技术摘要：
本发明涉及分子生物学与生物医药技术领域，具体涉及一种用于治疗膀胱过度活动症的基因和载体及其应用；所述基因为靶向HPSE2基因或CDS序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示；该重组腺病毒利用重组腺病毒系统，将携带上述外源基因的腺病毒穿梭质粒与不携带 全部
背景技术：
膀胱过度活动症(Overactive bladder,OAB)是指以尿频、尿急伴(或不伴)尿痛为 主要表现，不伴有泌尿系统感染或其它确切下尿路泌尿系统疾病的症候群。患有该疾病的 患者常伴有急迫性尿失禁、尿频和夜尿增多等其它症状，严重影响患者的休息、社交及其它 日常生活质量。该疾病在西方国家的发病率很高，在8.0-13.9％之间。国内膀胱过度活动症 的发病率也非常高，尤其是40岁以上人群，其主要特点是不明原因的尿频、尿急、尿失禁，反 复就医而病情无法得到较好的控制。 膀胱过度活动症病因复杂，缺乏有效的治疗手段。膀胱过度活动症的本质是膀胱 在贮尿过程中，逼尿肌未被充分抑制，而产生无意识的收缩。膀胱的调节非常的复杂，需要 交感神经、副交感神经和体神经的协调动作，同时还受到局部反射控制。引起膀胱收缩的受 体有胆碱能受体 (由神经细胞来源的乙酰胆碱触发)、嘌呤碱能受体(由膀胱上皮来源的 ATP触发)及其它受体(如受神经控制分泌的肾上腺素触发等)。这些受体或其下游信号分子 表达异常、敏感性增强，或者刺激递质增加，均可能造成膀胱不受控制的收缩，引起膀胱过 度活动症。 膀胱过度活动症的治疗方式主要有膀胱行为训练及药物治疗两类，效果均不理 想。膀胱过度活动症主要的药物治疗手段是使用毒蕈碱受体 M3阻滞剂，如盐酸奥昔布宁 (Oxybutynin Chloride)、酒石酸托特罗定 (Tolterodine Tartrate)等。由于M3受体是引 发膀胱排尿的主要受体，使用其阻滞剂可在一定程度上缓解膀胱过度活动症。同时，毒蕈碱 受体M3 在中枢神经、唾液腺、汗腺、泪腺、胃肠道等器官中也具有重要功能，因而50％以上 患者使用抗胆碱能药物后出现口干、眼干、皮肤干澡、便泌及眩晕等不良反应。亦有研究证 明，使用M3受体阻滞剂会减低逼尿肌收缩力，影响膀胱的排尿，有尿不尽，尿潴留的风险。上 述结果提示， M3受体阻滞剂在治疗膀胱过度活动症时，其机制很可能是以牺牲生理条件下 逼尿肌的收缩能力为代价，改善膀胱过度活动症症状。
技术实现要素：
本发明第一目的是针对目前用于膀胱过度活动症治疗药物副作用大、疗效差的不 足，研发新型药物，以期减低药物的毒副作用、提升药物疗效。本发明提供了一种用于治疗 膀胱过度活动症的基因及其应用。 为实现上述目的，本发明所设计一种用于治疗膀胱过度活动症的基因，所述基因 为靶向HPSE2基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。 上述HPSE2的功能缺失引发了膀胱过度活动症，生物信息学预测 HPSE2具有与 HPSE1(heparanase 1)相同的糖苷水解酶79家族(Glycosyl hydrolase family 79)结构 3 CN 111575303 A 说 明 书 2/5 页 域，但至今为止并未检测到其具有相关酶活性。有研究提示HPSE2具有与硫酸类肝素蛋白多 糖结合的能力，因此推测， HPSE2能与HPSE1竞争结合胞外基质，抑制其降解胞外基质的功 能，所以HPSE2又被称为“无活性乙酰肝素酶(inactive heparanase)”。