技术摘要：
本发明涉及产地判别的技术领域，尤其涉及一种鉴别鱼类产地的方法，包括以下步骤：选取真实产地鱼类样品；取得耳石并进行前处理；分析元素含量及碳氧同位素含量；将元素含量及碳氧同位素含量建立数据库；根据建立的数据库数据建立预测模型；选取未知鱼类样品的耳石，并  全部
背景技术：
随着全球经济化发展，世界各地出产的产品也都能够销往世界的每个角落，由于 各地的气候，水资源，土地的差异性也会导致产品的质量、价格的显著差异，因此对于进出 口产品的来源真实性识别极为重要，为海关部门对货物真实性识别和价格评估等发挥了很 大的作用。 鱼类作为人们非常喜欢的一种食物，也是进出口产品中非常庞大的一类。但是目 前对鱼类原产地的检测的研究极少，主要有稳定同位素、元素含量，DNA以及形态学鉴别。目 前稳定同位素、元素含量的方法原理是基于假设鱼类食物来源相对固定的情况下，通过检 测一些鱼类肌肉同位素，元素含量用来推测其产地，如果养殖的鱼类食物来源变化以后模 型就是失效了，但是鱼类食物来源相对固定的情况是很难实现的，对于人工饲养的鱼类也 很难保证鱼类食物来源的长期相对固定，针对于海鱼，以及一些野生鱼类，就更难实现了， 该假设不具有普适性，因此目前的检测方法并不具备普适性和推广性，且仅能针对少数品 种开展有限产地的区分。DNA、形态学鉴别以及传统化学检测方法也是通过识别鱼的品种差 别从而推测鱼类产地，也不能准确识别。因此目前的一些方法从原理上不能对产地进行有 效的识别。 中国发明专利CN104101570B公开了一种红外光谱法检测带鱼产地的方法，选取带 鱼背部肌肉作为样品进行检测，构建不同产地带鱼的参考指纹图谱，根据参考指纹图谱对 不同产地的参考指纹图谱；根据参考指纹图谱对不同产地带鱼的波长范围在4000-7000cm-1 的原始光谱进行一阶导数和矢量归一化处理；以相同方法建立待测带鱼的指纹图谱；将待 测带鱼的指纹图谱与参考指纹图谱进行聚类分析，得到待测带鱼的产地。 上述方案建立的方法或数据库仅适用于一种或一类鱼的产地识别，且光谱易受环 境干扰，准确率和稳定性在原理上具有缺陷，普适性和推广性也有待加强。 中国发明专利CN101441172B公开了一种用原子吸收光谱鉴别鲍鱼产地的方法，以 分布在同一海域的人工养殖鲍鱼为产地标准品，通过原子吸收法测定鲍鱼中钾、钠、镁、钙、 锌、铁元素的含量作为原产地鲍鱼元素含量数据库中数据；取待鉴别的鲍鱼样品分别与标 准品相同的条件检测，得到鉴别样品中的钾、钠、镁、钙、锌、铁元素含量，用统计学t分布检 验方法比较标准品与鉴别样品的元素含量是否存在显著性差异判定它是否属于该产地。上 述方案主要是看待测鱼产地是否为某一特定产地，同样存在由于食物来源改变影响区分准 确率的缺陷，鲍鱼作为一种贝类也不对鱼类的溯源具有可借鉴的技术思想，且标准鱼代表 性问题难以统一，因此该技术也难以推广使用到鱼类的溯源。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种鉴别鱼类产地的方法，利用鱼类耳石的元素含量组成以 4 CN 111610248 A 说　明　书 2/11 页 及碳氧稳定同位素检测从而识别鱼类原产地，检测结果可靠性好，精确度高，且普适性和推 广性更好。 本发明的目的是通过以下技术方案得以实现的：一种鉴别鱼类产地的方法，包括 以下步骤： 选取真实产地鱼类样品； 取得耳石并进行前处理； 分析元素含量及碳氧同位素含量； 将元素含量及碳氧同位素含量建立数据库； 根据建立的数据库数据建立预测模型； 选取未知鱼类样品的耳石，并进行前处理； 分析未知鱼类样品耳石的元素含量及碳氧稳定同位素含量； 将未知鱼类样品耳石的元素含量及碳氧稳定同位素含量数据结果带入预测模型，输出 产地结果。 本申请人创造性的提出利用鱼类耳石的元素含量组成以及碳氧稳定同位素检测 从而识别鱼类原产地的技术方案，检测结果可靠性好，精确度高，且普适性和推广性更好。 耳石是存在于硬骨鱼类内耳的膜迷路内的功能性沉积体,起平衡和听觉作用的硬 组织。鱼耳石是一种典型的天然生物矿物，主要由碳酸钙、有机质和少量微量元素构成。耳 石中化学元素的沉积是一个生理过程  ,与环境温度关系密切。耳石各部分元素沉积量与环 境中该元素的可利用率以及水化学特性等有关。 总结而言，对鱼的耳石日轮形成影响较大的环境因子主要有:  光周期  (photoperiod)、温度和营养等。耳石的形成与鱼类生活的环境密切相关。 