技术摘要：
本发明公开了一种基于pH和氧化还原双重响应的抗肝癌药物纳米粒子的制备方法。该纳米粒子的制备包括以下步骤：首先，采用尿刊酸和α‑硫辛酸通过酯键与多糖进行接枝以获得具有pH和氧化还原双重响应的聚合物LA‑URPA；再通过反溶剂法实现抗肝癌药物纳米粒子的自组装，从 全部
背景技术：
据报道，肝细胞癌(HCC)是世界上最恶性的癌症之一，也是癌症死亡的第三大主要 原因。到目前为止，传统的治疗方法主要是手术切除，放疗和化疗。手术切除被认为是治疗 HCC的最佳方法，但肿瘤细胞易于转移并侵袭其他组织，具有较高的复发风险。此外，已证明 放疗和化学疗法会杀死辐射范围内的所有细胞，包括正常细胞，这些细胞选择性差且副作 用严重，并降低了患者的生活质量。因此，探索治疗肝癌的有效方法非常迫切，已引起研究 人员的广泛关注。 目前，人参皂苷Rh2，紫杉醇，DOX等药物，对多种实体瘤具有显著的抗肿瘤活性，这 些实体瘤包括肝癌，肺癌，卵巢癌，乳腺癌，结肠癌等，可有效抑制肿瘤细胞凋亡。然而，已发 现这些药物存在诸多缺陷。直接使用这些药物时，不仅口服生物利用度低，水溶性较低，化 学稳定性较差，而且缺乏靶向肿瘤的能力，会杀死正常细胞并损害人体，具有严重的副作 用，限制了其在临床试验中的应用。 有趣的是，纳米药物递送系统的发展为改善抗肿瘤药物的缺陷提供了新的策略。 与传统疗法相比，该系统具有更高的溶解度，化学稳定性和生物利用度，有效的靶向性，更 长的周期时间和低毒性。然而，临床试验的结果表明，传统的聚合物纳米载体可能无法在病 理变化中实现药物的程序性释放，从而导致细胞的多重耐药性和功效降低。同时，由于简单 的物理包封，抗癌药物在全身循环中很容易从载体中漏出，从而导致严重的副作用。此外， 由于较差的水溶性，疏水性药物在纳米制剂中的包封率非常低，这也严重限制了其应用。目 前，纳米药物递送系统通常可以响应生理刺激选择性地释放药物，引起了研究人员的注意。 当响应刺激在细胞内环境中时，纳米药物载体到达肿瘤细胞并在环境刺激下迅速释放药 物，这不仅减少了副作用，而且还提高了药物的功效。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种基于pH和氧化还原双重响应的抗肝癌药物纳米粒子 的制备方法，该方法重复性好，操作性强。 本发明为实现上述目的所采用的的技术方案是：首先合成聚合物URPA和LA-URPA， 然后并使用傅里叶红外光谱(FT-IR)，1H核磁共振光谱(1H NMR)，高效凝胶渗透色谱 (HPGPC)，X射线光电子能谱(EDS)对聚合物的结构进行表征。然后以此为载体制备得到Rh2 纳米粒子，最后采用动态光散射(DLS)，透射电子显微镜(TEM)，扫描电子显微镜(SEM)，和X 射线衍射(XRD)对纳米粒子的结构进行表征。判断其是否成功合成。然后采用反溶剂法制备 LA-URPA纳米粒子。最后对纳米粒子的结构进行分析。 5 CN 111568879 A 说 明 书 2/16 页 一种基于pH和氧化还原双重响应的抗肝癌药物纳米粒子的制备方法，包括以下步 骤： S1、合成聚合物URPA S11、将尿刊酸溶解在干燥的二甲基亚砜(DMSO)中，并加入二环己基碳二亚胺 (DCC)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)，室温下避光搅拌1～3h进行活化，使混合物反应，得尿刊酸 溶液；其中，所述尿刊酸、DCC、DMAP的重量比为5:10:12～5:30:12；所述尿刊酸和DMSO的重 