因此，寻找增强 HPSE2功能的靶向治疗手段可能成为治疗膀胱过度活动症的新策略。 作为优选方案，所述基因为靶向HPSE2基因中的CDS序列，其中，所述CDS序列核苷 酸序列如SEQ ID No.2所示。 本发明还提供了一种用于治疗膀胱过度活动症的重组腺病毒，所述重组腺病毒为 含有权利要求1～2任意一项所述的基因的腺病毒。该重组腺病毒转染哺乳动物细胞内可以 表达HPSE2，并且可以正常发挥其功能。 上述用于治疗膀胱过度活动症的重组腺病毒的方法，包括以下步骤： 1)利用重组腺病毒系统，将携带外源HPSE2基因或CDS序列的腺病毒穿梭质粒 (GV314,如图1所示)与不携带腺病毒基因组的包装质粒 (pBHG，如图2所示)共转染HEK293 细胞， 2)通过Cre/loxP重组酶系统的作用实现重组，构建高表达HPSE2 的重组腺病毒， 即权利要求1～2任意一项所述的基因。 采用DNA重组技术，成功构建一种能够促进HPSE2基因表达的腺病毒载体。利用基 因敲除技术得到了HPSE2缺陷小鼠用于本发明，通过转染实验将HPSE2高表达载体转入小鼠 成肌细胞C2C12中，体外将细胞分化为肌束，然后给与聚集蛋白(Agrin)刺激，与对照组相 比，HPSE2 高表达载体可以明显抑制乙酰胆碱受体的聚集。上述结果提示我们， HPSE2可以 抑制肌肉的收缩，进而改善膀胱过度活动的症状。同时，我们利用基因敲除技术得到了 HPSE2缺陷小鼠，通过尿动力学分析，我们发现HPSE2基因敲除鼠排尿频率、排尿压力增加， 每次排尿体积减少，表明HPSE2基因缺失会导致膀胱过度活动。同时，HPSE2基因缺陷小鼠膀 胱组织的透明质酸含量明显下降，而透明质酸可以用于膀胱过度活动的治疗，这为预防和 治疗膀胱过度活动症提供了理论依据和临床基础。 本发明还提供了一种上述基因在制备治疗膀胱过度活动症的药物中的应用。 本发明还提供了一种上述重组腺病毒在制备治疗膀胱过度活动症的药物中的应 用。 本发明以HPSE2为靶基因，设计可促进HPSE2表达的载体,通过 DNA重组技术获得 该载体。经腺病毒包装后直接转染哺乳动物的细胞，通过增强HPSE2的表达来预防或治疗膀 胱过度活动症。 本发明的有益效果： 本发明运用DNA重组及相关技术探明了HPSE2基因沉默能够导致膀胱过度活动症 的发生，减少透明质酸的含量；同时，增强HPSE2的表达可减少乙酰胆碱受体的聚集进而减 弱肌肉的收缩。综上所述，HPSE2 可成为一种全新的预防和治疗膀胱过度活动症等相关疾 病的靶点，对发明一个针对多种病因、最佳的、副作用最少的治疗药物或制剂有着极其重要 的意义，为制备相关药物或制剂提供了新的选择，有着广阔的应用前景。 本发明利用DNA重组技术及基因敲除小鼠，研究HPSE2基因沉默或高表达对动物和 人类膀胱功能所起的作用，从而确定HPSE2可成为一种全新的治疗膀胱过度活动症的靶点。 对发明一种针对HPSE2的靶向治疗方法有着极其重要的意义。 4 CN 111575303 A 说 明 书 3/5 页 附图说明 图1：GV314载体图谱。 图2：pBHG(pBHG loxΔE1,3Cre)载体图谱。 图3：将Ad-HPSE2和空白对照腺病毒转染293T细胞，48小时后收集蛋白，经免疫印 迹检测HPSE2的表达，以GAPDH作为内参。HPSE2 过表达腺病毒载体在293T细胞中成功表达。 图4：HPSE2调节Ach刺激下膀胱逼尿肌的收缩力。取6周龄B6 小鼠，将其膀胱逼尿 肌剪成1.5×2.5mm肌肉条，分别使用Ad-HPSE2， Ad-shRNA和Ad-scramble RNA转染肌肉条， 建立HPSE2高表达，抑制及对照三组。