技术摘要：
本发明涉及用于免疫治疗方法的肽、蛋白质、核酸和细胞。特别是，本发明涉及癌症的免疫疗法。本发明还涉及单独使用或与其他肿瘤相关肽(刺激抗肿瘤免疫反应或体外刺激T细胞和转入患者的疫苗复合物的活性药物成分)联合使用的肿瘤相关T细胞(CTL)肽表位。与主要组织相容性复 全部
背景技术：
部分， 并作为参考文献引用。 [0268] 本发明还涉及适体。适体(例如，参见WO 2014/191359及其中引用的文献)是短的 单链核酸分子，其可以折叠为所定义的三维结构并识别特定的靶标结构。它们似乎是开发 靶向治疗的合适替代方法。适体已显示可选择性与具有高亲和力和特异性的复合体靶标相 47 CN 111548406 A 说 明 书 45/93 页 结合。 [0269] 识别细胞表面分子的适体在过去十年内已经确定，并为开发诊断和治疗方法提供 了手段。由于适体已显示几乎无毒性和免疫原性，因此，它们是生物医学应用中有前景的候 选物质。事实上适体，例如前列腺特异性膜抗原识别适体，已被成功地用于靶向治疗并在体 内模型的异种移植物中显示出功能。此外，认识到特定肿瘤细胞系的适体也已确定。 [0270] 可选择DNA适体来揭示各种癌细胞的广谱识别属性，特别是那些来自于实体瘤的 细胞，而非致瘤和主要健康细胞不被识别。如果所识别的适体不仅识别肿瘤特异性子类型， 而且与一系列肿瘤相互作用，这使适体适用于作为所谓的广谱诊断和治疗手段。 [0271] 此外，用流式细胞仪对细胞结合行为的研究显示，适体在纳摩尔范围内显示出很 好的亲和力。 [0272] 适体用于诊断和治疗目的。此外，也可能显示，一些适体被肿瘤细胞吸取，因而可 作为抗癌剂靶向递送的分子赋形剂，例如siRNA进入肿瘤细胞。 [0273] 可选择适体针对复合体的靶标，如细胞和组织以及包含、优选包括根据任何SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 268的一个序列、根据当前发明的肽复合体与MHC分子，使用细胞 SELEX(透过指数富集的配体系统进化)技术。 [0274] 本发明中的肽可用于生成和开发出针对MHC/肽复合物的特定抗体。这些抗体可用 于治疗，将毒素或放射性物质靶向病变组织。这些抗体的另一用途是为了成像之目的(如 PET)将放射性核素靶向病变组织。这可有助于检测小转移灶或确定病变组织的大小和准确 位置。 [0275] 因此，本发明的另一方面是提出产生特异性结合至与HLA限制性抗原络合的I或II 类人主要组织相容性复合体(MHC)的一种重组抗体的方法，该方法包括：用可溶形式的与 HLA限制性抗原(优选为根据本发明的肽)络合的(MHC)I或II类分子对包含表达所述主要组 织相容性说复合体(MHC)I或II类的基因工程非人哺乳动物进行免疫；将mRNA分子与产生所 述非人哺乳动物细胞的抗体分离；产生一个噬菌体显示库，显示由所述mRNA分子编码的蛋 白分子；以及将至少一个噬菌体与所述噬菌体显示库分离，所述的至少一个噬菌体显示所 述抗体特异性地结合至与HLA限制性抗原络合的所述人主要组织相容性说复合体(MHC)I或 II类。 [0276] 因此，本发明的另一方面提出一种抗体，其特异性结合至与一种HLA限制性抗原络 合的I或II类人主要组织相容性说复合体(MHC)，其中该抗体优选为多克隆抗体、单克隆抗 体、双特异性抗体和/或嵌合抗体。 [0277] 产生这种抗体和单链I类主要组织相容性复合物的相应方法，以及产生这些抗体 的其他工具在WO 03/068201、WO 2004/084798、WO 01/72768、WO 03/070752以及出版物 (Cohen et al.,2003a；Cohen et al.,2003b；Denkberg et al.,2003)中进行了披露，为了 本发明之目的，所有参考文献透过引用被完整地并入本文。 [0278] 优选地，该抗体与复合体的结合亲和力低于20纳摩尔，优选为低于10纳摩尔，这在 本发明情况下也被视为具有「特异性」。 [0279] 本发明涉及一种肽，包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:268组成的组的一个序列 或该序列的与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:268具有88％同源性(优选为相同)的一种变体，或 诱导与所述变异肽发生T细胞交叉反应的一种变体，其中，所述肽不是基本的全长多肽。 48 CN 111548406 A 说 明 书 46/93 页 [0280] 本发明进一步涉及一种肽，包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:268组成的组的一 个序列、或与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:268具有至少88％同源性(优选为相同)的一种变 体，其中所述肽或变体的总长度为8至100个、优选为8至30个、最优选为8至14个氨基酸。 [0281] 本发明进一步涉及本发明的肽，其具有与主要组织相容性复合体(MHC)I或II类分 子结合的能力。 [0282] 本发明进一步涉及本发明中的肽，其中肽系由或基本系由根据SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:268的一个氨基酸序列组成。 [0283] 本发明进一步涉及本发明的肽，其中该肽(在化学上)被修饰和/或包含非肽键。 [0284] 本发明进一步涉及本发明的肽，其中该肽为融合蛋白的一部分，特别包括HLA-DR 抗原相关不变链(Ii)的N-端氨基酸，或其中该肽与一种抗体(例如，树突状细胞特定抗体) 融合。 [0285] 本发明进一步涉及一种核酸，其编码本发明所述肽，前提是该肽并非完整(完全) 的人蛋白。 [0286] 本发明进一步涉及一种本发明的核酸，为DNA、cDNA、PNA、RNA，也可能为其组合物。 [0287] 本发明进一步涉及一种能表达本发明核酸的表达载体。 [0288] 本发明进一步涉及本发明的一种肽、本发明的一种核酸或本发明的一种药用表达 载体，特别是用于治疗结直肠癌、胶质母细胞瘤、胃癌、肝细胞癌、肾细胞癌。 [0289] 本发明进一步涉及含本发明核酸或本发明表达载体的一种宿主细胞。 [0290] 本发明进一步涉及本发明的宿主细胞，其为抗原提呈细胞，优选为树突细胞。 [0291] 本发明进一步涉及配制本发明一种肽的一种方法，所述方法包括培养本发明的宿 主细胞和从所述宿主细胞或其培养基中分离肽。 [0292] 本发明进一步涉及本发明中的方法，其中抗原透过与足够量的含抗原提成细胞的 抗原结合被载入表达于合适抗原提呈细胞表面的I或II类MHC分子。 [0293] 本发明进一步涉及本发明的方法，其中该抗原提呈细胞包括一个表达载体，该载 体有能力表达含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:268的肽或所述变体氨基酸序列。 [0294] 本发明进一步涉及以本发明方法制造的启动T细胞，其中所述T细胞有选择性地识 别一种细胞，该细胞异常表达含一种本发明氨基酸序列的多肽。 [0295] 本发明进一步涉及一种杀伤患者靶细胞的方法，其中患者的靶细胞异常表达含本 发明任何氨基酸序列的多肽，该方法包括给予患者本发明的有效量T细胞。 [0296] 本发明进一步涉及任何所述肽、本发明的一种核酸、本发明的一种表达载体、本发 明的一种细胞、本发明一种作为药剂或制造药剂的启动细胞毒性T淋巴细胞的用途。本发明 进一步涉及一种本发明的用途，其中药剂可有效抗癌。 [0297] 本发明进一步涉及一种本发明的用途，其中该药剂为一种疫苗。本发明进一步涉 及一种本发明的用途，其中药剂可有效抗癌。 [0298] 本发明进一步涉及一种本发明的用途，其中所述癌细胞为结直肠癌、胶质母细胞 瘤、胃癌、肝细胞癌、肾细胞癌细胞或其他实体或血液肿瘤细胞，例如：慢性淋巴细胞白血 病、慢性骨髓性白血病、急性骨髓性白血病和其他淋巴瘤(如：非霍奇金淋巴瘤)、移植后淋 巴增殖性疾病(PTLD)以及其他骨髓瘤(如：原发性骨髓纤维化)、原发性血小板减少症、真性 红血球增多症、以及其他肿瘤、如：食道癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌、 49 CN 111548406 A 说 明 书 47/93 页 黑色素瘤、乳腺癌、胆囊癌和胆管癌、膀胱癌、子宫癌、头颈部鳞状细胞癌、间皮瘤。 [0299] 本发明进一步涉及一种基于本发明肽的特定标志物蛋白和生物标志物，在此成为 “靶标”，其可用于诊断和/或判断结直肠癌、胶质母细胞瘤、胃癌、肝细胞癌、肾细胞癌的预 后。本发明还涉及这些供癌症治疗使用的新靶点。 [0300] 本文中术语“抗体”为广义上的定义，既包括多克隆也包括单克隆抗体。除了完整 或“全部”的免疫球蛋白分子，“抗体”这一术语还包括这些免疫球蛋白分子和人源化免疫球 蛋白分子的片段(如，CDR、Fv、Fab和Fc片段)或聚合物，只要它们表现出本发明的任何期望 属性(例如，结直肠癌、胶质母细胞瘤、胃癌、肝细胞癌、肾细胞癌标志物(多)肽的特异性结 合、将毒素传递给癌症标志物基因表达水平增加时的结直肠癌、胶质母细胞瘤、胃癌、肝细 胞癌、肾细胞癌细胞和/或抑制结直肠癌、胶质母细胞瘤、胃癌、肝细胞癌、肾细胞癌志物多 肽的活性)。 [0301] 只要有可能，本发明的抗体可从商业来源购买。本发明的抗体也可能使用已知的 方法制得。技术人员会了解全长结直肠癌、胶质母细胞瘤、胃癌、肝细胞癌、肾细胞癌标志物 多肽或其片段可用于制备本发明的抗体。用于产生本发明抗体的多肽可部分或全部地由天 然源经纯化而得，也可利用重组DNA技术生产。 [0302] 例如，本发明的编码肽的cDNA，例如，该肽为根据SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:268多 肽的肽，或其中一个变体或片段，可在原核细胞中(如：细菌)或真核细胞(如：酵母、昆虫或 哺乳动物细胞)中表达，之后，可纯化重组蛋白，并用于产生一种特异性结合用于产生本发 明抗体的结直肠癌、胶质母细胞瘤、胃癌、肝细胞癌、肾细胞癌标志物多肽的单克隆或多克 隆抗体制剂。 [0303] 本领域的技术人员会认识到，两种或两种以上不同集合的单克隆抗体或多克隆抗 体能最大限度地增加获得一种含预期用途所需的特异性和亲和力(例如，ELISA法、免疫组 织化学、体内成像、免疫毒素疗法)的抗体的可能性。根据抗体的用途，用已知的方法对其期 望活性进行测试(例如，ELISA法、免疫组织化学、免疫治疗等；要获取产生和测试抗体的进 一步指导，请参阅，例如，Greenfield,2014(Greenfield,2014))。例如，该抗体可用ELISA法 或免疫印迹法、免疫组织化学染色福马林固定的癌组织或冰冻的组织切片进行检测。在初 次体外表征后，用于治疗或体内诊断用途的抗体根据已知的临床测试方法进行检测。 [0304] 此处使用的术语“单克隆抗体”系指从大量同质抗体中获得的一种抗体，即，由相 同的抗体组成的抗体群，但可能少量提呈的自然突变除外。此处所述的单克隆抗体具体包 括“嵌合”抗体，其中一部分重链和/或轻链与从特定物种中获得的抗体或属于特定抗体类 型和分类型抗体的相应序列相同(同质)，同时，剩余链与从其他物种中获得的抗体或属于 特定抗体类型和子类型抗体的相应序列以及这些抗体的片段相同(同质)，只要他们表现出 预期的拮抗活性(美国4816567号专利，其在此以其整体并入)。 [0305] 本发明的单克隆抗体可能使用杂交瘤方法制得。在杂交瘤方法中，老鼠或其他适 当的宿主动物，通常用免疫制剂以引发产生或能产生将特异性结合至免疫制剂的抗体。或 者，淋巴细胞可在体外进行免疫。 [0306] 单克隆抗体也可由DNA重组方法制得，如：美国4816567号专利所述。编码本发明单 克隆抗体的DNA可很容易地使用传统程序进行分离和测序(例如：透过使用能与编码鼠抗体 重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。 50 CN 111548406 A 说 明 书 48/93 页 [0307] 体外方法也适用于制备单价抗体。抗体消化以产生抗体的片段，尤其是Fab片段， 可以透过使用本领域已知的常规技术完成。例如，可以透过使用木瓜蛋白酶完成消化。木瓜 蛋白酶消化的实施例在WO 94/29348和美国4342566号专利中有描述。抗体的木瓜蛋白酶消 化通常产生两种相同的抗原结合性片段，称为Fab片段(每个片段都有一个抗原结合点)和 残余Fc片段。胃蛋白酶处理产生一个F(ab')2片段和一个pFc'片段。 [0308] 抗体片段，不论其是否附着于其他序列，均可包括特定区域或特定氨基酸残基的 插入、删除、替换、或其他选择性修饰，但前提是，片段的活性与非修饰的抗体或抗体片段相 比没有显著的改变或损害。这些修饰可提供一些额外的属性，如：删除/添加可与二硫键结 合的氨基酸，以增加其生物寿命、改变其分泌特性等。在任何情况下，抗体片段必须拥有生 物活性的特性，如：结合活性、调节结合域的结合力等。抗体的功能性或活性区域可透过蛋 白特定区域的基因突变、随后表达和测试所表达的多肽进行确定。这些方法为本行业技术 人员所熟知，可包括编码抗体片段的核酸的特定位点基因突变。 [0309] 本发明的抗体可进一步包括人源化抗体或人抗体。