技术摘要：
本发明公开了一种桑树铜转运蛋白MaZIP4及其应用，属于植物基因工程技术领域。所述桑树铜转运蛋白MaZIP4的基因序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明通过桑树在铜胁迫下相关生理生化指标的分析，以及桑树铜转运蛋白MaZIP4的研究，完善了桑树基因  全部
背景技术：
在植物所有必需营养元素中，铜离子是植物生长发育必需的微量营养元素，又是 污染环境的重金属元素。主要以二价铜离子的形式被植物所利用，一方面，可作为氧化酶的 辅因子，控制蛋白质的结构，影响生理生化代谢过程；另一方面，已从超富集植物中克隆出 多个金属转运蛋白基因，这些基因表达的转运蛋白对细胞中重金属的转运、分布和富集发 挥着重要作用。土壤中铜元素含量过高或过低都会影响植物生长发育、生理代谢以及作物 产量，为了适应土壤中不断变化的铜离子含量以及应付其它形式的胁迫，植物必须在整体 水平和细胞水平上严格控制铜离子的转运。通过研究植物铜离子吸收机制以及生理生化指 标，才能从分子生物学途径改良植物品种，提高植物重金属胁迫能力。 土壤中铜离子的供应量变化能影响植物的正常生长发育。植物为了维持铜的稳 态，进化构建出严格调控的体内平衡网络，控制铜离子的摄取和传递，许多不同类型的铜转 运蛋白在整个调控过程中发挥重要作用。这些铜转运蛋白位于植物体内不同器官和细胞的 不同位置，根据其功能可将其分为吸收型铜转运蛋白，包括高亲和性COPT(copper  transporter)转运体家族、黄色条纹蛋白(yellow  stripe-like  protein,YSL)家族等介导 向胞质溶胶的转运；排出型铜转运蛋白，包括流出p型ATPases家族，RAN1、PAA1、PAA2、HMA5、 HMA1；还有位于胞内的金属伴侣蛋白，包括ATX1,CCH，和CCS1，介导Cu 传递到特定的蛋白质 点；及植物ZIP(Zn-regulated  transporter ,Iron-regulated  transporter-like  Protein)蛋白属于金属转运蛋白家族，参与锌、铜、镉、铁或锰的摄取和分配。 在拟南芥中，ZIP家族基因编码14个蛋白质成员。AtlRT1是一种高亲和力的铁摄取 转运蛋白。AtlRT2和AtlRT3负责根系对铁和锌的吸收。AtlRT1是一种液泡转运体，将锰和锌 从液泡中运输到根细胞的细胞质中。AtZIP2位于PM中，可能介导锰(也可能是锌)进入根中 柱细胞，或在柱中锰/锌向木质部薄壁组织迁移。虽然，AtZIP3被认为是将锌和铁从土壤运 输到植物，但AtZIP4可能参与了锌和铜在组织之间的运输。有研究表明，拟南芥ZIP家族有 14个成员，AtZIP2和AtZIP4可以互补酵母铜和锌的转运突变体。拟南芥遭受铜和锌缺乏时， AtZIP2和AtZIP4的表达上调，但在铁缺乏时AtZIP2和AtZIP4的表达不变。水稻基因组有18 个ZIP成员。OsIRT1和OsIRT2主要是根中转运铁和锌的同源物。OsZIP1被认为是锌缺乏症诱 导表达的锌摄取转运体，但其过表达通过限制重金属在水稻组织中的积累可以来解毒过量 的铜。 在铜胁迫条件下，ZIP4基因的转录水平有所变化；植物中MDA含量、PRO含量、SOD活 性、POD活性以及可溶性蛋白含量随着铜胁迫处理时间的延长，均出现不同程度的变化趋 势。研究发现，随着铜胁迫处理时间的延长，ZIP4基因的表达在植物不同部位有不同程度的 变化，维持植物铜稳态，有利于植物正常生长。 我国是世界上种植桑树、养蚕最早的国家，桑树的栽培已有几千年的历史，桑树种 3 CN 111606983 A 说　明　书 2/7 页 质资源的研究培育和桑树产业的开发已经得到越来越多的重视。充分认识和发掘桑树的经 济价值和生态保护作用，建立相辅相成的桑蚕产业经济发展和生态产业多样化的模式，增 加桑资源开发途径，为蚕桑业的推广和应用起到了重要的作用。
技术实现要素：