3天后经肌动扫描记录仪检测逼尿肌在不同Ach浓度刺 激下的拉力。A)离体组织浴槽系统；B)典型的肌肉条收缩力检测结果及转染腺病毒后的膀 胱逼尿肌肌肉条的绿色荧光蛋白表达情况；C)逼尿肌在 Ach刺激后的收缩力变化曲线统计 图(n＝3)。 图5：HPSE2可抑制乙酰胆碱受体的聚集。取小鼠肌细胞系C2C12，分别转染Ad- HPSE2 Ad-Scramble ShRNA或者Ad-HPSE2 Ad-ShRNA，建立高表达HPSE2及抑制表达两组，然 后使用2％马血清将其诱导为多核的肌束，然后再使用重组Agrin(10uM)诱导乙酰胆碱受体 的聚集，再使用罗丹明偶联的α银环蛇毒素标记聚集的乙酰胆碱受体，共聚焦显微镜观察拍 照后对聚集数量进行标注及统计。典型的肌束中的AchR聚集图片(箭头指示的部位)。 图6：小鼠膀胱组织中HPSE2表达检测。分别提取常规HPSE2基因敲除小鼠及野生型 小鼠膀胱组织蛋白后，经免疫印迹检测HPSE2的表达。 WT代表野生型小鼠(n＝3) ,Hpse2-/- 代表HPSE2基因敲除鼠(n＝3)。 图7:全身诱导HPSE2基因敲除小鼠尿动力学检测。A)取10周龄的野生型和全身诱 导HPSE2基因敲除小鼠，待小鼠成年后，注射他莫西酚诱导HPSE2基因敲除。6周后对小鼠行 膀胱插管手术，检测小鼠尿道动力学相关指标。B)小鼠排尿体积，C)排尿时间间隔及D)最高 排尿压统计结果(n＝6)。 图8：常规HPSE2基因敲除小鼠膀胱乙酰胆碱受体聚集检测。取新生野生型及常规 HPSE2基因敲除小鼠膀胱组织进行免疫荧光检测。A)以罗丹明(红色)偶联的α银环蛇毒素标 记指示总Ach受体；B)以兔抗乙酰胆碱M3受体的一抗，FITC标记(绿色)的羊抗兔二抗指示 Ach受体 M3。
本发明涉及分子生物学与生物医药技术领域，具体涉及一种用于治疗膀胱过度活动症的基因和载体及其应用；所述基因为靶向HPSE2基因或CDS序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示；该重组腺病毒利用重组腺病毒系统，将携带上述外源基因的腺病毒穿梭质粒与不携带 全部
背景技术：
膀胱过度活动症(Overactive bladder,OAB)是指以尿频、尿急伴(或不伴)尿痛为 主要表现，不伴有泌尿系统感染或其它确切下尿路泌尿系统疾病的症候群。患有该疾病的 患者常伴有急迫性尿失禁、尿频和夜尿增多等其它症状，严重影响患者的休息、社交及其它 日常生活质量。该疾病在西方国家的发病率很高，在8.0-13.9％之间。国内膀胱过度活动症 的发病率也非常高，尤其是40岁以上人群，其主要特点是不明原因的尿频、尿急、尿失禁，反 复就医而病情无法得到较好的控制。 膀胱过度活动症病因复杂，缺乏有效的治疗手段。膀胱过度活动症的本质是膀胱 在贮尿过程中，逼尿肌未被充分抑制，而产生无意识的收缩。膀胱的调节非常的复杂，需要 交感神经、副交感神经和体神经的协调动作，同时还受到局部反射控制。引起膀胱收缩的受 体有胆碱能受体 (由神经细胞来源的乙酰胆碱触发)、嘌呤碱能受体(由膀胱上皮来源的 ATP触发)及其它受体(如受神经控制分泌的肾上腺素触发等)。这些受体或其下游信号分子 表达异常、敏感性增强，或者刺激递质增加，均可能造成膀胱不受控制的收缩，引起膀胱过 度活动症。 膀胱过度活动症的治疗方式主要有膀胱行为训练及药物治疗两类，效果均不理 想。膀胱过度活动症主要的药物治疗手段是使用毒蕈碱受体 M3阻滞剂，如盐酸奥昔布宁 (Oxybutynin Chloride)、酒石酸托特罗定 (Tolterodine Tartrate)等。