非人(如：鼠)抗体的人源化形 式为嵌合抗体免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如：Fv、Fab、Fab'或抗体的其他抗原结 合序列)，其中包含从非人免疫球蛋白中获得的最小序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白 (受体抗体)，其中来自受体互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)(如具有与 其特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠或兔子)CDR的残基取代。在某些情况下，人类免疫球 蛋白的Fv框架(FR)残基被相应的非人残基取代。人源化抗体可能还包括既非受体抗体、也 非输入CDR或框架序列中发现的残基。一般来说，人源化抗体将包括几乎所有的至少一个、 通常为二个可变域，其中，全部或几乎全部的CDR区域均对应于非人免疫球蛋白的区域并且 全部或几乎全部的FR区域均为人免疫球蛋白相同序列的区域。理想情况是，人源化抗体还 将包括至少免疫球蛋白恒定区(Fc)的一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区的一部分。 [0310] 人源化非人抗体的方法为本行业所熟知。一般来说，人源化抗体具有一个或多个 从非人源头引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基往往被称为“输入”残基，通常从“输 入”可变域中获得。人源化基本上可以透过将啮齿动物CDR或CDR序列取代为相应的人抗体 序列而完成。因此，这种“人源化”抗体为嵌合抗体(美国4816567号专利)，其中大大少于完 整的人可变域被来自于非人物种的相应序列取代。在实践中，人源化抗体通常为人抗体，其 中有些CDR残基以及可能的一些FR残基被来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基取代。 [0311] 可使用免疫后在内源性免疫球蛋白产生缺失时能产生完整人抗体的转基因动物 (如：小鼠)。例如，它被描述为，嵌合和种系突变小鼠中的抗体重链连接区域基因的纯合性 缺失导致内源性抗体生成的完全抑制。在此种系变种小鼠中人种系免疫球蛋白基因阵列的 转移在抗原挑战后将导致人抗体的生成。人抗体也可在噬菌体展示库中产生。 [0312] 本发明的抗体优选为透过药用载体的形式给予受试者。通常，在制剂中使用适量 的药用盐，以使制剂等渗。药用载体的例子包括生理盐水、林格氏液和葡萄糖溶液。溶液的 pH值优选为约5至8，更优选为约7至7.5。此外，载体还包括缓释制剂，如：含有抗体的固体疏 水性聚合物半透性基质，其中基质为有形物品形式，如：薄膜、脂质体或微粒。本行业的技术 人员熟知，某些载体可能为更优选，取决于例如，抗体的给药途径和浓度。 [0313] 该抗体可透过注射(如：静脉内、腹腔内、皮下、肌肉内)或透过输注等其他方法给 予受试者、患者或细胞，确保其以有效的形式传输到血液中。这些抗体也可以透过瘤内或瘤 51 CN 111548406 A 说 明 书 49/93 页 周途径给予，从而发挥局部和全身的治疗作用。局部或静脉注射为优选。 [0314] 抗体给药的有效剂量和时间表可根据经验确定，并且作出此类决定属本行业的技 术范围内。本行业的技术人员会明白，必须给予的抗体剂量根据以下因素会有所不同，例 如：接受抗体的受试者、给药途径、使用的抗体以及其他正在使用的药物的特定类型。单独 使用的抗体的通常日剂量可能为约1μg/kg至最多100mg/kg体重或更多，这取决于上述因 素。给予抗体，优选为结直肠癌、胶质母细胞瘤、胃癌、肝细胞癌、肾细胞癌后，治疗抗体的疗 效可透过技术人员熟知的不同方法评估。例如：接受治疗的受试者癌症的大小、数量和/或 分布可使用标准肿瘤成像技术进行监测。因治疗而给予的抗体与不给予抗体时的病程相 比，可阻止肿瘤生长、导致肿瘤缩小、和/或阻止新肿瘤的发展，这样的抗体是一种有效治疗 癌症的抗体。 [0315] 本发明的另一方面提出了制备识别特异性肽-MHC复合物的可溶性T细胞受体 (sTCR)的一种方法。这种可溶性T细胞受体可从特异性T细胞克隆中产生，并且它们的亲和 力可以透过互补决定区靶向诱变而增加。为了T细胞受体选择之目的，可以使用噬菌体展示 (美国2010/0113300，(Liddy et al.,2012))。为了在噬菌体展示期间以及实际使用为药物 时稳定T细胞受体之目的，可透过非天然二硫键、其他共价键(单链T细胞受体)或透过二聚 化结构域连接α和β链(Boulter et al.,2003；Card et al.,2004；Willcox et al.,1999)。 T细胞受体可以连接到毒素、药物、细胞因子(参见US 2013/0115191)、域招募效应细胞，如 抗CD3域等，以便对靶细胞执行特定的功能。此外，它可能表达于用于过继转移的T细胞。进 一步的资讯可在WO 2004/033685A1和WO 2004/074322A1中找到。sTCR的组合在WO 2012/ 056407A1中进行了描述。WO 2013/057586A1中公开了制备的进一步的方法。 [0316] 此外，可用本发明的肽和/或TCR或抗体或其他结合分子在活检样本的基础上验证 病理师对癌症的诊断。 [0317] 该抗体或TCR也可用于体内诊断实验。一般来说，抗体用放射性核素标记(如： 111In、99Tc、14C、131I、3H、32P或35S)，从而可免疫闪烁扫描法使肿瘤局限化。在一实施方 案中，其中的抗体或片段与两个或两个以上选自包括上述蛋白的组的蛋白质靶标的细胞外 域结合，并且亲和力值(Kd)低于1x 10μM。 [0318] 诊断用抗体可透过各种影像学方法使用适合检测的探针进行标记。探针检测方法 包括但不限于，萤光、光、共聚焦和电镜方法；磁共振成像和光谱学技术；透视、电脑断层扫 描和正电子发射断层扫描。合适的探针包括但不限于，萤光素、罗丹明、曙红及其它萤光团、 放射性同位素、黄金、釓和其他稀土、顺磁铁、氟-18和其他正电子发射放射性核素。此外，探 针可能是双功能或多功能的，并且用一种以上的上述方法可进行检测。这些抗体可用所述 的探针直接或间接进行标记。抗体探针的连接，包括探针的共价连接、将探针融合入抗体、 以及螯合化合物的共价连接从而结合探针、以及其他本行业熟知的方法。对于免疫组织化 学方法，疾病组织样本可能是新鲜或冷冻或可能包埋于石蜡中以及用福马林等防腐剂固 定。固定或包埋的切片包括与标记一抗和二抗接触的样本，其中该抗体用于检测原位蛋白 的表达。 [0319] 本发明的另一方面包括一种体外制备启动的T细胞的方法，该方法包括将T细胞与 载有抗原的人MHC分子进行体外连接，这些分子在合适的抗原提呈细胞表面表达足够的一 段时间从而以抗原特异性方式启动T细胞，其中所述抗原为根据本发明所述的一种肽。优选 52 CN 111548406 A 说 明 书 50/93 页 情况是足够量的抗原与抗原提呈细胞一同使用。 [0320] 优选情况是，哺乳动物细胞的TAP肽转运载体缺乏或水平下降或功能降低。缺乏 TAP肽转运载体的适合细胞包括T2、RMA-S和果蝇细胞。TAP是与抗原加工相关的转运载体。 [0321] 人体肽载入的缺陷细胞株T2从属美国菌种保藏中心(ATCC ,12301Parklawn Drive,Rockville,马里兰州20852，美国)目录号CRL1992；果蝇细胞株Schneider 2号株从 属ATCC目录CRL 19863；小鼠RMA-S细胞株Ljunggren等人描述过(Ljunggren and Karre, 1985)。 [0322] 优选情况是，宿主细胞在转染前基本上不表达MHC I类分子。刺激因子细胞还优选 为表达对T细胞共刺激信号起到重要作用的分子，如，B7.1、B7.2、ICAM-1和LFA 3中的任一 种分子。大量MHC I类分子和共刺激分子的核酸序列可从GenBank和EMBL资料库中公开获 得。 [0323] 当MHC I类表位用作一种抗原时，T细胞为CD8阳性T细胞。 [0324] 如果抗原提呈细胞受到转染而表达这种表位，则优选的细胞包括一个表达载体， 该载体有能力表达含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:268的肽或变体氨基酸序列。 [0325] 可使用其他一些方法来体外生成T细胞。例如，自体肿瘤浸润性淋巴细胞可用于生 成CTL。Plebanski等人在(Plebanski et al.,1995)使用自体外周血淋巴细胞(PLB)制得T 细胞。另外，也可能用肽或多肽脉冲处理树突状细胞或透过与重组病毒感染而制成自体T细 胞。此外，B细胞可用于制备自体T细胞。此外，用肽或多肽脉冲处理或用重组病毒感染的巨 噬细胞可用于配制自体T细胞。S.Walter等人在(Walter et al.,2003)中描述了透过使用 人工抗原提呈细胞(aAPC)体外启动T细胞，这也是生成作用于所选肽的T细胞的一种合适方 法。在本发明中，根据生物素：链霉素生物化学方法透过将预制的MHC：肽复合物耦合到聚苯 乙烯颗粒(微球)而生成aAPC。该系统实现了对aAPC上的MHC密度进行精确调节，这使得可以 在血液样本中选择地引发高或低亲合力的高效抗原特异性T细胞反应。除了MHC：肽复合物 外，aAPC还应携运含共刺激活性的其他蛋白，如耦合至表面的抗-CD28抗体。此外，此类基于 aAPC的系统往往需要加入适当的可溶性因子，例如，诸如白细胞介素12的细胞因子。 [0326] 也可用同种异体细胞制得T细胞，在WO 97/26328中详细描述了一种方法，以参考 文献方式并入本文。例如，除了果蝇细胞和T2细胞，也可用其他细胞来提呈肽，如CHO细胞、 杆状病毒感染的昆虫细胞、细菌、酵母、牛痘感染的靶细胞。此外，也可使用植物病毒(例如， 参阅Porta等人在(Porta et al.,1994)中描述了将豇豆花叶病毒开发为一种提呈外来肽 的高产系统。 [0327] 被启动的T细胞直接针对本发明中的肽，有助于治疗。因此，本发明的另一方面提 出了用本发明前述方法制得的启动T细胞。 [0328] 按上述方法制成的启动T细胞将会有选择性地识别异常表达含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO268氨基酸序列的多肽。 [0329] 优选情况是，T细胞透过与其含HLA/肽复合物的TCR相互作用(如，结合)而识别该 细胞。T细胞是杀伤患者靶细胞方法中有用的细胞，其靶细胞异常表达含本发明中氨基酸序 列的多肽。此类患者给予有效量的启动T细胞。给予患者的T细胞可能源自该患者，并按上述 方法启动(即，它们为自体T细胞)。或者，T细胞不是源自该患者，而是来自另一个人。当然， 优选情况是该供体为健康人。发明人使用“健康个人”系指一个人一般状况良好，优选为免 53 CN 111548406 A 说 明 书 51/93 页 疫系统合格，更优选为无任何可很容易测试或检测到的疾病。 [0330] 根据本发明，CD8-阳性T细胞的体内靶细胞可为肿瘤细胞(有时表达MHC-II类抗 原)和/或肿瘤周围的基质细胞(肿瘤细胞)(有时也表达MHC-II类抗原；(Dengjel et al., 2006))。 [0331] 本发明所述的T细胞可用作治疗性组合物中的活性成分。因此，本发明也提出了一 种杀伤患者靶细胞的方法，其中患者的靶细胞异常表达含本发明中氨基酸序列的多肽，该 方法包括给予患者上述有效量的T细胞。 [0332] 发明人所用的“异常表达”的意思还包括，与正常表达水平相比，多肽过量表达，或 该基因在源自肿瘤的组织中不表达但在肿瘤中表达。“过量表达”系指多肽水平至少为正常 组织中的1.2倍；优选为至少为正常组织中的2倍，更优选为至少5或10倍。 [0333] T细胞可用本领域已知的方法制得(如，上述方法)。 [0334] T细胞继转移方案为本领域所熟知的方案。综述可发现于：Gattioni et al .和 Morgan et al.(Gattinoni et al.,2006；Morgan et al.,2006)。 [0335] 本发明的另一个方面包括使用与MHC复合的肽，以生成T细胞受体，其核酸被克隆 并被引入至宿主细胞，优选为T细胞。然后，该透过基因工程改变的T细胞可转给患者用于癌 症治疗。 [0336] 本发明的任一分子(即肽、核酸、抗体、表达载体、细胞，启动T细胞、T细胞受体或编 码核酸)都有益于治疗疾病，其特点在于细胞逃避免疫反应的打击。因此，本发明的任一分 子都可用作药剂或用于制造药剂。这种分子可单独使用也可与本发明中的其他分子或已知 分子联合使用。 [0337] 本发明还涉及一种套件，其包括： [0338] (a)一个容器，包含上述溶液或冻干粉形式的药物组合物； [0339] (b)可选的第二个容器，其含有冻干粉剂型的稀释剂或重组溶液；和 [0340] (c)可选的(i)溶液使用或(ii)重组和/或冻干制剂使用的说明。 [0341] 该套件还步包括一个或多个(iii)缓冲剂，(iv)稀释剂，(v)过滤液，(vi)针，或(v) 注射器。容器最好是瓶子、小瓶、注射器或试管，可以为多用途容器。药物组合物最好是冻干 的。 [0342] 本发明中的套件优选包含一种置于合适容器中的冻干制剂以及重组和/或使用说 明。