量体积比为1:20～1:50g/mL； S12、将多糖溶解在干燥的DMSO中，得多糖溶液；将所述多糖溶液转移到步骤S11所 述尿刊酸溶液中，在室温下搅拌反应24～72h，离心除去生成的沉淀物A，得聚合物溶液；将 所述聚合物溶液倒入乙醇A中，过滤收集沉淀物B，将所述沉淀物B依次用乙醇B，丙酮和乙醚 洗涤，真空冷冻干燥，得到聚合物URPA粉末；其中，所述多糖与干燥的DMSO的重量体积比为 1:20～1:50g/mL；所述多糖溶液和所述尿刊酸溶液的体积比是1:1～3:1；所述聚合物溶液 与乙醇A的体积比为1:4～1:6；所述沉淀物B与乙醇B，丙酮和乙醚的重量体积比均为1:50～ 1:150g/mL；所述多糖为普鲁兰多糖，糖原、半乳糖基化壳聚糖中的一种； S2、合成聚合物LA-URPA 将α-硫辛酸(α-LA)溶解在干燥的DMSO中，加入DCC、DMAP，室温搅拌1～3h，得LA溶 液；将步骤S12所述聚合物URPA粉末溶解在干燥的DMSO中，得URPA溶液；将所述LA溶液加入 至所述URPA溶液中，室温搅拌48～96h，使混合物反应，并通过离心除去生成的沉淀物C，得 溶液LA-URPA；将所述溶液LA-URPA倒入乙醇C中，过滤收集沉淀物D，分别用乙醇D，丙酮和乙 醚洗涤，真空冷冻干燥，得到聚合物LA-URPA粉末； 其中，所述α-硫辛酸(α-LA)与干燥的DMSO的重量体积比为1:20～1:50g/mL；所述 α-硫辛酸、DCC、DMAP的重量比为5:1:3～5:10:3；所述聚合物URPA粉末与干燥的DMSO的重量 体积比为1:20～1:100g/mL；所述LA溶液和所述URPA溶液的体积比为1:1～1:3；所述溶液 LA-URPA与乙醇的体积比为1:4～1:6；所述沉淀物D与乙醇，丙酮和乙醚的重量体积比均为 1:50～1:150g/mL； S3、制备抗癌药物纳米粒子悬浮液：将抗肝癌药物和步骤S2所述聚合物LA-URPA溶 解在干燥的DMSO中，然后在室温下边搅拌边滴加蒸馏水，得抗肝癌药物纳米粒子悬浮液；其 中，所述抗肝癌药物和聚合物LA-URPA的重量比为1:5～1:15，所述抗肝癌药物和DMSO的重 量体积比为1:1～3:1mg/mL；所述蒸馏水和DMSO的体积比是2:1～6:1； S4、制备抗癌药物纳米粒子：使用超声波细胞破碎仪300～400W，在冰浴中超声处 理步骤S3所述抗肝癌药物纳米粒子悬浮液10～30min；然后使用截留分子量为12～14KD的 透析袋、以400～800rpm的速度、用蒸馏水透析12～36h；透析后，取透析袋内的溶液离心去 除沉淀，取上清液；将所述上清液通过0.45μm微孔膜过滤，真空冷冻干燥，得到抗肝癌药物 纳米粒子。 优选方式下，步骤S12所述离心为4000rpm离心10min。 优选方式下，步骤S13所述真空冷冻干燥的压强为0～3Pa，冷阱-20～-50℃，干燥2 ～5天至恒重。 优选方式下，步骤S2所述离心为4000rpm离心10min；所述真空冷冻干燥的压强为0 ～3Pa，冷阱-20～-50℃，干燥2～5天至恒重。 6 CN 111568879 A 说 明 书 3/16 页 优选方式下，步骤S3所述抗肝癌药物为人参皂苷Rh2、紫杉醇或DOX。 优选方式下，步骤S4所述离心为3000rpm离心10min；所述真空冷冻干燥的压强为0 ～3Pa，冷阱-20～-50℃，干燥2～5天至恒重；所述透析使用的蒸馏水与所述抗肝癌药物纳 米粒子悬浮液的体积比是20:1～60:1，每2h更换一次蒸馏水。 