因此，本申请人惊喜的发现鱼类耳石的元素和同位素均能指示鱼类生长环境从而 可以对鱼类的产地进行识别，通过检测鱼类耳石的元素和同位素识别鱼类产地，检测结果 可靠性好，精确度高，且普适性和推广性更好。 本发明进一步设置为：根据建立的数据库数据建立预测模型的步骤中通过判别分 析、聚类分析或人工神经网络方法来进行模型计算，并采用相应的验证方法对耳石预测模 型进行判别准确率的验证。 通过建立预测模型的方法，能够明显增加检测结果的可靠性和准确度。人工神经 网络算法模拟生物神经网络，是一类模式匹配算法。通常用于解决分类和回归问题。用于本 发明，能够对数据库的信息进行分类，使得测试准确度和可靠性更高。聚类算法都试图找到 数据的内在结构，以便按照最大的共同点将数据进行归类，用于本发明，也利于数据库的分 类和分析。 本发明进一步设置为：将元素含量及碳氧同位素含量建立数据库的步骤如下： 收集样品中元素含量以及同位素比值，并对数据进行标准化或归一化处理，标准化方 法为直线型、折线型方法或曲线型方法； 归一化处理方法为min-max标准化，Z-score标准化或Sigmoid函数法； 通过不同的归一化方法优选出最佳数据归一化方法，归一化方法为：将所有数据取绝 对值后，计算自然对数是最佳的数据归一化方法； 或者，在不考虑最终计算结果的情况下，选择将数据映射到（0，1）之间或者（-1，1）之 5 CN 111610248 A 说　明　书 3/11 页 间。 通过对数据库的数据进行标准化或归一化处理，利用标准化或归一化后的数据进 行数据分析。各指标值都处于同一个数量级别上，可以进行综合测评分析。归一化后加快了 梯度下降求最优解的速度，并提高了精度。经测试，采用上述方式归一化均能得到较为理想 的数据结果。 本发明进一步设置为：将标准化或归一化处理后的数据按照国家进行分组，作为 模型的训练集；利用深度神经网络对经过归一化处理的训练集进行学习，深度神经网络的 算法为受限波尔兹曼机，深度信念网络（Deep  Belief  Networks），卷积网络或堆栈式自动 编码器。 深度神经网络是人工神经网络的发展，利用深度神经网络对经过归一化处理的训 练集进行学习，能够显著提高方法的准确性和可靠性。 本发明进一步设置为：建立预测模型的方法为人工神经网络方法，人工神经网络 采用SPSS作为软件实施实体，将所述训练集中的样本输入至深度神经网络中；利用所述深 度神经网络进行信息提取，并输出目标信息；通过反向传播算法对所述深度神经网络进行 优化训练，并对所述人工神经网络中的参数进行优化；最终建立可靠的人工神经网络模型。 将数据库的数据进行标准化或归一化处理，处理后的数据再经过人工神经网络方 法建立预测模型，能够更好的提高检测结果的可靠性和准确性。 本发明进一步设置为：建立预测模型后对模型进行验证，将所述测试集中的一个 测试样品输入至人工神经网络模型中，通过所述深度神经网络模型自动为所述测试点计算 分组的概率。 本发明进一步设置为：建立预测模型后对模型进行验证，验证方法为留一法，将某 一个已知产地的样品取出，剩余样品建模然后将取出的样品带入模型判断产地，将数据库 中所有样品重复上述过程，正确判别的样品除以总体样本数即为模型的验证准确率； 或者验证方法采用独立样本验证的方法，将数据库样品分成70%和30%两部分，70%样品 作为训练集用于模型建立，30%的样品作为验证集带入模型判别，最后计算准确率； 或者采用交叉验证法验证，建立预测模型后对模型进行验证，交叉验证方法为5-fold 法，将样品等分为5份，将其中20%样品作为验证集，剩余样品作为训练集训练模型，获得验 证集的准确率，将数据库中剩余样品重复上述过程，5次模型的准确率平均值即为模型的验 证准确率。 通过采用上述技术方案，能够进一步提高检测结果的可靠性和准确性。 本发明进一步设置为：  分析鱼类耳石中元素含量，要分析的元素为稀土元素以及 Ca、Al、Sr、  Fe、Na、K  、Cl； 其中要分析的稀土元素包含镧（La）、铈（Ce）、镨(Pr)、钕(Nd)、钷(Pm)、钐(Sm)、铕(Eu)、 钆(Gd)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)、镥(Lu)、钇（Y）、钪（Sc）中的两种 以上。 基于耳石矿物质组成与水环境中物理化学条件的密切关系，利用耳石矿物质成分 示踪水质状况和水域地质背景。因此元素含量组成可以一定程度上反应鱼类生活地的元素 含量分布特征。作为生物成因碳酸盐矿物载体的鱼耳石,其氧同位素具有温度计的属性，国 际上已经开展了较多的研究。