适当的容器包括，例如瓶子、西林瓶(如双室瓶)、注射器(如双室注射器)和试管。该容器 可能由多种材料制成，如玻璃或塑胶。试剂盒和/或容器最好有容器或关于容器的说明书， 指明重组和/或使用的方向。例如，标签可能表明冻干剂型将重组为上述肽浓度。该标签可 进一步表明制剂用于皮下注射。 [0343] 存放制剂的容器可使用多用途西林瓶，使得可重复给予(例如，2-6次)重组剂型。 该套件可进一步包括装有合适稀释剂(如碳酸氢钠溶液)的第二个容器。 [0344] 稀释液和冻干制剂混合后，重组制剂中的肽终浓度优选为至少0.15mg/mL/肽(＝ 75μg)，不超过3mg/mL/肽(＝1500μg)。该套件还可包括商业和用户角度来说可取的其他材 料，包括其他缓冲剂、稀释剂，过滤液、针头、注射器和带有使用说明书的包装插页。 [0345] 本发明中的套件可能有一个单独的容器，其中包含本发明所述的药物组合物制 剂，该制剂可有其他成分(例如，其他化合物或及其药物组合物)，也可无其他成分，或者每 54 CN 111548406 A 说 明 书 52/93 页 种成分都有其不同容器。 [0346] 优选情况是，本发明的套件包括与本发明的一种制剂，包装后与第二种化合物(如 佐剂(例如GM-CSF)、化疗药物、天然产品、激素或拮抗剂、抗血管生成剂或抑制剂、凋亡诱导 剂或螯合剂)或其药物组合物联合使用。该套件的成分可进行预络合或每种成分在给予患 者之前可放置于单独的不同容器。该套件的成分可以是一种或多种溶液，优选为水溶液，更 优选为无菌水溶液。该套件的成分也可为固体形式，加入合适的溶剂后转换为液体，最好放 置于另一个不同的容器中。 [0347] 治疗套件的容器可能为西林瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器、或任何其他盛装固体或 液体的工具。通常，当成分不只一种时，套件将包含第二个西林瓶或其他容器，使之可以单 独定量。该套件还可能包含另一个装载药用液体的容器。优选情况是，治疗套件将包含一个 设备(如，一个或多个针头、注射器、滴眼器、吸液管等)，使得可注射本发明的药物(本套件 的组合物)。 [0348] 本发明的药物配方适合以任何可接受的途径进行肽给药，如口服(肠道)、鼻内、眼 内、皮下、皮内、肌内，静脉或经皮给药。优选为皮下给药，最优选为皮内给药，也可透过输液 泵给药。 [0349] 由于本发明的肽从结直肠癌、胶质母细胞瘤、胃癌、肝细胞癌、肾细胞癌中分离而 得，因此，本发明的药剂优选用于治疗结直肠癌、胶质母细胞瘤、胃癌、肝细胞癌、肾细胞癌。 [0350] 本发明进一步涉及为个体患者制备个体化药物的一种方法，其中包括：制造含选 自预筛选TUMAP存储库至少一种肽的药物组合物，其中药物组合物中所用的至少一种肽选 择为适合于个体患者。在一项实施方案中，药物组合物为一种疫苗。该方法也可以改动以产 生下游应用的T细胞克隆物，如：TCR隔离物或可溶性抗体和其他治疗选择。 [0351] “个体化药物”系指专门针对个体患者的治疗，将仅用于该等个体患者，包括个体 化活性癌症疫苗以及使用自体组织的过继细胞疗法。 [0352] 如本文所述，“存储库”应指已经接受免疫原性预筛查和/或在特定肿瘤类型中过 量提呈的一组或一系列肽。“存储库”一词并不暗示，疫苗中包括的特定肽已预先制造并储 存于物理设备中，虽然预期有这种可能性。明确预期所述肽可以用于新制造每种个体化疫 苗，也可能被预先制造和储存。存储库(例如，资料库形式)由肿瘤相关肽组成，其在各种 HLA-A HLA-B和HLA-C等位元基因结直肠癌、胶质母细胞瘤、胃癌、肝细胞癌、肾细胞癌患者 的肿瘤组织中高度过度表达。其可能含有包括MHC I类和MHC II类肽或拉长的MHC I类肽。 除了从几种结直肠癌、胶质母细胞瘤、胃癌、肝细胞癌、肾细胞癌组织中采集的肿瘤相关肽 外，存储库还可能包含HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*24、HLA-B*07、HLA-B*08和 HLA-A*24B*44标记肽。这些肽可对TUMAP诱导的T细胞免疫进行量化比较，从而可得出疫苗 抗肿瘤反应能力的重要结论。其次，在没有观察到来自患者“自身”抗原TUMAP的任何疫苗诱 导的T细胞反应时，它们可作为来自“非自身”抗原的重要阳性对照肽。第三，它还可对患者 的免疫功能状态得出结论。 [0353] 存储库的TUMAP透过使用一种功能基因组学方法进行鉴定，该方法结合了基因表 达分析、质谱法和T细胞免疫学 该方法确保了只选择真实存在于高百分比肿 瘤但在正常组织中不表达或仅很少量表达的TUMAP用于进一步分析。对于初始肽的选择，患 者结直肠癌、胶质母细胞瘤、胃癌、肝细胞癌、肾细胞癌样本和健康供体的血液以循序渐进 55 CN 111548406 A 说 明 书 53/93 页 的方法进行分析： [0354] 1.恶性材料的HLA配体用质谱法确定 [0355] 2.使用全基因组信使核糖核酸(mRNA)表达分析法用于确定恶性肿瘤组织(结直肠 癌、胶质母细胞瘤、胃癌、肝细胞癌、肾细胞癌)与一系列正常器官和组织相比过度表达的基 因。 [0356] 3.确定的HLA配体与基因表达资料进行比较。肿瘤组织上过量表达或选择性提呈 的肽，优选为第2步中检测到的选择性表达或过量表达基因所编码的考虑为多肽疫苗的合 适候选TUMAP。 [0357] 4.文献检索以确定更多证据以支持确认为TUMP的肽的相关性 [0358] 5.过度表达在mRNA水平的相关性由肿瘤组织第3步选定的TUMAP重新检测而确定， 并且在健康组织上缺乏(或不经常)检测。 [0359] 6.为了评估透过选定的肽诱导体内T细胞反应是否可行，使用健康供体以及结直 肠癌、胶质母细胞瘤、胃癌、肝细胞癌、肾细胞癌患者的人T细胞进行体外免疫原性测定。 [0360] 一方面，在将所述肽加入存储库之前，对其进行筛查以了解免疫原性。举例来说 (但不限于此)，纳入存储库的肽的免疫原性的确定方法包括体外T细胞启动，具体为：用装 载肽/MHC复合物和抗CD28抗体的人工抗原提呈细胞反复刺激来自健康供体的CD8 T细胞。 [0361] 这种方法优选用于罕见癌症以及有罕见表达谱的患者。与含目前开发为固定组分 的多肽鸡尾酒相反的是，存储库可将肿瘤中抗原的实际表达于疫苗进行更高程度的匹配。 在多目标方法中，每名患者将使用几种“现成”肽的选定单一肽或组合。理论上来说，基于从 50抗原肽库中选择例如5种不同抗原肽的一种方法可提供大约170万种可能的药物产品 (DP)组分。 [0362] 在一方面，选择所述肽用于疫苗，其基于个体患者的适合性，并使用本发明此处或 后文所述的方法。 [0363] HLA表型、转录和肽组学资料从患者的肿瘤材料和血液样本中收集，以确定最合适 每名患者且含有“存储库”和患者独特(即突变)TUMAP的肽。将选择的那些肽选择性地或过 度表达于患者肿瘤中，并且可能的情况下，如果用患者个体PBMC进行检测，则表现出很强的 体外免疫原性。 [0364] 优选的情况是，疫苗所包括的肽的一种确定方法包括：(a)识别由来自个体患者肿 瘤样本提呈的肿瘤相关肽(TUMAP)；(b)将(a)中鉴定的肽与上述肽的存储库(资料库)进行 比对；且(c)从与患者中确定的肿瘤相关肽相关的存储库(资料库)中选择至少一种肽。例 如，肿瘤样本提呈的TUMAP的鉴定方法有：(a1)将来自肿瘤样本的表达资料与所述肿瘤样本 组织类型相对应的正常组织样本的表达资料相比对，以识别肿瘤组织中过量表达或异常表 达的蛋白；以及(a2)将表达资料与结合到肿瘤样本中I类MHC和/或II类分子的MHC配体序列 想关联，以确定来源于肿瘤过量表达或异常表达的蛋白质的MHC配体。优选情况是，MHC配体 的序列的确定方法是：洗脱来自肿瘤样本分离的MHC分子结合肽，并测序洗脱配体。优选情 况是，肿瘤样本和正常组织从同一患者获得。 [0365] 除了使用存储库(资料库)模型选择肽以外，或作为一种替代方法，TUMAP可能在新 患者中进行鉴定，然后列入疫苗中。作为一种实施例，患者中的候选TUMAP可透过以下方法 进行鉴定：(a1)将来自肿瘤样本的表达资料与所述肿瘤样本组织类型相对应的正常组织样 56 CN 111548406 A 说 明 书 54/93 页 本的表达资料相比对，以识别肿瘤组织中过量表达或异常表达的蛋白；以及(a2)将表达资 料与结合到肿瘤样本中I类MHC和/或II类分子的MHC配体序列想关联，以确定来源于肿瘤过 量表达或异常表达的蛋白质的MHC配体。作为另一实施例，蛋白的鉴定方法为可包含突变， 其对于肿瘤样本相对于个体患者的相应正常组织是独特的，并且TUMAP可透过特异性靶向 作用于变异来鉴定。例如，肿瘤以及相应正常组织的基因组可透过全基因组测序方法进行 测序：为了发现基因蛋白质编码区域的非同义突变，从肿瘤组织中萃取基因组DNA和RNA，从 外周血单核细胞(PBMC)中提取正常非突变基因组种系DNA。运用的NGS方法只限于蛋白编码 区的重测序(外显子组重测序)。为了这一目的，使用供应商提供的靶序列富集试剂盒来捕 获来自人样本的外显子DNA，随后使用HiSeq2000(Illumina公司)进行测序。此外，对肿瘤的 mRNA进行测序，以直接定量基因表达，并确认突变基因在患者肿瘤中表达。得到的数以百万 计的序列读数透过软件演算法处理。输出列表中包含突变和基因表达。肿瘤特异性体突变 透过与PBMC衍生的种系变化比较来确定，并进行优化。然后，为了存储库可能测试新确定的 肽了解如上所述的免疫原性，并且选择具有合适免疫原性的候选TUMAP用于疫苗。 [0366] 在一个示范实施方案中，疫苗中所含肽透过以下方法确定：(a)用上述方法识别由 来自个体患者肿瘤样本提呈的肿瘤相关肽(TUMAP)；(b)将(a)中鉴定的肽与进行肿瘤(与相 应的正常组织相比)免疫原性和过量提呈预筛查肽的存储库进行比对；(c)从与患者中确定 的肿瘤相关肽相关的存储库中选择至少一种肽；及(d)可选地在(a)中选择至少一种新确定 的肽，确认其免疫原性。 [0367] 在一个示范实施方案中，疫苗中所含肽透过以下方法确定：(a)识别由来自个体患 者肿瘤样本提呈的肿瘤相关肽(TUMAP)；以及(b)在(a)中选择至少一种新确定的肽，并确认 其免疫原性。 [0368] 一旦选定了用于个体化肽疫苗的肽时，则产生疫苗。该疫苗优选为一种液体制剂， 包括溶解于20-40％DMSO之间，优选为约30-35％DMSO，例如，约33％DMSO中的个体肽。 [0369] 列入产品的每种肽都溶于DMSO中。单个肽溶液浓度的选择取决于要列入产品中的 肽的数量。单肽-DMSO溶液均等混合，以实现一种溶液中包含所有的肽，且浓度为每肽～ 2.5mg/ml。然后该混合溶液按照1：3比例用注射用水进行稀释，以达到在33％DMSO中每肽 0.826mg/ml的浓度。稀释的溶液透过0.22μm无菌筛检程序进行过滤。从而获得最终本体溶 液。 [0370] 最终本体溶液填充到小瓶中，在使用前储存于-20℃下。一个小瓶包含700μL溶液， 其中每种肽含有0.578mg。其中的500μL(每种肽约400μg)将用于皮内注射。 [0371] 本发明的肽除了用于治疗癌症，也可用于诊断。由于肽由结直肠癌、胶质母细胞 瘤、胃癌、肝细胞癌、肾细胞癌细胞产生，并且已确定这些肽在正常组织中不存在或水平较 低，因此这些肽可用于诊断癌症是否存在。 [0372] 血液样本中组织活检物含权利要求的肽，可有助于病理师诊断癌症。用抗体、质谱 或其他本领域内已知的方法检测某些肽可使病理师判断该组织样本为恶性的还是炎症或 一般病变，也可用作结直肠癌、胶质母细胞瘤、胃癌、肝细胞癌、肾细胞癌的生物标志物。肽 基团的提呈使得能对病变组织进行分类或进一步分成子类。 [0373] 对病变标本中肽的检测使得能对免疫系统治疗方法的利益进行判断，特别是如果 T-淋巴细胞已知或预计与作用机制有关。MHC表达的缺失是一种机制，充分说明了哪些受感 57 CN 111548406 A 说 明 书 55/93 页 染的恶性细胞逃避了免疫监视。因此，肽的提呈表明，分析过的细胞并没有利用这种机制。 [0374] 本发明的肽可用于分析淋巴细胞对肽的反应(如T细胞反应)，或抗体对肽或MHC分 子络合的肽发生的反应。这些淋巴细胞反应可以作为预后指标，决定是否采取进一步的治 疗。这些反应也可以用作免疫疗法中的替代反应指标，旨在以不同方式诱导淋巴细胞反应， 如接种蛋白疫苗、核酸、自体材料、淋巴细胞过继转移。基因治疗中，淋巴细胞对肽发生的反 应可以在副作用的评估中考虑。淋巴细胞反应监测也可能成为移植疗法随访检查中的一种 有价值的工具，如，用于检测移植物抗宿主和宿主抗移植物疾病。 [0375] 下列描述优选方案的实施例将对本发明进行说明，并参照随附图表(但是不仅限 于此)。考虑到本发明的目的，文中引用的所有参考文献透过引用的方式并入在本文中。 [0376] 图表 [0377] 图1A至图1P显示了本发明的源基因的代表性表达特征，其在不同癌症样本中过量 表达。肿瘤(黑点)和正常(灰色点)样本按照器官起源分组，箱须图代表了中位数、第25和第 75百分位(箱)以及最小和最大(须)RPKM值。正常器官根据风险类别排列顺序。RPKM＝每百 万映射读数每千碱基读数。正常样本：血细胞；血管；脑；心；肝；肺；脂肪：脂肪组织； adren.gl.