发明目的：本发明要解决的技术问题是提供一种桑树铜转运蛋白MaZIP4及其在铜 胁迫条件下代谢检测和表达调控中的应用。 技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案： 桑树铜转运蛋白MaZIP4，所述桑树铜转运蛋白MaZIP4的氨基酸序列如SEQ  ID  NO.：2所示。 编码权利要求1所述桑树铜转运蛋白MaZIP4的基因，其核苷酸序列如SEQ  ID  NO.： 1所示。 上述桑树铜转运蛋白MaZIP4在作为植物铜胁迫条件下表达标志物中的应用在本 发明的保护范围之内。 其中，所述铜胁迫条件为200mg/kg浓度的CuSO4处理1～20天。 其中，所述植物为桑树(Morus  multicaulis)。 上述编码桑树铜转运蛋白MaZIP4的基因在作为植物铜胁迫条件下表达标志物中 的应用在本发明的保护范围之内。 进一步地，桑树铜转运蛋白MaZIP4基因进行荧光定量分析的引物序列如SEQ  ID  NO.：3～4所示。 有益效果：铜是植物必需的微量营养元素之一，主要以二价铜离子的形式被植物 所吸收。在植物生长过程中，铜稳态的维持是一个多基因参与的复杂过程，而特殊的转运蛋 白对铜稳态的维持无疑发挥着非常重要的作用，如ZIP蛋白属于二价金属离子转运蛋白，能 够将金属离子转运至细胞质进而维持离子平衡。研究发现，在铜胁迫条件下，植物体内MDA 含量、PRO含量、SOD活性、POD活性以及可溶性蛋白含量均有变化；ZIP4基因的表达在不同处 理时间点变化明显。因此，对铜转运蛋白的研究，可进一步了解铜在植物体内的吸收、运输 和积累机制，发掘重金属耐性或敏感性基因，最终通过基因工程方法改良植物的耐金属能 力。 附图说明 表1为桑树铜转运蛋白MaZIP4基因序列； 表2为桑树铜转运蛋白MaZIP4基因预测的氨基酸序列； 图1为桑树铜转运蛋白MaZIP4基因克隆PCR图； 图2为定量RT-PCR检测MaZIP4基因在200mg/kg浓度的CuSO4处理下不同时间点桑 苗嫩叶中的相对表达量图；对照，处理1天，处理3天，处理5天，处理10天，处理15天，处理20 天；每组数据左侧为对照组，右侧为实验处理结果； 图3为定量RT-PCR检测MaZIP4基因在200mg/kg浓度的CuSO4处理下不同时间点桑 苗根须中的相对表达量图；对照，处理1天，处理3天，处理5天，处理10天，处理15天，处理20 天；每组数据左侧为对照组，右侧为实验处理结果； 4 CN 111606983 A 说　明　书 3/7 页 图4为在200mg/kg浓度的CuSO4处理下不同时间点桑苗嫩叶中丙二醛(MDA)含量变 化图；每组数据左侧为对照组，右侧为实验处理结果； 图5为在200mg/kg浓度的CuSO4处理下不同时间点桑苗嫩叶中脯氨酸(PRO)含量变 化图；每组数据左侧为对照组，右侧为实验处理结果； 图6为在200mg/kg浓度的CuSO4处理下不同时间点桑苗嫩叶中超氧化物歧化酶 (SOD)活性变化图；每组数据左侧为对照组，右侧为实验处理结果； 图7为在200mg/kg浓度的CuSO4处理下不同时间点桑苗嫩叶中过氧化物酶(POD)活 性变化图；每组数据左侧为对照组，右侧为实验处理结果； 图8为在200mg/kg浓度的CuSO4处理下不同时间点桑苗嫩叶中可溶性蛋白(BCA)含 量变化图；每组数据左侧为对照组，右侧为实验处理结果； 图9为在200mg/kg浓度的CuSO4处理下不同时间点桑苗根须中丙二醛(MDA)含量变 化图；每组数据左侧为对照组，右侧为实验处理结果； 图10为在200mg/kg浓度的CuSO4处理下不同时间点桑苗根须中脯氨酸(PRO)含量 变化图；每组数据左侧为对照组，右侧为实验处理结果； 图11为在200mg/kg浓度的CuSO4处理下不同时间点桑苗嫩叶中超氧化物歧化酶 (SOD)活性变化图；每组数据左侧为对照组，右侧为实验处理结果； 图12为在200mg/kg浓度的CuSO4处理下不同时间点桑苗嫩叶中过氧化物酶(POD) 活性变化图；每组数据左侧为对照组，右侧为实验处理结果； 图13为在200mg/kg浓度的CuSO4处理下不同时间点桑苗嫩叶中可溶性蛋白(BCA) 含量变化图；每组数据左侧为对照组，右侧为实验处理结果。