优选方式下，所述基于pH和氧化还原双重响应的靶向载药纳米粒子的制备方法， 包括以下步骤： S1、合成聚合物URPA S11、将0.25g尿刊酸溶解在10mL干燥的二甲基亚砜(DMSO)中，并加入1g二环己基 碳二亚胺(DCC)、0.6g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)，室温下避光搅拌2h进行活化，使混合物反 应，得尿刊酸溶液； S12、将0.5g普鲁兰多糖溶解在20mL干燥的DMSO中，得多糖溶液；将20mL所述多糖 溶液转移到10mL步骤S11所述尿刊酸溶液中，在室温下搅拌反应48h，4000rpm离心10min除 去生成的沉淀物A，得聚合物溶液；将30mL所述聚合物溶液倒入150mL乙醇中，抽滤收集沉淀 物B，将0.6g所述沉淀物B依次用60mL乙醇，60mL丙酮和60mL乙醚洗涤，最后在压强为0，冷 阱-30℃的真空冷冻干燥机中干燥4天至恒重，得到聚合物URPA粉末； S2、合成聚合物LA-URPA 将0.25gα-硫辛酸(α-LA)溶解在10mL干燥的DMSO中，加入0.25g DCC、0.15g DMAP， 室温搅拌2h，得LA溶液；将0.25g步骤S12所述聚合物URPA粉末溶解在20mL干燥的DMSO中，得 URPA溶液；将10mL所述LA溶液加入至20mL所述URPA溶液中，室温搅拌72h，使混合物反应，并 通过4000rpm离心10min除去生成的沉淀物C，得溶液LA-URPA；将30mL所述溶液LA-URPA倒入 150mL乙醇中，抽滤收集沉淀物D；分别用40mL乙醇，40mL丙酮和40mL乙醚洗涤0.4g所述沉淀 物D，最后在压强为0，冷阱-30℃的真空冷冻干燥机中干燥4天至恒重，得到聚合物LA-URPA 粉末； S3、制备抗癌药物纳米粒子悬浮液：将2mg人参皂苷Rh2和20mg步骤S2所述聚合物 LA-URPA溶解在1mL干燥的DMSO溶液中；然后在室温下边搅拌边滴加4mL蒸馏水，得Rh2纳米 粒子悬浮液； S4、制备抗癌药物纳米粒子：使用超声波细胞破碎仪360W，在冰浴中超声处理所得 Rh2纳米粒子悬浮液20min；然后使用截留分子量为12～14KD的透析袋、以600rpm的速度用 200mL蒸馏水透析24h，每2h更换一次蒸馏水；接下来取透析袋内的溶液，3000rpm离心 10min，取上清液；将所述上清液通过0.45μm微孔膜过滤，最后在压强为0，冷阱-30℃的真空 冷冻干燥机中干燥4天至恒重，得到Rh2纳米粒子。 如无特殊说明，本发明所述室温为20～30℃。 本发明与现有技术相比，具有以下优点： 1、本发明聚合物LA-URPA经尿刊酸和α-硫辛酸(α-LA)进行修饰，制备得到的抗肝 癌药物纳米粒子具有pH和氧化还原双重响应性，所述抗肝癌药物纳米粒子进入肿瘤组织、 内体和溶酶体时，抗肿瘤药物可从对pH和氧化还原敏感的纳米粒子中迅速释放出来。 2、本发明制备得到的LA-URPA纳米粒子具有良好的稳定性。使用该纳米粒子包埋 药物可以避免药物被降解，保持药物的完整性，从而起到良好的治疗作用。 3、所述抗肝癌药物纳米粒子具有较高的载药效率。 7 CN 111568879 A 说 明 书 4/16 页 4、本发明制备得到的抗肝癌药物纳米粒子对肝癌细胞HepG2具有显著的细胞毒 性，可有效诱导HepG2凋亡，对治疗癌症有重要意义。 5、本发明的结果证明ROS介导的线粒体途径参与了Rh2纳米粒子诱导的细胞凋亡。 附图说明 图1是聚合物URPA和聚合物LA-URPA的合成过程。 