：肾上腺；胆管；膀胱；BM：骨髓；软骨；esoph：食管；眼睛；gallb：胆囊；头颈部；肾； large_int：大肠；LN：淋巴结；神经；胰腺；parathyr：甲状旁腺；perit：腹膜；pituit：垂体； skel.mus：骨骼肌；皮肤；small_int：小肠；脾；胃；甲状腺；气管；输尿管；乳房；卵巢；胎盘； 前列腺；睾丸；胸腺；子宫。肿瘤样本：CRC：结直肠癌；GBM：胶质母细胞瘤；GC：胃癌；HCC：肝细 胞癌；RCC：肾细胞癌。图1A)基因符号：EGFR，肽：LPSPTDSNFY(SEQ ID No.:2)，图1B)基因符 号：PTPRZ1，肽：LTDYINANY(SEQ ID No.:28)，1C)基因符号：CCDC146，肽：KMMALVAEL(SEQ ID No .:42)，1D)基因符号：MMP16，肽：YLPPTDPRMSV(SEQ ID No .:54)，1E)基因符号：RP11- 1220K2.2，肽：GLPDFVKEL(SEQ ID No .:60)，1F)基因符号：GRM8，肽：ATMQSKLIQK(SEQ ID No.:99)，1G)基因符号：HAVCR1，肽：GVIIAKKYFFK(SEQ ID No.:101)，1H)基因符号：SEMA5B， 肽：GTESGTILK(SEQ ID No.:110)，1I)基因符号：PIWIL1，肽：SFDSNLLSF(SEQ ID No.:133)， 1J)基因符号：UGT1A3，肽：KYLSIPTVF(SEQ ID No .:138)，1K)基因符号：FEZF1，肽： APAAVPSAPA(SEQ ID No.:153)，1L)基因符号：MMP11，肽：RPASSLRP(SEQ ID No.:163)，1M) 基因符号：QRFPR，肽：SPMWHVQQL(SEQ ID No.:170)，1N)基因符号：REG4，肽：SRSMRLLLL(SEQ ID No.:190)，1O)基因符号：PTHLH，肽：AEIHTAEI(SEQ ID No.:231)，1P)基因符号：EGFR， 肽：DEYL IPQQGF(SEQ ID No.:264)。 [0378] 图2显示了健康HLA-A*02 供体的肽特异性CD8 T细胞体外反应的示例性结果。CD8 T细胞制备的方法为：使用抗CD28 mAb和HLA-A*02涂层的人工APC分别与SeqID No267肽 (KTLGKLWRL,Seq ID NO:267)(A，左图)。经过3个周期的刺激后，用A*02/SeqID No 267(A) 的2D多聚体染色法对肽反应性细胞进行检测。右图(B)显示了用不相关A*02/肽复合体刺激 的细胞对照染色。活单细胞透过CD8 淋巴细胞门控。Boolean门控帮助排除用不同肽特定的 多聚体检测的假阳性事件。提示了特异性多聚体 细胞和CD8 淋巴细胞的频率。 [0379] 图3显示了健康HLA-A*24 供体的肽特异性CD8 T细胞体外反应的示例性结果。CD8 T细胞制备的方法为：使用抗CD28 mAb和HLA-A*24涂层的人工APC分别与SEQ ID NO:268肽 (A，左图)。经过3个周期的刺激后，用A*24/SEQ ID NO:268(DYIPYVFKL,SEQ ID NO:268)(A) 的2D多聚体染色法对肽反应性细胞进行检测。右图(B)显示了用不相关A*24/肽复合体刺激 58 CN 111548406 A 说 明 书 56/93 页 的细胞对照染色。活单细胞透过CD8 淋巴细胞门控。Boolean门控帮助排除用不同肽特定的 多聚体检测的假阳性事件。提示了特异性多聚体 细胞和CD8 淋巴细胞的频率。 [0380] 图4显示了健康HLA-A*01 供体的肽特异性CD8 T细胞体外反应的示例性结果。CD8 T细胞使用人工APC引发，该人工APC经抗CD28 mAb和分别与SEQ ID NO:6肽(VLDLSTNVY；A， 左图)及SEQ ID NO:245肽(ITEKNSGLY；B，左图)复合之HLA-A*01涂层。经过3个周期的刺激 后，用A*01/SEQ ID NO:6(A)或A*01/SEQ ID NO:245(B)的2D多聚体染色法对肽反应性细胞 进行检测。右图(A和B)显示用不相关A*01/肽复合体刺激的细胞对照染色。活单细胞经门控 以得到CD8 淋巴细胞。Boolean门控帮助排除用不同肽特异性多聚体检测的假阳性事件。提 示了CD8 淋巴细胞中特异性多聚体 细胞的频率。 [0381] 图5显示了健康HLA-A*02 供体的肽特异性CD8 T细胞体外反应的示例性结果。CD8 T细胞制备的方法为：使用抗CD28 mAb和HLA-A*02涂层的人工APC分别与SEQ ID NO:42肽 (KMMALVAEL；A，左图)或Seq ID NO:250肽(KMILKMVQL；B，左图)合成。经过3个周期的刺激 后，用A*02/SEQ ID NO:42(A)或A*02/SEQ ID NO:250(B)的2D多聚体染色法对肽反应性细 胞进行检测。右图(A和B)显示用不相关A*02/肽复合体刺激的细胞对照染色。活单细胞透过 CD8 淋巴细胞门控。Boolean门控帮助排除用不同肽特定的多聚体检测的假阳性事件。提示 了特异性多聚体 细胞和CD8 淋巴细胞的频率。 [0382] 图6显示了健康HLA-A*03 供体的肽特异性CD8 T细胞体外反应的示例性结果。CD8 T细胞使用人工APC引发，该人工APC经抗CD28 mAb和分别与SEQ ID NO:94肽(KTYVGHPVKM； A，左图)及SEQ ID NO:110肽(GTESGTILK；B，左图)复合之HLA-A*03涂层。经过3个周期的刺 激后，用A*03/SEQ ID NO:94(A)或A*03/SEQ ID NO:110(B)的2D多聚体染色法对肽反应性 细胞进行检测。右图(A和B)显示用不相关A*03/肽复合体刺激的细胞对照染色。活单细胞经 门控以得到CD8 淋巴细胞。Boolean门控帮助排除用不同肽特异性多聚体检测的假阳性事 件。提示了CD8 淋巴细胞中特异性多聚体 细胞的频率。 [0383] 图7显示了健康HLA-A*24 供体的肽特异性CD8 T细胞体外反应的示例性结果。CD8 T细胞使用人工APC引发，该人工APC经抗CD28 mAb与SEQ ID NO:138肽(KYLSIPTVF；左图) 复合之HLA-A*24涂层。经过3个周期的刺激后，用A*02/SEQ ID NO:138的2D多聚体染色法对 肽反应性细胞进行检测。右图显示用不相关A*24/肽复合体刺激的细胞对照染色。活单细胞 经门控以得到CD8 淋巴细胞。Boolean门控帮助排除用不同肽特异性多聚体检测的假阳性 事件。提示了CD8 淋巴细胞中特异性多聚体 细胞的频率。 [0384] 图8显示了健康HLA-B*07 供体的肽特异性CD8 T细胞体外反应的示例性结果。CD8 T细胞制备的方法为：使用抗CD28 mAb和HLA-B*07涂层的人工APC分别与SeqID No170肽 (SPMWHVQQL；A，左图)或SeqID NO:155肽(FPYPYAERL；B，左图)合成。经过3个周期的刺激后， 用B*07/Seq ID NO:170(A)或B*07/SeqID NO:155(B)的2D多聚体染色法对肽反应性细胞进 行检测。右图(A和B)显示用不相关B*07/肽复合体刺激的细胞对照染色。活单细胞透过CD8 淋巴细胞门控。Boolean门控帮助排除用不同肽特定的多聚体检测的假阳性事件。提示了特 异性多聚体 细胞和CD8 淋巴细胞的频率。 [0385] 图9显示了健康HLA-B*44 供体的肽特异性CD8 T细胞体外反应的示例性结果。CD8 T细胞制备的方法为：使用抗CD28 mAb和HLA-B*44涂层的人工APC分别与SEQ ID NO:225肽 (SEAFPSRAL；A，左图)或SEQ ID NO:236肽(EEKLIIQDF；B，左图)合成。经过3个周期的刺激 59 CN 111548406 A 说 明 书 57/93 页 后，用B*44/SEQ ID NO:225(A)或B*44/SEQ ID NO:236(B)的2D多聚体染色法对肽反应性细 胞进行检测。右图(A和B)显示用不相关B*44/肽复合体刺激的细胞对照染色。活单细胞透过 CD8 淋巴细胞门控。Boolean门控帮助排除用不同肽特定的多聚体检测的假阳性事件。提示 了特异性多聚体 细胞和CD8 淋巴细胞的频率。 实施例 [0386] 实施例1 [0387] 细胞表面提呈的肿瘤相关肽的识别 [0388] 组织样本 [0389] 患者的肿瘤组织和正常组织从蒂宾根大学医院(蒂宾根，德国)获得。所有患者在 手术或尸检前都提供了书面知情同意。切除后组织立即进行急速冷冻处理，在分离TUMAP前 储存于-70℃或以下。TUMAP选择的样本数量为：肾癌N＝79、结直肠癌N＝35、肝细胞癌N＝ 22、胃癌N＝10、胶质母细胞瘤N＝12。 [0390] 从组织样本中分离HLA肽 [0391] 根据方案(Falk et al.,1991；Seeger et al.,1999)略加修改，使用HLA-A*02特 异性抗体BB7.2、HLA-A、HLA-B、HLA-ㄱC特异性抗体W6/32、HLA-DR特异性L243和泛HLA II类 特异性抗体Tü39、CNBr活化的琼脂糖凝胶、酸处理和超滤方法以免疫沉淀法获得了来自实 体组织的快速冷冻组织样本的HLA肽库。 [0392] 质谱分析 [0393] 获得的HLA肽库根据其疏水性用反相色谱(Ultimate 3000RSLC Nano UHPLC System ,Dionex)分离，洗脱肽用装有电喷雾源的LTQ-Orbitrap和融合Lumos杂交质谱 (ThermoElectron)进行了分析。在2cm PepMap 100C18 Nanotrap柱(Dionex)上以4μL/min 的流速将肽样本载入3％的溶剂B(20％H2O，80％乙腈和0.04％甲酸)10分钟。分离在装载到 50℃下运行的柱式烘箱中具有2μm粒度的25cm或50cm PepMap C18柱(Dionex)上进行。所施 加的梯度在300nl/min(对于25cm柱)的流速下在90min内或在175nl/min(对于50cm柱)的流 速下在140min内为3％至32％溶剂B。(溶剂A：99％H2O、1％ACN和0.1％甲酸；溶剂B：20％ H2O、80％ACN和0.1％甲酸)。 [0394] 质谱分析采用前五种方法(即在每次调查扫描中选择五种最丰富的前体离子用于 破碎)以资料依赖性采集模式进行。或者，采用TopSpeed方法在Fusion Lumos仪器上进行分 析。 [0395] 在Orbitrap上以60,000(对于Orbitrap XL)或120 ,000(对于Orbitrap Fusion Lumos)的解析度记录检查扫描结果。透过碰撞诱导解离(CID，归一化碰撞能量35％、活化时 间30ms、分离宽度1.3m/z)进行MS/MS分析，随后在线性阱四极杆(LTQ)中进行分析。对于 HLA-I类配体，品质范围限于400-650m/z，破碎选定的可能电荷状态为2 和3 。对于HLA-II 类配体，品质范围设置为300-1500m/z，允许所有正电荷状态≥2的碎片化处理。 [0396] 串联质谱由MASCOT或SEQUEST以固定的错误发现率(q≤0.05)和额外的手动控制 器进行解读。在确定的肽序列不确定的情况下，透过比较生成的天然肽片段化模式与合成 序列相同参考肽的片段化模式，进一步验证所述肽序列。 [0397] 表8a和8b显示了选定肽在各种癌症实体上的提呈，因此显示所提及的肽在诊断 60 CN 111548406 A 说 明 书 58/93 页 和/或治疗所示的癌症上的特别相关性(例如，肽SEQ ID No.1用于结直肠癌(表8a)以及用 于GBC和GC(表8b)，肽SEQ ID No .50用于结直肠癌和肝细胞癌(表8a)以及用于CCC、GBM、 HNSCC、NHL、NSCLCsquam、PACA、SCLC和UBC(表8b))。 [0398] 表8a：本发明选定肿瘤相关肽在各示例性和优选实体(疾病)中提呈概述。 [0399] GBM＝胶质母细胞瘤、CRC＝结直肠癌、RCC＝肾细胞癌、HCC＝肝细胞癌、GC＝胃癌。 [0400] 61 CN 111548406 A 说 明 书 59/93 页 [0401] 62 CN 111548406 A 说 明 书 60/93 页 [0402] 63 CN 111548406 A 说 明 书 61/93 页 [0403] 64 CN 111548406 A 说 明 书 62/93 页 [0404] 65 CN 111548406 A 说 明 书 63/93 页 [0405] 66 CN 111548406 A 说 明 书 64/93 页 [0406] [0407] 表8b：本发明选定肿瘤相关肽在各实体(疾病)中提呈概述。 [0408] BRCA＝乳腺癌，CCC＝胆管癌，GBM＝脑癌，CRC＝结直肠癌，OSCAR＝食道癌，GBC＝ 胆囊腺癌，GC＝胃癌，HNSCC＝头颈部鳞状细胞癌，HCC＝肝细胞癌，MEL＝黑色素瘤，NHL＝非 霍奇金淋巴瘤，NSCLCadeno＝非小细胞肺癌腺癌，NSCLCother＝不能明确地归属于 NSCLCadeno或NSCLCsquam的NSCLC样本，NSCLCsquam＝鳞状细胞非小细胞肺癌，OC＝卵巢 癌，PACA＝胰腺癌，PRCA＝前列腺癌和良性前列腺增生，RCC＝肾细胞癌，SCLC＝小细胞肺 癌，UBC＝膀胱癌，UEC＝子宫癌。 