由于M3受体是引 发膀胱排尿的主要受体，使用其阻滞剂可在一定程度上缓解膀胱过度活动症。同时，毒蕈碱 受体M3 在中枢神经、唾液腺、汗腺、泪腺、胃肠道等器官中也具有重要功能，因而50％以上 患者使用抗胆碱能药物后出现口干、眼干、皮肤干澡、便泌及眩晕等不良反应。亦有研究证 明，使用M3受体阻滞剂会减低逼尿肌收缩力，影响膀胱的排尿，有尿不尽，尿潴留的风险。上 述结果提示， M3受体阻滞剂在治疗膀胱过度活动症时，其机制很可能是以牺牲生理条件下 逼尿肌的收缩能力为代价，改善膀胱过度活动症症状。
技术实现要素：
本发明第一目的是针对目前用于膀胱过度活动症治疗药物副作用大、疗效差的不 足，研发新型药物，以期减低药物的毒副作用、提升药物疗效。本发明提供了一种用于治疗 膀胱过度活动症的基因及其应用。 为实现上述目的，本发明所设计一种用于治疗膀胱过度活动症的基因，所述基因 为靶向HPSE2基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。 上述HPSE2的功能缺失引发了膀胱过度活动症，生物信息学预测 HPSE2具有与 HPSE1(heparanase 1)相同的糖苷水解酶79家族(Glycosyl hydrolase family 79)结构 3 CN 111575303 A 说 明 书 2/5 页 域，但至今为止并未检测到其具有相关酶活性。有研究提示HPSE2具有与硫酸类肝素蛋白多 糖结合的能力，因此推测， HPSE2能与HPSE1竞争结合胞外基质，抑制其降解胞外基质的功 能，所以HPSE2又被称为“无活性乙酰肝素酶(inactive heparanase)”。因此，寻找增强 HPSE2功能的靶向治疗手段可能成为治疗膀胱过度活动症的新策略。 作为优选方案，所述基因为靶向HPSE2基因中的CDS序列，其中，所述CDS序列核苷 酸序列如SEQ ID No.2所示。 本发明还提供了一种用于治疗膀胱过度活动症的重组腺病毒，所述重组腺病毒为 含有权利要求1～2任意一项所述的基因的腺病毒。该重组腺病毒转染哺乳动物细胞内可以 表达HPSE2，并且可以正常发挥其功能。 上述用于治疗膀胱过度活动症的重组腺病毒的方法，包括以下步骤： 1)利用重组腺病毒系统，将携带外源HPSE2基因或CDS序列的腺病毒穿梭质粒 (GV314,如图1所示)与不携带腺病毒基因组的包装质粒 (pBHG，如图2所示)共转染HEK293 细胞， 2)通过Cre/loxP重组酶系统的作用实现重组，构建高表达HPSE2 的重组腺病毒， 即权利要求1～2任意一项所述的基因。 采用DNA重组技术，成功构建一种能够促进HPSE2基因表达的腺病毒载体。利用基 因敲除技术得到了HPSE2缺陷小鼠用于本发明，通过转染实验将HPSE2高表达载体转入小鼠 成肌细胞C2C12中，体外将细胞分化为肌束，然后给与聚集蛋白(Agrin)刺激，与对照组相 比，HPSE2 高表达载体可以明显抑制乙酰胆碱受体的聚集。上述结果提示我们， HPSE2可以 抑制肌肉的收缩，进而改善膀胱过度活动的症状。同时，我们利用基因敲除技术得到了 HPSE2缺陷小鼠，通过尿动力学分析，我们发现HPSE2基因敲除鼠排尿频率、排尿压力增加， 每次排尿体积减少，表明HPSE2基因缺失会导致膀胱过度活动。同时，HPSE2基因缺陷小鼠膀 胱组织的透明质酸含量明显下降，而透明质酸可以用于膀胱过度活动的治疗，这为预防和 治疗膀胱过度活动症提供了理论依据和临床基础。 本发明还提供了一种上述基因在制备治疗膀胱过度活动症的药物中的应用。 