图2是LA-URPA纳米粒子自组装成Rh2纳米粒子以及进入细胞有效释放药物的过 程。 图3是普鲁兰多糖，聚合物URPA以及聚合物LA-URPA的红外光谱图。 图4是普鲁兰多糖的核磁共振光谱图。 图5是聚合物URPA的核磁共振光谱图。 图6是聚合物LA-URPA的核磁共振光谱图。 图7是普鲁兰多糖，聚合物URPA以及聚合物LA-URPA的高效凝胶渗透色谱图。 图8是普鲁兰多糖的X射线光电子能谱图。 图9是聚合物URPA的X射线光电子能谱图。 图10是聚合物LA-URPA的X射线光电子能谱图。 图11是LA-URPA纳米粒子的粒径大小及分布图。 图12是Rh2纳米粒子的粒径大小及分布图。 图13是LA-URPA纳米粒子透射电镜图。 图14是Rh2纳米粒子的透射电镜图。 图15是LA-URPA纳米粒子的扫描电镜图。 图16是Rh2纳米粒子的扫描电镜图。 图17是LA-URPA纳米粒子和Rh2纳米粒子的X射线衍射图。 图18是LA-URPA纳米粒子经10mM GSH处理24h后的透射电镜图。 图19是Rh2纳米粒子在PBS溶液中的Rh2体外释放曲线。 图20是LA-URPA纳米粒子的细胞毒性。 图21是用不同浓度的Rh2，Rh2纳米粒子或Rh2纳米粒子 GSH孵育24h的HepG2细胞的 细胞活力。 图22是用不同浓度的Rh2，Rh2纳米粒子或Rh2纳米粒子 GSH孵育48h的HepG2细胞的 细胞活力。 图23是用不同浓度的Rh2，Rh2纳米粒子或Rh2纳米粒子 GSH孵育72h的HepG2细胞的 细胞活力。 图24是用DAPI染色的HepG2细胞的显微镜图像。 图25是与FITC-Rh2孵育3h的HepG2细胞的显微镜图像。 图26是与FITC-Rh2孵育3h后用DAPI染色的HepG2细胞的显微镜图像。 图27是用DAPI染色的HepG2细胞的显微镜图像。 图28是与FITC-Rh2纳米粒子孵育3h的HepG2细胞的显微镜图像。 图29是与FITC-Rh2纳米粒子孵育3h后用DAPI染色的HepG2细胞的显微镜图像。 图30是用DAPI染色的HepG2细胞的显微镜图像。 8 CN 111568879 A 说 明 书 5/16 页 图31是与FITC-Rh2纳米粒子 GSH孵育3h的HepG2细胞的显微镜图像。 图32是与FITC-Rh2纳米粒子 GSH孵育3h后用DAPI染色的HepG2细胞的显微镜图 像。 图33是与FITC-Rh2，FITC-Rh2纳米粒子或FITC-Rh2纳米粒子 GSH孵育3h后用DAPI 染色的HepG2细胞的荧光强度图。 图34是未经处理的HepG2细胞的流式细胞仪分析。 图35是游离Rh2诱导的HepG2细胞凋亡的流式细胞仪分析。 图36是Rh2纳米粒子诱导的HepG2细胞凋亡的流式细胞仪分析。 图37是Rh2纳米粒子 GSH诱导的HepG2细胞凋亡的流式细胞仪分析。 图38是用游离Rh2或Rh2纳米粒子处理诱导的凋亡细胞的百分比。 图39是用游离Rh2，Rh2纳米粒子或Rh2纳米粒子 GSH孵育24h的HepG2细胞中的活性 氧(ROS)水平。 图40是用游离Rh2，Rh2纳米粒子或Rh2纳米粒子 GSH孵育24h的HepG2细胞中的超氧 化物歧化酶(SOD)水平。 图41是用游离Rh2，Rh2纳米粒子或Rh2纳米粒子 GSH孵育24h的HepG2细胞中的谷胱 甘肽(GSH)水平。 图42是用游离Rh2，Rh2纳米粒子或Rh2纳米粒子 GSH孵育24h的HepG2细胞中的线粒 体膜电位(MMP)的变化。