67 CN 111548406 A 说 明 书 65/93 页 [0409] 68 CN 111548406 A 说 明 书 66/93 页 [0410] 69 CN 111548406 A 说 明 书 67/93 页 [0411] 70 CN 111548406 A 说 明 书 68/93 页 [0412] 71 CN 111548406 A 说 明 书 69/93 页 [0413] 72 CN 111548406 A 说 明 书 70/93 页 [0414] 73 CN 111548406 A 说 明 书 71/93 页 [0415] [0416] 实施例2 [0417] 编码本发明肽的基因的表达谱 [0418] 与正常细胞相比在肿瘤细胞上一种肽过度提呈或特定提呈足够其在免疫治疗中 有效使用，一些肽为肿瘤特异性的，尽管存在其源蛋白也存在于正常组织中。但是，mRNA表 达谱增加了免疫治疗目标肽选择中其他级别的安全性。特别是对于具有高安全性风险的治 疗选择，诸如亲和力成熟的TCR，理想的目标肽将来源于对该肿瘤独一无二且不出现于正常 组织中的蛋白。 [0419] RNA来源与制备 [0420] 手术切除组织标本按如上所述(参见实施例1)在获得每名患者的书面知情同意后 提供。手术后立即速冻肿瘤组织标本，之后在液态氮中用杵臼匀浆。使用TRI试剂(Ambion公 司,达姆施塔特，德国)之后用RNeasy(QIAGEN公司，希尔登，德国)清理从这些样本中制备总 RNA；这两种方法都根据制造商的方案进行。 [0421] 用于RNASeq实验来自健康人体组织的总RNA获得自：Asterand(Detroit,密西根 州，,美国和Royston,赫特福德，英国)、Bio-Options Inc.(Brea ,加州，美国)、Geneticist Inc .(Glendale ,加州，美国)、ProteoGenex Inc .(Culver City ,加州，美国)、Tissue Solutions Ltd(格拉斯哥，英国)。用于RNASeq实验来自肿瘤组织的总RNA获得自：Asterand (Detroit ,密西根州，美国和Royston ,赫特福德，英国)、BioCat GmbH(海德堡，德国)、 BioServe(Beltsville ,马里兰州，美国)、Geneticist Inc .(Glendale ,加州，美国)、 Istituto Nazionale Tumori"Pascale"(那不勒斯,义大利)、ProteoGenex Inc.(Culver City ,加州，美国)、海德堡大学医院(海德堡，德国)。所有RNA样本的品质和数量都在 Agilent 2100Bioanalyzer分析仪(Agilent公司，瓦尔特布隆，德国)上使用RNA 6000Pico LabChip Kit试剂盒(Agilent公司)进行评估。 [0422] RNAseq实验 [0423] 透过新一代测序技术(RNAseq)由CeGaT(蒂宾根，德国)对肿瘤和正常组织的RNA样 本进行基因表达分析。简言之，根据供应商的方案(Illumina Inc .,San Diego，加州，美 国)，其中包括RNA碎片化、cDNA转化和测序适配器的加入，利用Illumina HiSeq v4试剂盒 74 CN 111548406 A 说 明 书 72/93 页 准备测序文库。从多个样本获得的文库根据制造商的说明等摩尔混合并在Illumina HiSeq 2500定序器上测序，产生50bp的单端读数。处理的读数使用STAR软件映射至人类基因组 (GRCh38)。根据ENSEMBL序列资料库的说明(Ensembl77)，表达资料在转录水平设置为RPKM (每百万映射读数每千碱基读数，由Cufflinks软件生成)并在外显子水平上设置(总读数， 由Bedtools软件生成)。外显子读数被归为外显子长度和校准尺寸，以获得RPKM值。 [0424] 本发明的代表性源基因在结直肠癌、胶质母细胞瘤、胃癌、肝细胞癌、肾细胞癌中 高度过量表达的表达谱如图1所示。进一步代表性基因的表达分数见表9。 [0425] 表9：表达分数。该表列出了与一系列正常组织相比在肿瘤上非常高度过量表达( )、与一系列正常组织相比在肿瘤上高度过量表达( )或与一系列正常组织相比在肿瘤 上过量表达( )的基因的肽。本基线得分根据以下相关正常组织的测量值计算：血细胞、血 管、脑、心脏、肝脏、肺、脂肪组织、肾上腺、胆管、膀胱、骨髓、软骨、食管、眼、胆囊、头颈、肾、 大肠、淋巴结、神经、胰脏、甲状旁腺、腹膜、垂体、胸膜、骨骼肌、皮肤、小肠、脾、胃、甲状腺、 气管、输尿管。如果获得同一组织类型几个样本的表达资料，则使用各样本的算术平均值进 行计算。 75 CN 111548406 A 说 明 书 73/93 页 [0426] 76 CN 111548406 A 说 明 书 74/93 页 [0427] 77 CN 111548406 A 说 明 书 75/93 页 [0428] 78 CN 111548406 A 说 明 书 76/93 页 [0429] 79 CN 111548406 A 说 明 书 77/93 页 [0430] 80 CN 111548406 A 说 明 书 78/93 页 [0431] 81 CN 111548406 A 说 明 书 79/93 页 [0432] 82 CN 111548406 A 说 明 书 80/93 页 [0433] [0434] 实施例3 [0435] MHC-I类提呈肽的体外免疫原性 [0436] 为了获得关于本发明TUMAP的免疫原性资讯，发明人使用体外T细胞扩增分析方法 进行了研究，其中该分析方法基于使用装载肽/MHC复合物和抗CD28抗体的人工抗原提呈细 胞(aAPC)进行反复刺激。用这种方法，发明人可显示出本发明的HLA-A*02:01、HLA-A*24: 02、HLA-A*01:01、HLA-A*03:01、HLA-B*07:02和HLA-B*44:02限制TUMAP具有免疫原性，这表 明这些肽为对抗人CD8 前体T细胞的T细胞表位(表10a和表10b)。 [0437] CD8 T细胞体外启动 [0438] 为了用载有肽-MHC复合物(pMHC)和抗CD28抗体的人工抗原提呈细胞进行体外刺 激，发明人首先从University clinics Mannheim ,Germany中获取健康供体CD8微珠 (Miltenyi Biotec,贝尔吉施-格拉德巴赫，德国)透过积极选择白细胞清除术后新鲜HLA- A*02、HLA-A*24、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-B*07或HLA-B*44产物而分离出CD8 T细胞。 [0439] PBMC和分离出的CD8 淋巴细胞使用前在T细胞培养基(TCM)中培养，培养基包括 RPMI-Glutamax(Invitrogen公司，卡尔斯鲁厄，德国)并补充10％热灭活人AB血清(PAN- Biotech公司，艾登巴赫，德国)、100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素(Cambrex公司，科隆，德 国)，1mM丙酮酸钠(CC Pro公司，Oberdorla，德国)和20μg/ml庆大霉素(Cambrex公司)。在此 步骤，2.5ng/ml的IL-7(PromoCell公司，海德堡，德国)和10U/ml的IL-2(Novartis Pharma 公司，纽伦堡，德国)也加入TCM。 [0440] 对于pMHC/抗-CD28涂层珠的生成、T细胞的刺激和读出，使用每刺激条件四个不同 pMHC分子以及每个读出条件8个不同的pMHC分子在高度限定的体外系统中进行。 [0441] 纯化的共刺激小鼠IgG2a抗人CD28抗体9 .3(Jung et al .,1987)使用制造商 (Perbio公司，波恩，德国)推荐的N-羟基琥珀醯亚胺生物素进行化学生物素化处理。所用珠 为5.6μm的链霉抗生物素蛋白包裹的多聚苯乙烯颗粒(Bangs Labooratories，伊利诺州，美 国)。用于阳性和阴性对照刺激物的pMHC分别为A*0201/MLA-001(从Melan-A/MART-1中修饰 制得的肽ELAGIGILTV(SEQ ID NO.269))和A*0201/DDX5-001(从DDX5中获得的YLLPAIVHI (SEQ ID NO.270))。 [0442] 800.000珠/200μl包裹于含有4x 12.5ng不同生物素-pMHC的96孔板、进行洗涤，随 后加入体积为200μl的600ng生物素抗-CD28。在37℃下，在含5ng/ml IL-12(PromoCell)的 200μl TCM中共培养1x106 CD8 T细胞与2x105的清洗涂层珠3天，从而启动刺激。之后，一半 培养基与补充80U/ml IL-2的新鲜TCM进行交换，并且培养在37℃下持续4天。这种刺激性周 期总共进行3次。对于使用每条件8种不同pMHC分子的pMHC多聚体读出，二维组合编码方法 83 CN 111548406 A 说 明 书 81/93 页 如前述使用(Andersen et al.,2012)，稍作修饰，涵盖耦合至5种不同的萤光染料。最后，用 Live/dead near IR染料(Invitrogen公司，卡尔斯鲁厄，德国)、CD8-FITC抗体克隆SK1(BD 公司，海德堡，德国)和萤光pMHC多聚体而执行多聚体分析。对于分析，使用了配有合适镭射 仪和筛检程序的BD LSRII SORP细胞仪。肽特异性细胞以占总CD8 细胞的百分比形式进行 计算。多聚体分析结果使用FlowJo软件(Tree Star公司，俄勒冈州，美国)进行评估。特定多 聚体 CD8 淋巴细胞的体外填装用与阴性对照刺激组比较而进行检测。如果健康供体中的 至少一个可评价的体外刺激孔在体外刺激后发现含有特异性CD8 T细胞株(即该孔包含至 少1％特定多聚体 CD8 T细胞，并且特定多聚体 的百分比至少为阴性对照刺激中位数的10 倍)，则检测给定抗原的免疫原性。 [0443] 结直肠癌、胶质母细胞瘤、胃癌、肝细胞癌、肾细胞癌肽体外免疫原性对于受到测 试的HLA-I类肽，可透过肽特异性T细胞株的生成证明其体外免疫原性。TUMAP特异性多聚体 对本发明的13种肽染色后流式细胞仪检测的典型结果如图2至9所示，同时也含有相应的阴 性对照资讯。本发明56种肽的结果汇总于表10a和表10b。 [0444] 表10a：本发明中HLA I类肽的体外免疫原性申请人对本发明的肽所做的体外免疫 原性实验的示例性结果。<20％＝ ；20％-49％＝ ；50％-69％＝ ；>＝70％＝ [0445] 序列ID号 序列 阳性孔[％] 267 KTLGKLWRL 268 DYIPYVFKL [0446] 表10b：本发明中HLA I类肽的体外免疫原性申请人对本发明的肽所做的体外免疫 原性实验的示例性结果。<20％＝ ；20％-49％＝ ；50％-69％＝ ；>＝70％＝ [0447] 84 CN 111548406 A 说 明 书 82/93 页 [0448] [0449] 实施例4 [0450] 肽的合成所有的肽透过使用Fmoc策略以标准、广为接受的固相肽合成法合成。每 个肽的身份和纯度已使用质谱和RP-HPLC分析法确定。用冻干法(三氟乙酸盐)获得白色至 类白色的肽，纯度为>50％。所有的TUMAP优选作为三氟乙酸盐或乙酸盐进行给药，其他药用 盐形式也可以。 [0451] 实施例5 [0452] MHC结合测定 [0453] 本发明基于T细胞疗法的候选肽进一步测试其MHC结合能力(亲和性)。单个肽-MHC 85 CN 111548406 A 说 明 书 83/93 页 复合体透过UV-配体交换产生，其中，紫外线敏感肽经紫外线照射后裂解，与分析的相关肽 交换。只有能够有效地结合并稳定肽接受MHC分子的候选肽才能阻止MHC复合物的解离。为 了确定交换反应的产率，将基于稳定MHC复合物轻链(β2m)的检测结果进行ELISA测定。检测 总体上按照Rodenko等人在(Rodenko et al.,2006)中描述的方法进行。 [0454] 96孔Maxisorp板(NUNC)在室温下在PBS中以2ug/ml链霉包被过夜，用4倍洗涤并在 37℃下在含封闭缓冲液的2％BSA中封闭1小时。折叠的HLA-A*02:01/MLA-001单体作为标准 品，涵盖15-500ng/ml的范围。紫外线交换反应的肽-MHC单体在封闭缓冲液中稀释100倍。样 本在37℃下孵育1小时，洗涤四次，在37℃下以2ug/ml HRP缀合抗-β2m温育1小时，再次洗 涤，并以NH2SO4封堵的TMB溶液进行检测。在450nm处测量吸收。在生成和产生抗体或其片段 时和/或T细胞受体或其片段时，通常优选显示为高交换产率(优选为高于50％，最优选为高 于75％)的候选肽，这是因为它们对MHC分子表现出足够的亲合力，并能防止MHC复合物的解 离。 [0455] 表11：MHC-I类结合分数。HLA-I类限制肽与HLA-A*01:01的结合根据肽交换产量分 类：>10％＝ ；>20％＝ ；>50＝ ；>75％＝ [0456] 86 CN 111548406 A 说 明 书 84/93 页 [0457] [0458] 表12：MHC-I类结合分数。