技术摘要：
本发明公开了本发明属于疾病动物模型构建方法技术领域，具体涉及一种系统性红斑狼疮的动物模型的构建。本发明利用Crispr/Cas9技术，在小鼠谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)基因2号外显子上游及4号外显子下游插入loxP位点，构建亲代鼠1；亲代鼠2为包含中性粒细胞特异的Cre小鼠 全部
背景技术：
系统性红斑狼疮(SLE)是一种系统性自身免疫疾病，其特征在于炎症因子风暴和 自身抗体IgG的产生。中性粒细胞的数量减少是SLE的共同特征。SLE患者的转录组学显示中 性粒细胞与肾炎的进展有关，此外，中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)与IFNα的产生，狼疮性肾 炎，内皮功能障碍有关。然而，SLE患者的血液中性粒细胞数目减少的原因尚不清楚，中性粒 细胞死亡方式和背后的分子机制仍然没有系统的阐释。 雌性SPF级MRL/lpr小鼠是目前国际上最为常用的SLE模型，1978年由Murphy等人 建立。该鼠由LG/J，AKR/J，C3H、HeDi和C57BL/6J品系小数复杂交配产生，此类小鼠由于Fas 基因缺陷，导致T细胞死亡率降低，自身反应性淋巴细胞不能通过凋亡途径清除，导致淋巴 结肿大，脾大，并产生自身免疫病症状，特征是大量的anti-dsDNA，ANA抗体，和严重的肾小 球肾炎。发病早，无性别差异。 NZB/NZW F1鼠是NZB老鼠和NZW老鼠交配后的第一代老鼠，自发出现狼疮表型，其 亲代任一方均不发生病变。由Helyer在1963年发现。该模型小鼠4-5月开始发病，5-6月出现 明显的肾小球肾炎的症状，10-12月进展为严重的狼疮，因肾衰竭而死。此类小鼠发病症状 与人类相似，性激素对该鼠有明显的影响，雌鼠比雄鼠起病早且严重。特征是高滴度anti- dsDNA，anti-ssDNA抗体，高丙种球蛋白血症。 MRL/lpr鼠模拟的是T细胞凋亡缺陷导致的功能异常，以淋巴、脾脏肿大为特点，这 两种器官含有大量淋巴细胞，因此，该模型主要模拟了适应性免疫系统异常。而先天免疫系 统正常，例如：IFN-alpha不升高。尽管MRL/lpr鼠表现出anti-dsDNA抗体升高，蛋白尿，和低 补体血症，但并不完全符合人类疾病的特点。例如狼疮主要以育龄期女性发病，男女比例为 1:9，而MRL/lpr模型没有表现出性别差异。NZB/NZW F1小鼠，表现狼疮表型的原因不明，且 发病周期长(6个月)，易受环境因素影响，且实验过程不易控制，为研究疾病的发病机制带 来困难。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供一种新的狼疮模型：病因明确，同时能引起先天免 疫和后天免疫系统(T、B淋巴细胞为主)异常，且实验周期短，为系统性红斑狼疮的发病机制 的研究提供新的动物模型。 本发明提供一种新型系统性红斑狼疮的动物模型的构建方法，其包括如下步骤： 1)利用Crispr/Cas9技术，在小鼠谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)基因2号外显子上 游及4号外显子下游插入loxP位点，构建亲代鼠1； 2)亲代鼠2为包含中性粒细胞特异的Cre小鼠； 3 CN 111593075 A 说 明 书 2/7 页 3)将亲代鼠1和亲代鼠2进行杂交，获得所述杂合的GPX4基因和包含所述Cre基因 的小鼠，该小鼠自发出现狼疮表型。 