本发明还提供了一种上述重组腺病毒在制备治疗膀胱过度活动症的药物中的应 用。 本发明以HPSE2为靶基因，设计可促进HPSE2表达的载体,通过 DNA重组技术获得 该载体。经腺病毒包装后直接转染哺乳动物的细胞，通过增强HPSE2的表达来预防或治疗膀 胱过度活动症。 本发明的有益效果： 本发明运用DNA重组及相关技术探明了HPSE2基因沉默能够导致膀胱过度活动症 的发生，减少透明质酸的含量；同时，增强HPSE2的表达可减少乙酰胆碱受体的聚集进而减 弱肌肉的收缩。综上所述，HPSE2 可成为一种全新的预防和治疗膀胱过度活动症等相关疾 病的靶点，对发明一个针对多种病因、最佳的、副作用最少的治疗药物或制剂有着极其重要 的意义，为制备相关药物或制剂提供了新的选择，有着广阔的应用前景。 本发明利用DNA重组技术及基因敲除小鼠，研究HPSE2基因沉默或高表达对动物和 人类膀胱功能所起的作用，从而确定HPSE2可成为一种全新的治疗膀胱过度活动症的靶点。 对发明一种针对HPSE2的靶向治疗方法有着极其重要的意义。 4 CN 111575303 A 说 明 书 3/5 页 附图说明 图1：GV314载体图谱。 图2：pBHG(pBHG loxΔE1,3Cre)载体图谱。 图3：将Ad-HPSE2和空白对照腺病毒转染293T细胞，48小时后收集蛋白，经免疫印 迹检测HPSE2的表达，以GAPDH作为内参。HPSE2 过表达腺病毒载体在293T细胞中成功表达。 图4：HPSE2调节Ach刺激下膀胱逼尿肌的收缩力。取6周龄B6 小鼠，将其膀胱逼尿 肌剪成1.5×2.5mm肌肉条，分别使用Ad-HPSE2， Ad-shRNA和Ad-scramble RNA转染肌肉条， 建立HPSE2高表达，抑制及对照三组。3天后经肌动扫描记录仪检测逼尿肌在不同Ach浓度刺 激下的拉力。A)离体组织浴槽系统；B)典型的肌肉条收缩力检测结果及转染腺病毒后的膀 胱逼尿肌肌肉条的绿色荧光蛋白表达情况；C)逼尿肌在 Ach刺激后的收缩力变化曲线统计 图(n＝3)。 图5：HPSE2可抑制乙酰胆碱受体的聚集。取小鼠肌细胞系C2C12，分别转染Ad- HPSE2 Ad-Scramble ShRNA或者Ad-HPSE2 Ad-ShRNA，建立高表达HPSE2及抑制表达两组，然 后使用2％马血清将其诱导为多核的肌束，然后再使用重组Agrin(10uM)诱导乙酰胆碱受体 的聚集，再使用罗丹明偶联的α银环蛇毒素标记聚集的乙酰胆碱受体，共聚焦显微镜观察拍 照后对聚集数量进行标注及统计。典型的肌束中的AchR聚集图片(箭头指示的部位)。 图6：小鼠膀胱组织中HPSE2表达检测。分别提取常规HPSE2基因敲除小鼠及野生型 小鼠膀胱组织蛋白后，经免疫印迹检测HPSE2的表达。 WT代表野生型小鼠(n＝3) ,Hpse2-/- 代表HPSE2基因敲除鼠(n＝3)。 图7:全身诱导HPSE2基因敲除小鼠尿动力学检测。A)取10周龄的野生型和全身诱 导HPSE2基因敲除小鼠，待小鼠成年后，注射他莫西酚诱导HPSE2基因敲除。6周后对小鼠行 膀胱插管手术，检测小鼠尿道动力学相关指标。B)小鼠排尿体积，C)排尿时间间隔及D)最高 排尿压统计结果(n＝6)。 图8：常规HPSE2基因敲除小鼠膀胱乙酰胆碱受体聚集检测。取新生野生型及常规 HPSE2基因敲除小鼠膀胱组织进行免疫荧光检测。A)以罗丹明(红色)偶联的α银环蛇毒素标 记指示总Ach受体；B)以兔抗乙酰胆碱M3受体的一抗，FITC标记(绿色)的羊抗兔二抗指示 Ach受体 M3。