本发明公开了一种基于pH和氧化还原双重响应的抗肝癌药物纳米粒子的制备方法。该纳米粒子的制备包括以下步骤：首先，采用尿刊酸和α‑硫辛酸通过酯键与多糖进行接枝以获得具有pH和氧化还原双重响应的聚合物LA‑URPA；再通过反溶剂法实现抗肝癌药物纳米粒子的自组装，从 全部
背景技术：
据报道，肝细胞癌(HCC)是世界上最恶性的癌症之一，也是癌症死亡的第三大主要 原因。到目前为止，传统的治疗方法主要是手术切除，放疗和化疗。手术切除被认为是治疗 HCC的最佳方法，但肿瘤细胞易于转移并侵袭其他组织，具有较高的复发风险。此外，已证明 放疗和化学疗法会杀死辐射范围内的所有细胞，包括正常细胞，这些细胞选择性差且副作 用严重，并降低了患者的生活质量。因此，探索治疗肝癌的有效方法非常迫切，已引起研究 人员的广泛关注。 目前，人参皂苷Rh2，紫杉醇，DOX等药物，对多种实体瘤具有显著的抗肿瘤活性，这 些实体瘤包括肝癌，肺癌，卵巢癌，乳腺癌，结肠癌等，可有效抑制肿瘤细胞凋亡。然而，已发 现这些药物存在诸多缺陷。直接使用这些药物时，不仅口服生物利用度低，水溶性较低，化 学稳定性较差，而且缺乏靶向肿瘤的能力，会杀死正常细胞并损害人体，具有严重的副作 用，限制了其在临床试验中的应用。 有趣的是，纳米药物递送系统的发展为改善抗肿瘤药物的缺陷提供了新的策略。 与传统疗法相比，该系统具有更高的溶解度，化学稳定性和生物利用度，有效的靶向性，更 长的周期时间和低毒性。然而，临床试验的结果表明，传统的聚合物纳米载体可能无法在病 理变化中实现药物的程序性释放，从而导致细胞的多重耐药性和功效降低。同时，由于简单 的物理包封，抗癌药物在全身循环中很容易从载体中漏出，从而导致严重的副作用。此外， 由于较差的水溶性，疏水性药物在纳米制剂中的包封率非常低，这也严重限制了其应用。目 前，纳米药物递送系统通常可以响应生理刺激选择性地释放药物，引起了研究人员的注意。 当响应刺激在细胞内环境中时，纳米药物载体到达肿瘤细胞并在环境刺激下迅速释放药 物，这不仅减少了副作用，而且还提高了药物的功效。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种基于pH和氧化还原双重响应的抗肝癌药物纳米粒子 的制备方法，该方法重复性好，操作性强。 本发明为实现上述目的所采用的的技术方案是：首先合成聚合物URPA和LA-URPA， 然后并使用傅里叶红外光谱(FT-IR)，1H核磁共振光谱(1H NMR)，高效凝胶渗透色谱 (HPGPC)，X射线光电子能谱(EDS)对聚合物的结构进行表征。然后以此为载体制备得到Rh2 纳米粒子，最后采用动态光散射(DLS)，透射电子显微镜(TEM)，扫描电子显微镜(SEM)，和X 射线衍射(XRD)对纳米粒子的结构进行表征。判断其是否成功合成。然后采用反溶剂法制备 LA-URPA纳米粒子。最后对纳米粒子的结构进行分析。 5 CN 111568879 A 说 明 书 2/16 页 一种基于pH和氧化还原双重响应的抗肝癌药物纳米粒子的制备方法，包括以下步 骤： S1、合成聚合物URPA S11、将尿刊酸溶解在干燥的二甲基亚砜(DMSO)中，并加入二环己基碳二亚胺 (DCC)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)，室温下避光搅拌1～3h进行活化，使混合物反应，得尿刊酸 溶液；其中，所述尿刊酸、DCC、DMAP的重量比为5:10:12～5:30:12；所述尿刊酸和DMSO的重 