HLA-I类限制肽与HLA-A*02:01的结合根据肽交换产量分 类：>10％＝ ；>20％＝ ；>50＝ ；>75％＝ [0459] 序列ID号 序列 肽交换 87 CN 111548406 A 说 明 书 85/93 页 38 VMLNSNVLL " " 39 YLLPSVVLL " " 40 KIDDIWNLEV " " 41 SLQDTKITL " " 42 KMMALVAEL " " 43 GLMTIVTSL " " 44 SQTGFVVLV " " 45 KLLDEVTYL " " 46 VLITGLPLI " " 47 YQDSWFQQL " " 49 NLASRPYSL " " 50 ELMPRVYTL " " 51 ALAAELNQL " " 52 YVSSGEMMV " " 53 LLMTSLTES " " 54 YLPPTDPRMSV " " 55 RLWQIQHHL " " 56 FLNQIYTQL " " 57 GLTGVIMTI " " 59 KLHEIYIQA " " 60 GLPDFVKEL " " 61 RLFGLFLNNV " " 249 ALFPERITV " " 250 KMILKMVQL " " 251 RLASRPLLL " " [0460] 表13：MHC-I类结合分数。HLA-I类限制肽与HLA-A*03:01的结合根据肽交换产量分 类：>10％＝ ；>20％＝ ；>50＝ ；>75％＝ [0461] 88 CN 111548406 A 说 明 书 86/93 页 [0462] 89 CN 111548406 A 说 明 书 87/93 页 [0463] [0464] 表14：MHC-I类结合分数。HLA-I类限制肽与HLA-A*24:02的结合根据肽交换产量分 类：>10％＝ ；>20％＝ ；>50＝ ；>75％＝ [0465] 序列ID号 序列 肽交换 113 VWAKILSAF " " 114 KFLDSNIKF " " 115 YFEEAANFL " " 116 LVLDYSKDYNHW " " 117 NFLPPIIARF " " 118 TYISKTIAL " " 120 MYAKEFDLL " " 121 SYIEKVRFL " " 122 KLYGMPTDFGF " " 123 RQYLAINQI " " 125 IYGPKYIHPSF " " 126 TFQDKTLNF " " 127 IFINLSPEF " " 128 SYTKVEARL " " 129 VFLNQIYTQL " " 130 VYGDGHYLTF " " 133 SFDSNLLSF " " 134 TYLTGRQF " " 135 VIAPIISNF " " 136 EYNNIQHLF " " 137 KYLSLSNSF " " 138 KYLSIPTVF " " 139 PYASLASELF " " 140 KYLSIPAVF " " 141 KYLSIPAVFF " " [0466] 表15：MHC-I类结合分数。HLA-I类限制肽与HLA-B*07:02的结合根据肽交换产量分 类：>10％＝ ；>20％＝ ；>50＝ ；>75％＝ [0467] 序列ID号 序列 肽交换 143 FELPTGAGLQL " " 144 IPEPSAQQL " " 145 RVPSYTLIL " " 90 CN 111548406 A 说 明 书 88/93 页 146 SPGDKRLAA " " 147 SPIKVPLLL " " 148 VPDGVSKVL " " 149 YPLTGDTRL " " 150 KPSSKALGTSL " " 151 VVHPRTLLL " " 152 IPSRLLAIL " " 153 APAAVPSAPA " " 154 GPGTRLSL " " 155 FPYPYAERL " " 156 HPQVVILSL " " 157 SPSPGKDPTL " " 158 VPERGEPEL " " 159 FPAHPSLLL " " 160 RPAPADSAL " " 161 NPYEGRVEV " " 162 MPMISIPRV " " 163 RPASSLRP " " 164 ISTPSEVSTPL " " 165 TPIAKVSEL " " 166 HDPDVGSNSL " " 167 YPSEVEHMF " " 168 IPTDKLLVI " " 169 FPTEVTPHAF " " 170 SPMWHVQQL " " 171 APKLFAVAF " " 172 KPAHYPLIAL " " 173 MVPSAGQLALF " " 174 VPSLQRLML " " 175 HPIETLVDIF " " 255 LPDGSRVEL " " 256 LPALPQQLI " " 257 SPLRGGSSL " " 258 APSGTRVVQVL " " 259 RPAVGHSGL " " [0468] 表16：MHC-I类结合分数。HLA-I类限制肽与HLA-B*44:02的结合根据肽交换产量分 类：>10％＝ ；>20％＝ ；>50＝ ；>75％＝ 91 CN 111548406 A 说 明 书 89/93 页 [0469] 92 CN 111548406 A 说 明 书 90/93 页 [0470] [0471] 实施例6 [0472] 肽-MHC I类的稳定性 [0473] HLA-B*08:01肽透过ImmunAware(哥本哈根，丹麦)进行了肽-MHC稳定性测定。使用 基于近似数、均一即时测定方法来获得资料，以测量HLA I类分子的肽解离度。首先，在大肠 杆菌中表达人重组HLA-B*08:01和b2m，并在一系列基于液相色谱的步骤中纯化(Ferre et al.,2003；Ostergaard et al.,2001)。然后，透过在37℃下测量与MHC重链相关的b2m随时 间的含量来确定肽-MHC复合体(pMHC)的稳定性(Harndahl et al.,2012)。透过将资料拟合 成单相解离方程来计算每个pMHC的稳定性，表示为与相应重链相关的b2m的半衰期。 [0474] 在三个独立实验中测量了pMHC的稳定性，发现所讨论肽的HLA-B*08:01跨越弱结 合剂( )至非常稳定结合剂( )的范围。平均半衰期(T1/2)见表17。 [0475] 表17：基于三次单独测量的平均半衰期(T1/2)。T1/2>2h＝ ；T1/2>4h＝ ；T1/2> 6h＝ ；T1/2>10h＝ [0476] 序列ID号 序列 平均半衰期(T1/2) 176 AAMSRYEL 177 DLKYNALDL 178 HAKEKLTAL 180 LLKAEPLAF 181 YKKLRTSSF 182 LPFLRENDL 183 FQKLKLLSL 184 EPVKKSRL 185 NPNLKTLL 93 CN 111548406 A 说 明 书 91/93 页 187 YVKERSKAM 189 HIFLRTTL 192 LPMLKVLNL 193 LSYNKYLQL 194 EAKRHLLQV [0477] 参考文献列表 [0478] Allison,J.P.et al.,Science 270(1995):932-933 [0479] Ampie,L.et al.,Front Oncol.5(2015):12 [0480] Andersen,R.S.et al.,Nat.Protoc.7(2012):891-902 [0481] Appay,V.et al.,Eur.J Immunol.36(2006):1805-1814 [0482] Avigan,D.et al.,Clin Cancer Res.10(2004):4699-4708 [0483] Banchereau,J.et al.,Cell 106(2001):271-274 [0484] Beatty,G.et al.,J Immunol 166(2001):2276-2282 [0485] Beggs,J.D.,Nature 275(1978):104-109 [0486] Berman ,R .S .et al .,National Cancer Institute:PDQ(R)Colon Cancer Treatment(2015a) [0487] Berman ,R .S .et al .,National Cancer Institute:PDQ(R)Rectal Cancer Treatment(2015b) [0488] Boulter,J.M.et al.,Protein Eng 16(2003):707-711 [0489] 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Tyr 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ala Ser Ser Thr Asp Ser Ala Ser Tyr Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Asn Ser Asp Leu Lys Tyr Asn Ala Leu 1 5 97 CN 111548406 A 序 列 表 2/49 页 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ser Ile Leu Gly Ser Asp Val Arg Val Pro Ser Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Val Leu Asp Leu Ser Thr Asn Val Tyr 1 5 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Leu Ile Thr Gly Asp Pro Lys Ala Ala Tyr Asp Tyr 1 5 10 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Thr Pro Val Thr Glu Phe Ser Leu Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Phe Ile Thr Ala Gln Asn His Gly Tyr 1 5 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens 98 CN 111548406 A 序 列 表 3/49 页 <400> 10 Ile Thr Ala Gln Asn His Gly Tyr 1 5 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Leu Ser Ala Gly Ser Gly Pro Gly Gln Tyr 1 5 10 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ile Thr Phe Gly Glu Arg Phe Glu Tyr 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Gly Ser Thr Met Val Glu His Asn Tyr 1 5 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Tyr Thr Glu Arg Asp Gly Ser Ala Met Val Tyr 1 5 10 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Leu Thr Asp Tyr Leu Lys Asn Thr Tyr 1 5 <210> 16 99 CN 111548406 A 序 列 表 4/49 页 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Leu Ser Leu Ile Asp Arg Leu Val Leu Tyr 1 5 10 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Tyr Thr Asp Lys Leu Gln His Tyr 1 5 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Glu Val Ser Asn Gly Lys Trp Leu Leu Tyr 1 5 10 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Val Ser Asn Gly Lys Trp Leu Leu Tyr 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Ser Thr Asp Glu Ile Thr Thr Arg Tyr 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 100 CN 111548406 A 序 列 表 5/49 页 Ser Thr Asp Ile Gly Ala Leu Met Tyr 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Thr Leu Glu Gln Val Gln Leu Tyr Tyr 