在本发明一个优选的实施方案中，所述构建方法还包括将获得的所述杂合的GPX4 基因和包含所述Cre基因的小鼠再与亲代鼠2进行回交，筛选获得所述杂合的GPX4基因和包 含所述Cre基因的小鼠，该小鼠自发出现狼疮表型。 其中，所述的包含中性粒细胞特异的Cre小鼠为Mrp8Cre小鼠或LysMcre小鼠。 其中，亲代鼠的背景为C57/B6。 其中，亲代鼠1具体构建过程为：以sgRNA-Vector为模板PCR扩增出Gpx4-sgRNA的 DNA片段，然后胶回收作为sgRNA体外转录的模板，再经过sgRNA体外转录与纯化回收； 根据选定的sgRNA，设计打靶载体，包含同源臂及loxp序列，构建完成后，经酶切、 纯化后，与sgRNA、Cas9-mRNA共同显微注射C57小鼠胚胎中，注射后将胚胎移植到代孕受体 小鼠的输卵管内。 本发明动物模型利用Crispr/Cas9技术。亲代鼠的一方为谷胱甘肽过氧化物酶4 (GPX4)基因外显子2-4旁插入loxP位点。GPX4编码谷胱甘肽过氧化物酶家族的成员，其功能 是减少膜脂和脂蛋白中的氢过氧化物，从而保护线粒体功能并抑制细胞铁死亡。杂合和纯 合loxp小鼠是活的和可育的，没有报道的异常。当与Cre重组酶小鼠繁殖时，后代可产生可 诱导的GPX4基因敲除。 亲代鼠的另一方为LysMCre(又称为Lyz2Cre)鼠，该鼠的溶菌酶2基因(Lyz2)有一 个核定位的Cre重组酶，该酶插入了Lyz2的第一个编码ATG中。既消除了内源性Lyz2基因的 功能，又将Cre表达置于内源性Lyz2启动子、增强子元件的控制之下。该小鼠是活的和可育 的，大小正常，没有表现出任何明显的身体或行为异常。这些LysMCre小鼠可用于Cre-loxp 研究骨髓细胞系(粒细胞，单核细胞)和先天免疫应答。 两种鼠的背景均为C57/B6，杂交和回交后，获得GPX4fl/wtLysMCre 小鼠。该小鼠自 发出现狼疮表型。 本发明最终获得的小鼠，天然发病，3-4月份开始出现表型，包括皮损，肾炎，自身 抗体，低补体，高炎症因子，存在性别差异，雌性小鼠发病更重，更符合人类的发病特点。 值得注意的是，本发明获得的小鼠中性粒细胞GPX4降低，与人类狼疮患者中性粒 细胞一致。由于是特定基因在特定细胞的敲低，因此模型发病的病因明确，由天然免疫系统 异常，引发适应性免疫改变，识别自身抗原，最终导致狼疮发病。 附图说明 图1所示为用免疫印迹的方法，检测健康人(HCs)和狼疮患者治疗前(Pre)和治疗 后(Treat)的中性粒细胞GPX4含量的变化，反映的是蛋白水平GPX4的变化。可以看到狼疮患 者GPX4含量明显低于健康人，在治疗后含量上升。 图2所示为用流式细胞术的方法标记中性粒细胞内的GPX4，A图根据荧光值反应中 性粒细胞内GPX4含量的高低，反映了蛋白水平GPX4的变化。可以看出狼疮患者的GPX4含量 明显低于健康人。B图所示为收集A图中12位狼疮患者的临床资料，并根据SLEDAI评分准则 进行打分，将得分与GPX4的荧光值做相关分析。SLEDAI得分越高，提示疾病越严重。可以看 出，疾病越严重，中性粒细胞内的GPX4含量越低。 4 CN 111593075 A 说 明 书 3/7 页 图3所示为用qPCR的方法检测中性粒细胞内的GPX4，反映了GPX4在转录水平的变 化。可以看出狼疮患者中性粒细胞的GPX4转录水平明显低于正常人。 图4所示为Gpx4基因条件性敲除小鼠基因打靶，以及条件性敲除示意图。 图5所示为GPX4fl/wtLysMcre 小鼠杂交过程示意图。 