量体积比为1:20～1:50g/mL； S12、将多糖溶解在干燥的DMSO中，得多糖溶液；将所述多糖溶液转移到步骤S11所 述尿刊酸溶液中，在室温下搅拌反应24～72h，离心除去生成的沉淀物A，得聚合物溶液；将 所述聚合物溶液倒入乙醇A中，过滤收集沉淀物B，将所述沉淀物B依次用乙醇B，丙酮和乙醚 洗涤，真空冷冻干燥，得到聚合物URPA粉末；其中，所述多糖与干燥的DMSO的重量体积比为 1:20～1:50g/mL；所述多糖溶液和所述尿刊酸溶液的体积比是1:1～3:1；所述聚合物溶液 与乙醇A的体积比为1:4～1:6；所述沉淀物B与乙醇B，丙酮和乙醚的重量体积比均为1:50～ 1:150g/mL；所述多糖为普鲁兰多糖，糖原、半乳糖基化壳聚糖中的一种； S2、合成聚合物LA-URPA 将α-硫辛酸(α-LA)溶解在干燥的DMSO中，加入DCC、DMAP，室温搅拌1～3h，得LA溶 液；将步骤S12所述聚合物URPA粉末溶解在干燥的DMSO中，得URPA溶液；将所述LA溶液加入 至所述URPA溶液中，室温搅拌48～96h，使混合物反应，并通过离心除去生成的沉淀物C，得 溶液LA-URPA；将所述溶液LA-URPA倒入乙醇C中，过滤收集沉淀物D，分别用乙醇D，丙酮和乙 醚洗涤，真空冷冻干燥，得到聚合物LA-URPA粉末； 其中，所述α-硫辛酸(α-LA)与干燥的DMSO的重量体积比为1:20～1:50g/mL；所述 α-硫辛酸、DCC、DMAP的重量比为5:1:3～5:10:3；所述聚合物URPA粉末与干燥的DMSO的重量 体积比为1:20～1:100g/mL；所述LA溶液和所述URPA溶液的体积比为1:1～1:3；所述溶液 LA-URPA与乙醇的体积比为1:4～1:6；所述沉淀物D与乙醇，丙酮和乙醚的重量体积比均为 1:50～1:150g/mL； S3、制备抗癌药物纳米粒子悬浮液：将抗肝癌药物和步骤S2所述聚合物LA-URPA溶 解在干燥的DMSO中，然后在室温下边搅拌边滴加蒸馏水，得抗肝癌药物纳米粒子悬浮液；其 中，所述抗肝癌药物和聚合物LA-URPA的重量比为1:5～1:15，所述抗肝癌药物和DMSO的重 量体积比为1:1～3:1mg/mL；所述蒸馏水和DMSO的体积比是2:1～6:1； S4、制备抗癌药物纳米粒子：使用超声波细胞破碎仪300～400W，在冰浴中超声处 理步骤S3所述抗肝癌药物纳米粒子悬浮液10～30min；然后使用截留分子量为12～14KD的 透析袋、以400～800rpm的速度、用蒸馏水透析12～36h；透析后，取透析袋内的溶液离心去 除沉淀，取上清液；将所述上清液通过0.45μm微孔膜过滤，真空冷冻干燥，得到抗肝癌药物 纳米粒子。 优选方式下，步骤S12所述离心为4000rpm离心10min。 优选方式下，步骤S13所述真空冷冻干燥的压强为0～3Pa，冷阱-20～-50℃，干燥2 ～5天至恒重。 优选方式下，步骤S2所述离心为4000rpm离心10min；所述真空冷冻干燥的压强为0 ～3Pa，冷阱-20～-50℃，干燥2～5天至恒重。 6 CN 111568879 A 说 明 书 3/16 页 优选方式下，步骤S3所述抗肝癌药物为人参皂苷Rh2、紫杉醇或DOX。 优选方式下，步骤S4所述离心为3000rpm离心10min；所述真空冷冻干燥的压强为0 ～3Pa，冷阱-20～-50℃，干燥2～5天至恒重；所述透析使用的蒸馏水与所述抗肝癌药物纳 米粒子悬浮液的体积比是20:1～60:1，每2h更换一次蒸馏水。 