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Thr Ala Ser Glu Asp Val Phe Gln Tyr 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Tyr Thr His His Leu Phe Ile Phe Tyr 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Leu Met Lys Glu Val Met Glu His Tyr 1 5 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Glu Val Leu Asp Ser His Ile His Ala Tyr 1 5 10 <210> 27 <211> 8 101 CN 111548406 A 序 列 表 6/49 页 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Leu Asp Ser His Ile His Ala Tyr 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Leu Thr Asp Tyr Ile Asn Ala Asn Tyr 1 5 <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Ser Val Thr Asp Leu Glu Met Pro His Tyr 1 5 10 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Val Leu Asp Ser His Ile His Ala Tyr 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Val Thr Asp Leu Glu Met Pro His Tyr 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Ala Thr Val Gly Tyr Phe Ile Phe Tyr 102 CN 111548406 A 序 列 表 7/49 页 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Phe Ala Asp Lys Ile His Leu Ala Tyr 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Ile Thr Asp Phe Asn Asn Ile Arg Tyr 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Phe Ala Ser Asp Leu Leu His Leu Tyr 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Tyr Ala Ala Tyr Ile Ile His Ala Tyr 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Leu Thr Asp Ser Phe Pro Leu Lys Val 1 5 <210> 38 <211> 9 <212> PRT 103 CN 111548406 A 序 列 表 8/49 页 <213> Homo sapiens <400> 38 Val Met Leu Asn Ser Asn Val Leu Leu 1 5 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Tyr Leu Leu Pro Ser Val Val Leu Leu 1 5 <210> 40 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Lys Ile Asp Asp Ile Trp Asn Leu Glu Val 1 5 10 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Ser Leu Gln Asp Thr Lys Ile Thr Leu 1 5 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Lys Met Met Ala Leu Val Ala Glu Leu 1 5 <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Gly Leu Met Thr Ile Val Thr Ser Leu 1 5 104 CN 111548406 A 序 列 表 9/49 页 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Ser Gln Thr Gly Phe Val Val Leu Val 1 5 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Lys Leu Leu Asp Glu Val Thr Tyr Leu 1 5 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Val Leu Ile Thr Gly Leu Pro Leu Ile 1 5 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Tyr Gln Asp Ser Trp Phe Gln Gln Leu 1 5 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Asn Leu Thr Phe Ile Ile Ile Leu Ile 1 5 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens 105 CN 111548406 A 序 列 表 10/49 页 <400> 49 Asn Leu Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Leu 1 5 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Glu Leu Met Pro Arg Val Tyr Thr Leu 1 5 <210> 51 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Ala Leu Ala Ala Glu Leu Asn Gln Leu 1 5 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Tyr Val Ser Ser Gly Glu Met Met Val 1 5 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Leu Leu Met Thr Ser Leu Thr Glu Ser 1 5 <210> 54 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Tyr Leu Pro Pro Thr Asp Pro Arg Met Ser Val 1 5 10 <210> 55 106 CN 111548406 A 序 列 表 11/49 页 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Arg Leu Trp Gln Ile Gln His His Leu 1 5 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Phe Leu Asn Gln Ile Tyr Thr Gln Leu 1 5 <210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Gly Leu Thr Gly Val Ile Met Thr Ile 1 5 <210> 58 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Met Leu Cys Leu Leu Leu Thr Leu 1 5 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Lys Leu His Glu Ile Tyr Ile Gln Ala 1 5 <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 107 CN 111548406 A 序 列 表 12/49 页 Gly Leu Pro Asp Phe Val Lys Glu Leu 1 5 <210> 61 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Arg Leu Phe Gly Leu Phe Leu Asn Asn Val 1 5 10 <210> 62 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Gly Ser Tyr Ser Ala Leu Leu Ala Lys Lys 1 5 10 <210> 63 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Lys Val Leu Gly Pro Asn Gly Leu Leu Lys 1 5 10 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Ser Thr Thr Lys Leu Tyr Leu Ala Lys 1 5 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Val Leu Gly Pro Asn Gly Leu Leu Lys 1 5 <210> 66 <211> 9 108 CN 111548406 A 序 列 表 13/49 页 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Ala Thr Tyr Glu Gly Ile Gln Lys Lys 1 5 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Ala Thr Ala Leu Ser Leu Ser Asn Lys 1 5 <210> 68 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Ala Thr Ala Tyr Gly Ser Thr Val Ser Lys 1 5 10 <210> 69 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Ala Thr Ala Tyr Gly Ser Thr Val Ser Lys Arg 1 5 10 <210> 70 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Ala Thr Trp Ser Ala Ser Leu Lys Asn Lys 1 5 10 <210> 71 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Lys Leu Gly Asn Asn Pro Val Ser Lys 109 CN 111548406 A 序 列 表 14/49 页 1 5 <210> 72 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Lys Gln Val Phe Pro Gly Leu Asn Tyr 1 5 <210> 73 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Lys Ser Phe Asp Arg His Phe Glu Lys 1 5 <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Gln Leu Tyr Ser Lys Phe Leu Leu Lys 1 5 <210> 75 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Gln Val Pro Thr Phe Thr Ile Pro Lys 1 5 <210> 76 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Ser Ala Phe Gly Tyr Val Phe Pro Lys 1 5 <210> 77 <211> 9 <212> PRT 110 CN 111548406 A 序 列 表 15/49 页 <213> Homo sapiens <400> 77 Ser Ser Ala Ser Leu Ala His Met Lys 1 5 <210> 78 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Ser