图6A所示为髓系来源的中性粒细胞中条件性敲低GPX4的小鼠(GPX4fl/wtLysMcre ) 和没有敲低GPX4的对照鼠(GPX4fl/fl)，用流式细胞术的方法检测中性粒细胞GPX4含量。图6B 图所示为在外周血中除了中性粒细胞以外其他有核细胞的GPX4含量。可以看出，GPX4只在 GPX4fl/wtLysMcre 小鼠的中性粒细胞中表达下降，表明该模型符合设计要求。 图7所示为髓系来源的中性粒细胞中条件性敲低GPX4的小鼠(GPX4fl/wtLysMcre ) 和没有敲低GPX4的对照鼠(GPX4fl/fl)的中性粒细胞Lipid-ROS含量对比。Lipid-ROS是铁死 亡的标志物，铁死亡发生时Lipid-ROS水平增高。可以看出GPX4fl/wtLysMcre 鼠的Lipid-ROS 水平上升。 图8所示为髓系来源的中性粒细胞中条件性敲低GPX4的小鼠(GPX4fl/wtLysMcre ) 和没有敲低GPX4的对照鼠(GPX4fl/fl)的外周血中性粒细胞比例对比。可以看出，GPX4fl/ wtLysMcre 小鼠的中性粒细胞比例明显降低。 图9所示为髓系来源的中性粒细胞中条件性敲低GPX4的小鼠(GPX4fl/wtLysMcre ) 和没有敲低GPX4的对照鼠(GPX4fl/fl)的皮损对比。GPX4fl/fl小鼠皮毛一直完好(图中为6月 大小)，而GPX4fl/wtLysMcre 小鼠在三月大小时已出现明显皮损，这些小鼠在六月大小时皮 损面积进一步扩大。 图10所示为髓系来源的中性粒细胞中条件性敲低GPX4的小鼠(GPX4fl/wtLysMcre ) 和没有敲低GPX4的对照鼠(GPX4fl/fl)的肾脏免疫复合物沉积的情况。处死4月大小的小鼠， 取其中一个肾脏，按照纵切面切出6微米厚的片子，进行染色，粉色代表IgG，黄色代表IgM， 绿色代表C1q，蓝色代表DNA，Merge代表将所有颜色重叠在一起。可以看出，GPX4fl/wtLysMcre 小鼠明显增加了肾小球IgG、IgM、C1q的沉积。 图11所示为在髓系来源的中性粒细胞中条件性敲低GPX4的小鼠(GPX4fl/wtLysMcre )和没有敲低GPX4的对照鼠(GPX4fl/fl) ,在4月大小时，肾小球的HE染色代表图。GPX4fl/ wtLysMcre 小鼠肾小球内细胞增生，结构紊乱。 图12所示为在髓系来源的中性粒细胞中条件性敲低GPX4的小鼠(GPX4fl/wtLysMcre )和没有敲低GPX4的对照鼠(GPX4fl/fl) ,在4月大小时，尿蛋白的检测。并区分雌鼠和雄鼠。 纵坐标为BCA蛋白定量法在562nm测出的OD值，数值越大代表蛋白含量越多。可以看出， GPX4fl/wtLysMcre 小鼠蛋白尿升高。(GPX4fl/fl:雌鼠＝15只,雄鼠＝4只,GPX4fl/wtLysMCre : 雌鼠＝20只,雄鼠＝11只)。 图13所示为在髓系来源的中性粒细胞中条件性敲低GPX4的小鼠(GPX4fl/wtLysMcre )和没有敲低GPX4的对照鼠(GPX4fl/fl)血浆中抗自身双链DNA抗体(anti-dsDNA)含量的对 比。收集3月大小和6月大小GPX4fl/wtLysMcre 小鼠内眦血，并提取血浆，以6月大小的GPX4fl /fl小鼠作为对照。通过ELISA的方法检测抗自身双链DNA抗体。并区分了雌鼠和雄鼠。可以看 到GPX4fl/wtLysMcre 小鼠抗自身双链DNA抗体不断增加。(GPX4fl/fl:雌鼠＝6,雄鼠＝6, GPX4fl/wtLysMCre :雌鼠(3月/6月)＝16只/29只,雄鼠(3月/6月)＝7只/7只)。 