优选方式下，所述基于pH和氧化还原双重响应的靶向载药纳米粒子的制备方法， 包括以下步骤： S1、合成聚合物URPA S11、将0.25g尿刊酸溶解在10mL干燥的二甲基亚砜(DMSO)中，并加入1g二环己基 碳二亚胺(DCC)、0.6g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)，室温下避光搅拌2h进行活化，使混合物反 应，得尿刊酸溶液； S12、将0.5g普鲁兰多糖溶解在20mL干燥的DMSO中，得多糖溶液；将20mL所述多糖 溶液转移到10mL步骤S11所述尿刊酸溶液中，在室温下搅拌反应48h，4000rpm离心10min除 去生成的沉淀物A，得聚合物溶液；将30mL所述聚合物溶液倒入150mL乙醇中，抽滤收集沉淀 物B，将0.6g所述沉淀物B依次用60mL乙醇，60mL丙酮和60mL乙醚洗涤，最后在压强为0，冷 阱-30℃的真空冷冻干燥机中干燥4天至恒重，得到聚合物URPA粉末； S2、合成聚合物LA-URPA 将0.25gα-硫辛酸(α-LA)溶解在10mL干燥的DMSO中，加入0.25g DCC、0.15g DMAP， 室温搅拌2h，得LA溶液；将0.25g步骤S12所述聚合物URPA粉末溶解在20mL干燥的DMSO中，得 URPA溶液；将10mL所述LA溶液加入至20mL所述URPA溶液中，室温搅拌72h，使混合物反应，并 通过4000rpm离心10min除去生成的沉淀物C，得溶液LA-URPA；将30mL所述溶液LA-URPA倒入 150mL乙醇中，抽滤收集沉淀物D；分别用40mL乙醇，40mL丙酮和40mL乙醚洗涤0.4g所述沉淀 物D，最后在压强为0，冷阱-30℃的真空冷冻干燥机中干燥4天至恒重，得到聚合物LA-URPA 粉末； S3、制备抗癌药物纳米粒子悬浮液：将2mg人参皂苷Rh2和20mg步骤S2所述聚合物 LA-URPA溶解在1mL干燥的DMSO溶液中；然后在室温下边搅拌边滴加4mL蒸馏水，得Rh2纳米 粒子悬浮液； S4、制备抗癌药物纳米粒子：使用超声波细胞破碎仪360W，在冰浴中超声处理所得 Rh2纳米粒子悬浮液20min；然后使用截留分子量为12～14KD的透析袋、以600rpm的速度用 200mL蒸馏水透析24h，每2h更换一次蒸馏水；接下来取透析袋内的溶液，3000rpm离心 10min，取上清液；将所述上清液通过0.45μm微孔膜过滤，最后在压强为0，冷阱-30℃的真空 冷冻干燥机中干燥4天至恒重，得到Rh2纳米粒子。 如无特殊说明，本发明所述室温为20～30℃。 本发明与现有技术相比，具有以下优点： 1、本发明聚合物LA-URPA经尿刊酸和α-硫辛酸(α-LA)进行修饰，制备得到的抗肝 癌药物纳米粒子具有pH和氧化还原双重响应性，所述抗肝癌药物纳米粒子进入肿瘤组织、 内体和溶酶体时，抗肿瘤药物可从对pH和氧化还原敏感的纳米粒子中迅速释放出来。 2、本发明制备得到的LA-URPA纳米粒子具有良好的稳定性。使用该纳米粒子包埋 药物可以避免药物被降解，保持药物的完整性，从而起到良好的治疗作用。 3、所述抗肝癌药物纳米粒子具有较高的载药效率。 7 CN 111568879 A 说 明 书 4/16 页 4、本发明制备得到的抗肝癌药物纳米粒子对肝癌细胞HepG2具有显著的细胞毒 性，可有效诱导HepG2凋亡，对治疗癌症有重要意义。 5、本发明的结果证明ROS介导的线粒体途径参与了Rh2纳米粒子诱导的细胞凋亡。 附图说明 图1是聚合物URPA和聚合物LA-URPA的合成过程。 