一般认为,鱼耳石形成时在文石矿物和周围水环境之间达到 6 CN 111610248 A 说　明　书 4/11 页 (或接近达到)同位素平衡,  因而18O/16O 的同位素分馏与水的温度密切相关。水温就是指 示产地的很好的指标。碳氮硫同位素与周围水域中多种代谢源的同位素密切相关，即碳稳 定同位素液能反应鱼类食物来源信息。 通过采用上述技术方案，分析元素的种类更加全面，检测结果也更加可靠和准确。 优选的，要分析的稀土元素包含镧（La）、钕(Nd)、钆(Gd)、铥(Tm)、钇（Y）、钪（Sc）。 上述稀土元素在耳石中含量相对较高，易于定量测定，是主要的表征产地的稀土元素。 本发明进一步设置为：取鱼的耳石外侧到中心2/3的位置样品。 鱼的耳石外侧到中心约2/3的位置样品，代表鱼类生长时期，核心1/3的样品代表 鱼的幼年时期信息。很多鱼类的幼年时期与成年时期的生活地都有差异，因此选取鱼的耳 石外侧到中心约2/3的位置样品，能够更好的追溯成鱼的产地。 本发明进一步设置为：耳石前处理包括以下步骤： 耳石清洗晾干，研磨后过60目筛； 将样品分成m和n两部分，耳石样品m加入盐酸和硝酸形成的混合酸中，进行加压加热消 解，消解后定容后备用； 将溶液加热赶酸； 经无机滤膜过滤后定容，得到的溶液用于分析耳石元素含量； 样品n在氦气氛围下加入磷酸，水浴加热2-8h，冷却到室温，将磷酸酸化产生的CO2气体 用于分析耳石中的碳氧稳定同位素比值； 耳石主要成分是碳酸钙，磷酸可以把耳石消解释放CO2，CO2作为耳石中碳氧同位素的 表现形式进入同位素质谱分析CO2的稳定同位素，指代耳石中的碳氧同位素比值，也可以用 硫酸和盐酸，但是这两种酸的反应比较剧烈，且对设备有一定的伤害，磷酸最佳。不能用硝 酸，会有氮氧化物干扰质谱。 优选的，盐酸和硝酸形成的混合酸中盐酸和硝酸的体积比=3:1；加压加热消解过 程中加热温度为120-140℃，并置于高压消解罐中；加热赶酸的温度为80-99℃； 优选的，样品n在加入磷酸前先用压力0.2-0.4bar的氦气置换容器内的空气；水浴加热 的温度为T1，80≤T1＜100℃；无机滤膜的孔径为0.22μm。 通过控制加压加热消解过程中加热温度，既可以快速消解，又能保护设备。加热赶 酸利于加快赶酸。 用压力0.2-0.4bar的氦气置换容器内的空气过程中，压力过大浪费氦气，且会造 成气流不稳定，影响后续的样品分析，过小的气压会导致底部的空气置换不完全。因为本申 请中同位素分析使用氦气作为载气，清洗用的气体也使用氦气，氮气会在质谱内形成氮氧 化物影响分析，氩气会带来一些本底效应。 T1温度下水浴加热2-8h利于反应完全，水浴温度越高反应速度越快，但是  100℃ 水会沸腾，不利于反应的稳定进行，实验证明T1温度下都可以反应完全，99℃下2小时基本 就可以了，80℃反应时间至少要延长到4小时。 综上所述，本发明的有益技术效果至少包含以下一种： 1.本发明创造性的提成了采用耳石作为市售鱼类产地的表征对象，采用耳石碳氧稳定 同位素比值检测方法作为区分鱼类产地的特征来源，原理更清晰，比传统方法更能代表产 地信息，再配合本发明的检测方法，能够更准确、可靠的判别鱼类的产地，更具有普适性和 7 CN 111610248 A 说　明　书 5/11 页 推广性。 2.  检测对象耳石成分简单，稳定性更好。本发明还进一步对耳石进行更细致的研 究，根据耳石中心到外源的距离估算鱼类不同时期生活地的特征，使得测试结果更加准确 可靠。 3.  本发明采用稀土元素作为元素分析的指标，并采用HR-ICP-MS（高分辨电感耦 合等离子质谱）作为分析手段，采用人工神经网络、判别分析以及聚类分析等统计学建模。 采用新型统计学方法可以准确判别产地以及计算准确率。对于三文鱼的产地判别，模型判 别率高达100%，留一法验证准确率达到93.5%。对于金枪鱼、鳕鱼的产地判别，模型判别准确 率均高于96%，留一法验证准确率达到93%以上 4.本发明先建立数据库，并对数据库的数据进行归一化处理，再通过深度神经网络方 法建立预测模型，模型的准确度和可靠度也更高，进而利于提高判别的准确性和可靠性。 5.本发明适用于各种鱼类的产地溯源，还可以检测死亡甚至肉体腐烂的鱼类的产 地。经检测，本发明用来检测海鱼（比如金枪鱼，三文鱼，鳕鱼等）的产地来源，准确度和可靠 性都更高。同时本发明还可以与其他技术一起共同确定鱼类的产地来源，检测方法适用范 围更广。 附图说明 图1为本发明鉴别鱼类产地的方法的流程图； 图2为4个国家鱼类样品的产地溯源分类图（采用判别分析模型）。