图14所示为在髓系来源的中性粒细胞中条件性敲低GPX4的小鼠(GPX4fl/wtLysMcre 5 CN 111593075 A 说 明 书 4/7 页 )和没有敲低GPX4的对照鼠(GPX4fl/fl)血浆中补体C3(Complement 3)含量的对比。收集3月 大小和6月大小GPX4fl/wtLysMcre 小鼠内眦血，并提取血浆，以6月大小的GPX4fl/fl小鼠作为 对照。通过ELISA的方法检测补体C3，并区分了雌鼠和雄鼠，可以看到GPX4fl/wtLysMcre 小鼠 补体C3不断下降(GPX4fl/fl:雌鼠＝6,雄鼠＝6,GPX4fl/wtLysMCre :雌鼠(3月/6月)＝16只/29 只,雄鼠(3月/6月)＝7只/7只)。 图15所示为在髓系来源的中性粒细胞中条件性敲低GPX4的小鼠(GPX4fl/wtLysMcre )和没有敲低GPX4的对照鼠(GPX4fl/fl)血浆中炎症因子含量的对比。收集3月大小和6月大 小GPX4fl/wtLysMcre 小鼠内眦血，并提取血浆，以6月大小的GPX4fl/fl小鼠作为对照。通过多 因子试剂盒的方法检测炎症因子一型干扰素α(IFN-α)，白介素6(IL-6)，二型干扰素γ (IFN-γ)，白介素10(IL-10)。并区分了雌鼠和雄鼠。可以看到GPX4fl/wtLysMcre 小鼠补体炎 症因子不断增加(GPX4fl/fl:雌鼠＝6,雄鼠＝6,GPX4fl/wtLysMCre :雌鼠(3月/6月)＝16只/29 只,雄鼠(3月/6月)＝7只/7只)。所有散点图的数据通过平均值±SD的方式显示，*p< 0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001,ns p>0.05。
本发明公开了本发明属于疾病动物模型构建方法技术领域，具体涉及一种系统性红斑狼疮的动物模型的构建。本发明利用Crispr/Cas9技术，在小鼠谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)基因2号外显子上游及4号外显子下游插入loxP位点，构建亲代鼠1；亲代鼠2为包含中性粒细胞特异的Cre小鼠 全部
背景技术：
系统性红斑狼疮(SLE)是一种系统性自身免疫疾病，其特征在于炎症因子风暴和 自身抗体IgG的产生。中性粒细胞的数量减少是SLE的共同特征。SLE患者的转录组学显示中 性粒细胞与肾炎的进展有关，此外，中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)与IFNα的产生，狼疮性肾 炎，内皮功能障碍有关。然而，SLE患者的血液中性粒细胞数目减少的原因尚不清楚，中性粒 细胞死亡方式和背后的分子机制仍然没有系统的阐释。 雌性SPF级MRL/lpr小鼠是目前国际上最为常用的SLE模型，1978年由Murphy等人 建立。该鼠由LG/J，AKR/J，C3H、HeDi和C57BL/6J品系小数复杂交配产生，此类小鼠由于Fas 基因缺陷，导致T细胞死亡率降低，自身反应性淋巴细胞不能通过凋亡途径清除，导致淋巴 结肿大，脾大，并产生自身免疫病症状，特征是大量的anti-dsDNA，ANA抗体，和严重的肾小 球肾炎。发病早，无性别差异。 NZB/NZW F1鼠是NZB老鼠和NZW老鼠交配后的第一代老鼠，自发出现狼疮表型，其 亲代任一方均不发生病变。由Helyer在1963年发现。该模型小鼠4-5月开始发病，5-6月出现 明显的肾小球肾炎的症状，10-12月进展为严重的狼疮，因肾衰竭而死。