图2是LA-URPA纳米粒子自组装成Rh2纳米粒子以及进入细胞有效释放药物的过 程。 图3是普鲁兰多糖，聚合物URPA以及聚合物LA-URPA的红外光谱图。 图4是普鲁兰多糖的核磁共振光谱图。 图5是聚合物URPA的核磁共振光谱图。 图6是聚合物LA-URPA的核磁共振光谱图。 图7是普鲁兰多糖，聚合物URPA以及聚合物LA-URPA的高效凝胶渗透色谱图。 图8是普鲁兰多糖的X射线光电子能谱图。 图9是聚合物URPA的X射线光电子能谱图。 图10是聚合物LA-URPA的X射线光电子能谱图。 图11是LA-URPA纳米粒子的粒径大小及分布图。 图12是Rh2纳米粒子的粒径大小及分布图。 图13是LA-URPA纳米粒子透射电镜图。 图14是Rh2纳米粒子的透射电镜图。 图15是LA-URPA纳米粒子的扫描电镜图。 图16是Rh2纳米粒子的扫描电镜图。 图17是LA-URPA纳米粒子和Rh2纳米粒子的X射线衍射图。 图18是LA-URPA纳米粒子经10mM GSH处理24h后的透射电镜图。 图19是Rh2纳米粒子在PBS溶液中的Rh2体外释放曲线。 图20是LA-URPA纳米粒子的细胞毒性。 图21是用不同浓度的Rh2，Rh2纳米粒子或Rh2纳米粒子 GSH孵育24h的HepG2细胞的 细胞活力。 图22是用不同浓度的Rh2，Rh2纳米粒子或Rh2纳米粒子 GSH孵育48h的HepG2细胞的 细胞活力。 图23是用不同浓度的Rh2，Rh2纳米粒子或Rh2纳米粒子 GSH孵育72h的HepG2细胞的 细胞活力。 图24是用DAPI染色的HepG2细胞的显微镜图像。 图25是与FITC-Rh2孵育3h的HepG2细胞的显微镜图像。 图26是与FITC-Rh2孵育3h后用DAPI染色的HepG2细胞的显微镜图像。 图27是用DAPI染色的HepG2细胞的显微镜图像。 图28是与FITC-Rh2纳米粒子孵育3h的HepG2细胞的显微镜图像。 图29是与FITC-Rh2纳米粒子孵育3h后用DAPI染色的HepG2细胞的显微镜图像。 图30是用DAPI染色的HepG2细胞的显微镜图像。 8 CN 111568879 A 说 明 书 5/16 页 图31是与FITC-Rh2纳米粒子 GSH孵育3h的HepG2细胞的显微镜图像。 图32是与FITC-Rh2纳米粒子 GSH孵育3h后用DAPI染色的HepG2细胞的显微镜图 像。 图33是与FITC-Rh2，FITC-Rh2纳米粒子或FITC-Rh2纳米粒子 GSH孵育3h后用DAPI 染色的HepG2细胞的荧光强度图。 图34是未经处理的HepG2细胞的流式细胞仪分析。 图35是游离Rh2诱导的HepG2细胞凋亡的流式细胞仪分析。 图36是Rh2纳米粒子诱导的HepG2细胞凋亡的流式细胞仪分析。 图37是Rh2纳米粒子 GSH诱导的HepG2细胞凋亡的流式细胞仪分析。 图38是用游离Rh2或Rh2纳米粒子处理诱导的凋亡细胞的百分比。 图39是用游离Rh2，Rh2纳米粒子或Rh2纳米粒子 GSH孵育24h的HepG2细胞中的活性 氧(ROS)水平。 图40是用游离Rh2，Rh2纳米粒子或Rh2纳米粒子 GSH孵育24h的HepG2细胞中的超氧 化物歧化酶(SOD)水平。 图41是用游离Rh2，Rh2纳米粒子或Rh2纳米粒子 GSH孵育24h的HepG2细胞中的谷胱 甘肽(GSH)水平。 图42是用游离Rh2，Rh2纳米粒子或Rh2纳米粒子 GSH孵育24h的HepG2细胞中的线粒 体膜电位(MMP)的变化。
