种 (Mycogone  huxienia)简便快速、灵敏准确的检测。 3 CN 111549166 A 说　明　书 2/7 页 本发明的目的通过如下技术方案实现： 1.疣孢霉菌新种(Mycogone  huxienia)PCR特异性引物： 通过测定疣孢霉菌新种(Mycogone  huxienia)、疣孢霉属其它种(Mycogone  spp.) 及双孢蘑菇其它病原菌的Tef-1α基因序列，对疣孢霉属不同种间及与双孢蘑菇其它病原菌 间Tef-1α基因进行比对分析，设计筛选出对疣孢霉菌新种(Mycogone  huxienia)具有特异 性扩增作用的一对引物，其核苷酸序列为： T-7-1F:5'-GCGGCTTCCTATAGACCGTC-3' AT-3R:5'-TCCCTTTGCCCTCCCTCGAT-3'。 2.一种疣孢霉菌新种(Mycogone  huxienia)的快速检测方法： S1.提取待测疣孢霉菌的基因组DNA； S2 .利用所述引物T-7-1F:5 '-GCGGCTTCCTATAGACCGTC-3 '、AT-3R:5 '- TCCCTTTGCCCTCCCTCGAT-3'对步骤S1提取的DNA进行PCR扩增； 扩增反应体系为： 扩增反应条件为： 94℃预变性5min，94℃变性30sec，59.6℃退火30sec，72℃延伸45sec，36个循环， 最后72℃下延伸10min。 S3.取步骤S2的PCR扩增产物3.0μL用1.0％琼脂糖凝胶进行电泳分离，如果扩增出 228bp的条带，则所鉴定的疣孢霉为疣孢霉菌新种(Mycogone  huxienia)。 3.上述特异性引物和检测方法在双孢蘑菇湿泡病的早期诊断和病菌监测、鉴定上 的应用。具体为：提取待测的双孢蘑菇的基因组DNA，利用2中所述的方法进行PCR扩增，如果 能特异性扩增出228bp的产物，则可判定所述的双孢蘑菇中存在疣孢霉菌新种(Mycogone  huxienia)，否则所述的双孢蘑菇中不存在疣孢霉菌新种(Mycogone  huxienia)。 较之现有技术而言，本发明的优点在于： 1.特异性强、准确性高：本发明所设计的引物对Mycogone  huxienia具有很强的特 异性，并已经对不同地理来源的Mycogone  huxienia、Mycogone  perniciosa、Mycogone  rosea、双孢蘑菇干泡病菌、红粉病菌、绿霉病菌、软腐病菌及其它土壤习居菌等进行了验 证，只有Mycogone  huxienia及携带该病菌的双孢蘑菇子实体上能特异性地扩增出228bp的 条带，说明本发明的引物具有很强的特异性、准确性。 2.灵敏度高：本发明设计的特异性引物对Mycogone  huxienia的检测灵敏度在DNA 4 CN 111549166 A 说　明　书 3/7 页 水平上可达2×10-2ng/μL。 3.简单快速：本发明既可以对Mycogone  huxienia菌株进行检测也可以直接对田 间双孢蘑菇进行检测，可实现不用分离病原菌就可以进行快速准确的鉴定和检测，与传统 的鉴定方法相比，极大缩短了检测时间，简单便捷，省时省工。 4.适用性广、实用性好：本发明既可以对Mycogone  huxienia菌丝体进行检测，也 能对感染Mycogone  huxienia的双孢蘑菇进行检测，可实现田间病害的早期检测和监控。 附图说明 图1为特异引物对T-7-1F/AT-3R对疣孢霉菌新种的特异性检测的电泳图：其中泳 道M为5kb  DNA  marker，泳道c1–c2为Mycogone  huxienia菌株，泳道c3–c4为Mycogone  perniciosa菌株，c5–c6为Mycogone  rosea菌株，c7为阴性对照。 图2为特异引物对T-7-1F/AT-3R对疣孢霉菌新种的特异性验证电泳图：其中泳道M 为5kb  DNA  marker，泳道1–5为Mycogone  huxienia菌株，泳道6–10为Mycogone  perniciosa 菌株，泳道11–15为Mycogone  rosea菌株，泳道16–24分别为：双孢蘑菇(Agaricus  bisporus)、双孢蘑菇绿霉病菌(Trichoderma  harzianum)、双孢蘑菇红粉病菌 (Trichothecium  roseum)、双孢蘑菇干泡病菌(Lecanicillium  fungicola)、双孢蘑菇软腐 病菌(Cladobofryum  dendroides)、香蕉枯萎病菌(Fusarium  oxysporum)、棉花黄萎病菌 (Verticillium  dahliae)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia  solani)、阴性对照。 图3为特异引物对T-7-1F/AT-3R对疣孢霉菌新种扩增灵敏性检测的电泳图。其中 泳道M为5kb  DNA  marker，泳道1–7为2，2×10-1，2×10-2，2×10-3，2×10-4，2×10-5，2×10- 6ng/μL。 图4为特异引物对T-7-1F/AT-3R在双孢蘑菇湿泡病早期诊断的扩增电泳图。其中 泳道M为5kb  DNA  marker，泳道1–7为接种Mycogone  huxienia的双孢蘑菇，泳道8–14为接种 Mycogone  perniciosa的双孢蘑菇，泳道15–21为接种Mycogone  rosea的双孢蘑菇，泳道22 为阴性对照。