此类小鼠发病症状 与人类相似，性激素对该鼠有明显的影响，雌鼠比雄鼠起病早且严重。特征是高滴度anti- dsDNA，anti-ssDNA抗体，高丙种球蛋白血症。 MRL/lpr鼠模拟的是T细胞凋亡缺陷导致的功能异常，以淋巴、脾脏肿大为特点，这 两种器官含有大量淋巴细胞，因此，该模型主要模拟了适应性免疫系统异常。而先天免疫系 统正常，例如：IFN-alpha不升高。尽管MRL/lpr鼠表现出anti-dsDNA抗体升高，蛋白尿，和低 补体血症，但并不完全符合人类疾病的特点。例如狼疮主要以育龄期女性发病，男女比例为 1:9，而MRL/lpr模型没有表现出性别差异。NZB/NZW F1小鼠，表现狼疮表型的原因不明，且 发病周期长(6个月)，易受环境因素影响，且实验过程不易控制，为研究疾病的发病机制带 来困难。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供一种新的狼疮模型：病因明确，同时能引起先天免 疫和后天免疫系统(T、B淋巴细胞为主)异常，且实验周期短，为系统性红斑狼疮的发病机制 的研究提供新的动物模型。 本发明提供一种新型系统性红斑狼疮的动物模型的构建方法，其包括如下步骤： 1)利用Crispr/Cas9技术，在小鼠谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)基因2号外显子上 游及4号外显子下游插入loxP位点，构建亲代鼠1； 2)亲代鼠2为包含中性粒细胞特异的Cre小鼠； 3 CN 111593075 A 说 明 书 2/7 页 3)将亲代鼠1和亲代鼠2进行杂交，获得所述杂合的GPX4基因和包含所述Cre基因 的小鼠，该小鼠自发出现狼疮表型。 在本发明一个优选的实施方案中，所述构建方法还包括将获得的所述杂合的GPX4 基因和包含所述Cre基因的小鼠再与亲代鼠2进行回交，筛选获得所述杂合的GPX4基因和包 含所述Cre基因的小鼠，该小鼠自发出现狼疮表型。 其中，所述的包含中性粒细胞特异的Cre小鼠为Mrp8Cre小鼠或LysMcre小鼠。 其中，亲代鼠的背景为C57/B6。 其中，亲代鼠1具体构建过程为：以sgRNA-Vector为模板PCR扩增出Gpx4-sgRNA的 DNA片段，然后胶回收作为sgRNA体外转录的模板，再经过sgRNA体外转录与纯化回收； 根据选定的sgRNA，设计打靶载体，包含同源臂及loxp序列，构建完成后，经酶切、 纯化后，与sgRNA、Cas9-mRNA共同显微注射C57小鼠胚胎中，注射后将胚胎移植到代孕受体 小鼠的输卵管内。 本发明动物模型利用Crispr/Cas9技术。亲代鼠的一方为谷胱甘肽过氧化物酶4 (GPX4)基因外显子2-4旁插入loxP位点。GPX4编码谷胱甘肽过氧化物酶家族的成员，其功能 是减少膜脂和脂蛋白中的氢过氧化物，从而保护线粒体功能并抑制细胞铁死亡。杂合和纯 合loxp小鼠是活的和可育的，没有报道的异常。当与Cre重组酶小鼠繁殖时，后代可产生可 诱导的GPX4基因敲除。 亲代鼠的另一方为LysMCre(又称为Lyz2Cre)鼠，该鼠的溶菌酶2基因(Lyz2)有一 个核定位的Cre重组酶，该酶插入了Lyz2的第一个编码ATG中。既消除了内源性Lyz2基因的 功能，又将Cre表达置于内源性Lyz2启动子、增强子元件的控制之下。该小鼠是活的和可育 的，大小正常，没有表现出任何明显的身体或行为异常。这些LysMCre小鼠可用于Cre-loxp 研究骨髓细胞系(粒细胞，单核细胞)和先天免疫应答。 两种鼠的背景均为C57/B6，杂交和回交后，获得GPX4fl/wtLysMCre 小鼠。该小鼠自 发出现狼疮表型。 本发明最终获得的小鼠，天然发病，3-4月份开始出现表型，包括皮损，肾炎，自身 抗体，低补体，高炎症因子，存在性别差异，雌性小鼠发病更重，更符合人类的发病特点。 值得注意的是，本发明获得的小鼠中性粒细胞GPX4降低，与人类狼疮患者中性粒 细胞一致。由于是特定基因在特定细胞的敲低，因此模型发病的病因明确，由天然免疫系统 异常，引发适应性免疫改变，识别自身抗原，最终导致狼疮发病。 附图说明 图1所示为用免疫印迹的方法，检测健康人(HCs)和狼疮患者治疗前(Pre)和治疗 后(Treat)的中性粒细胞GPX4含量的变化，反映的是蛋白水平GPX4的变化。可以看到狼疮患 者GPX4含量明显低于健康人，在治疗后含量上升。 图2所示为用流式细胞术的方法标记中性粒细胞内的GPX4，A图根据荧光值反应中 性粒细胞内GPX4含量的高低，反映了蛋白水平GPX4的变化。可以看出狼疮患者的GPX4含量 明显低于健康人。B图所示为收集A图中12位狼疮患者的临床资料，并根据SLEDAI评分准则 进行打分，将得分与GPX4的荧光值做相关分析。SLEDAI得分越高，提示疾病越严重。可以看 出，疾病越严重，中性粒细胞内的GPX4含量越低。 4 CN 111593075 A 说 明 书 3/7 页 图3所示为用qPCR的方法检测中性粒细胞内的GPX4，反映了GPX4在转录水平的变 化。可以看出狼疮患者中性粒细胞的GPX4转录水平明显低于正常人。 图4所示为Gpx4基因条件性敲除小鼠基因打靶，以及条件性敲除示意图。 图5所示为GPX4fl/wtLysMcre 小鼠杂交过程示意图。 图6A所示为髓系来源的中性粒细胞中条件性敲低GPX4的小鼠(GPX4fl/wtLysMcre ) 和没有敲低GPX4的对照鼠(GPX4fl/fl)，用流式细胞术的方法检测中性粒细胞GPX4含量。图6B 图所示为在外周血中除了中性粒细胞以外其他有核细胞的GPX4含量。可以看出，GPX4只在 GPX4fl/wtLysMcre 小鼠的中性粒细胞中表达下降，表明该模型符合设计要求。 图7所示为髓系来源的中性粒细胞中条件性敲低GPX4的小鼠(GPX4fl/wtLysMcre ) 和没有敲低GPX4的对照鼠(GPX4fl/fl)的中性粒细胞Lipid-ROS含量对比。Lipid-ROS是铁死 亡的标志物，铁死亡发生时Lipid-ROS水平增高。可以看出GPX4fl/wtLysMcre 鼠的Lipid-ROS 水平上升。 图8所示为髓系来源的中性粒细胞中条件性敲低GPX4的小鼠(GPX4fl/wtLysMcre ) 和没有敲低GPX4的对照鼠(GPX4fl/fl)的外周血中性粒细胞比例对比。可以看出，GPX4fl/ wtLysMcre 小鼠的中性粒细胞比例明显降低。 图9所示为髓系来源的中性粒细胞中条件性敲低GPX4的小鼠(GPX4fl/wtLysMcre ) 和没有敲低GPX4的对照鼠(GPX4fl/fl)的皮损对比。GPX4fl/fl小鼠皮毛一直完好(图中为6月 大小)，而GPX4fl/wtLysMcre 小鼠在三月大小时已出现明显皮损，这些小鼠在六月大小时皮 损面积进一步扩大。 图10所示为髓系来源的中性粒细胞中条件性敲低GPX4的小鼠(GPX4fl/wtLysMcre ) 和没有敲低GPX4的对照鼠(GPX4fl/fl)的肾脏免疫复合物沉积的情况。处死4月大小的小鼠， 取其中一个肾脏，按照纵切面切出6微米厚的片子，进行染色，粉色代表IgG，黄色代表IgM， 绿色代表C1q，蓝色代表DNA，Merge代表将所有颜色重叠在一起。可以看出，GPX4fl/wtLysMcre 小鼠明显增加了肾小球IgG、IgM、C1q的沉积。 图11所示为在髓系来源的中性粒细胞中条件性敲低GPX4的小鼠(GPX4fl/wtLysMcre )和没有敲低GPX4的对照鼠(GPX4fl/fl) ,在4月大小时，肾小球的HE染色代表图。GPX4fl/ wtLysMcre 小鼠肾小球内细胞增生，结构紊乱。 图12所示为在髓系来源的中性粒细胞中条件性敲低GPX4的小鼠(GPX4fl/wtLysMcre )和没有敲低GPX4的对照鼠(GPX4fl/fl) ,在4月大小时，尿蛋白的检测。并区分雌鼠和雄鼠。 纵坐标为BCA蛋白定量法在562nm测出的OD值，数值越大代表蛋白含量越多。可以看出， GPX4fl/wtLysMcre 小鼠蛋白尿升高。(GPX4fl/fl:雌鼠＝15只,雄鼠＝4只,GPX4fl/wtLysMCre : 雌鼠＝20只,雄鼠＝11只)。 图13所示为在髓系来源的中性粒细胞中条件性敲低GPX4的小鼠(GPX4fl/wtLysMcre )和没有敲低GPX4的对照鼠(GPX4fl/fl)血浆中抗自身双链DNA抗体(anti-dsDNA)含量的对 比。收集3月大小和6月大小GPX4fl/wtLysMcre 小鼠内眦血，并提取血浆，以6月大小的GPX4fl /fl小鼠作为对照。通过ELISA的方法检测抗自身双链DNA抗体。并区分了雌鼠和雄鼠。可以看 到GPX4fl/wtLysMcre 小鼠抗自身双链DNA抗体不断增加。(GPX4fl/fl:雌鼠＝6,雄鼠＝6, GPX4fl/wtLysMCre :雌鼠(3月/6月)＝16只/29只,雄鼠(3月/6月)＝7只/7只)。 图14所示为在髓系来源的中性粒细胞中条件性敲低GPX4的小鼠(GPX4fl/wtLysMcre 5 CN 111593075 A 说 明 书 4/7 页 )和没有敲低GPX4的对照鼠(GPX4fl/fl)血浆中补体C3(Complement 3)含量的对比。收集3月 大小和6月大小GPX4fl/wtLysMcre 小鼠内眦血，并提取血浆，以6月大小的GPX4fl/fl小鼠作为 对照。通过ELISA的方法检测补体C3，并区分了雌鼠和雄鼠，可以看到GPX4fl/wtLysMcre 小鼠 补体C3不断下降(GPX4fl/fl:雌鼠＝6,雄鼠＝6,GPX4fl/wtLysMCre :雌鼠(3月/6月)＝16只/29 只,雄鼠(3月/6月)＝7只/7只)。 图15所示为在髓系来源的中性粒细胞中条件性敲低GPX4的小鼠(GPX4fl/wtLysMcre )和没有敲低GPX4的对照鼠(GPX4fl/fl)血浆中炎症因子含量的对比。收集3月大小和6月大 小GPX4fl/wtLysMcre 小鼠内眦血，并提取血浆，以6月大小的GPX4fl/fl小鼠作为对照。通过多 因子试剂盒的方法检测炎症因子一型干扰素α(IFN-α)，白介素6(IL-6)，二型干扰素γ (IFN-γ)，白介素10(IL-10)。并区分了雌鼠和雄鼠。可以看到GPX4fl/wtLysMcre 小鼠补体炎 症因子不断增加(GPX4fl/fl:雌鼠＝6,雄鼠＝6,GPX4fl/wtLysMCre :雌鼠(3月/6月)＝16只/29 只,雄鼠(3月/6月)＝7只/7只)。所有散点图的数据通过平均值±SD的方式显示，*p< 0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001,ns p>0.05。