Thr Lys Ser Thr Ser Pro Pro Lys 1 5 <210> 79 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Ser Thr Asn Asn Glu Gly Asn Leu Lys 1 5 <210> 80 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Ser Thr Ser His His Leu Val Ser Arg 1 5 <210> 81 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Ser Val Lys Leu Gln Gly Thr Ser Lys 1 5 <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Thr Ala Tyr Gly Ser Thr Val Ser Lys 1 5 111 CN 111548406 A 序 列 表 16/49 页 <210> 83 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Thr Ala Tyr Gly Ser Thr Val Ser Lys Arg 1 5 10 <210> 84 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Thr Val Ala Ser Leu His Thr Glu Lys 1 5 <210> 85 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85 Lys Met Ala Ala Trp Pro Phe Ser Arg 1 5 <210> 86 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Lys Thr Pro Ser Gly Ala Leu His Arg Lys 1 5 10 <210> 87 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87 Ser Ser Tyr Ser Arg Ser Ser Ala Val Lys 1 5 10 <210> 88 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens 112 CN 111548406 A 序 列 表 17/49 页 <400> 88 Met Leu Leu Gln Gln Pro Leu Ile Tyr 1 5 <210> 89 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys 1 5 <210> 90 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 Gly Ser Arg Leu Gly Lys Tyr Tyr Val Lys 1 5 10 <210> 91 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91 Ser Leu Ile Asp Arg Leu Val Leu Tyr 1 5 <210> 92 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92 Ala Val Leu Asp Leu Gly Ser Leu Leu Ala Lys 1 5 10 <210> 93 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93 Ala Leu Asp Lys Pro Gly Lys Ser Lys 1 5 <210> 94 113 CN 111548406 A 序 列 表 18/49 页 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94 Lys Thr Tyr Val Gly His Pro Val Lys Met 1 5 10 <210> 95 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Arg Leu Phe Glu Ser Ser Phe His Tyr 1 5 <210> 96 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 Phe Ser Leu Ala Gly Ala Leu Asn Ala Gly Phe Lys 1 5 10 <210> 97 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Arg Met Pro Pro Pro Leu Pro Thr Arg 1 5 <210> 98 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 98 Lys Leu Tyr Pro Thr Tyr Ser Thr Lys 1 5 <210> 99 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 114 CN 111548406 A 序 列 表 19/49 页 Ala Thr Met Gln Ser Lys Leu Ile Gln Lys 1 5 10 <210> 100 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 Ala Leu Leu Gly Val Ile Ile Ala Lys 1 5 <210> 101 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 101 Gly Val Ile Ile Ala Lys Lys Tyr Phe Phe Lys 1 5 10 <210> 102 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102 Ile Ile Ala Lys Lys Tyr Phe Phe Lys 1 5 <210> 103 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 103 Lys Ser Trp Thr Ala Ser Ser Ser Tyr 1 5 <210> 104 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 104 Ser Thr Gln Asp Thr Leu Leu Ile Lys 1 5 <210> 105 <211> 9 115 CN 111548406 A 序 列 表 20/49 页 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 105 Gly Ser Ala Ala Leu Tyr Leu Leu Arg 1 5 <210> 106 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 106 Arg Leu Ser Pro Asn Asp Gln Tyr Lys 1 5 <210> 107 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 107 Glu Ile Tyr Gly Gly His His Ala Gly Phe 1 5 10 <210> 108 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 108 Leu Leu Lys Ser Ser Val Gly Asn Phe Tyr 1 5 10 <210> 109 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 109 Lys Ile Ile Ala Pro Leu Val Thr Arg 1 5 <210> 110 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 110 Gly Thr Glu Ser Gly Thr Ile Leu Lys 116 CN 111548406 A 序 列 表 21/49 页 1 5 <210> 111 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 111 Lys Ile Lys Glu His Val Arg Ser Lys 1 5 <210> 112 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 112 Lys Met Met Ala Asp Tyr Gly Ile Arg Lys 1 5 10 <210> 113 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 113 Val Trp Ala Lys Ile Leu Ser Ala Phe 1 5 <210> 114 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 114 Lys Phe Leu Asp Ser Asn Ile Lys Phe 1 5 <210> 115 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 115 Tyr Phe Glu Glu Ala Ala Asn Phe Leu 1 5 <210> 116 <211> 12 <212> PRT 117 CN 111548406 A 序 列 表 22/49 页 <213> Homo sapiens <400> 116 Leu Val Leu Asp Tyr Ser Lys Asp Tyr Asn His Trp 1 5 10 <210> 117 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 117 Asn Phe Leu Pro Pro Ile Ile Ala Arg Phe 1 5 10 <210> 118 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 118 Thr Tyr Ile Ser Lys Thr Ile Ala Leu 1 5 <210> 119 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 119 Tyr Met Lys Ala Leu Gly Val Gly Phe 1 5 <210> 120 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 120 Met Tyr Ala Lys Glu Phe Asp Leu Leu 1 5 <210> 121 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 121 Ser Tyr Ile Glu Lys Val Arg Phe Leu 1 5 118 CN 111548406 A 序 列 表 23/49 页 <210> 122 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 122 Lys Leu Tyr Gly Met Pro Thr Asp Phe Gly Phe 1 5 10 <210> 123 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 123 Arg Gln Tyr Leu Ala Ile Asn Gln Ile 1 5 <210> 124 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 124 Glu Val Tyr Ser Pro Glu Ala Asp Gln Trp 1 5 10 <210> 125 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 125 Ile Tyr Gly Pro Lys Tyr Ile His Pro Ser Phe 1 5 10 <210> 126 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 126 Thr Phe Gln Asp Lys Thr Leu Asn Phe 1 5 <210> 127 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens 119 CN 111548406 A 序 列 表 24/49 页 <400> 127 Ile Phe Ile Asn Leu Ser Pro Glu Phe 1 5 <210> 128 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 128 Ser Tyr Thr Lys Val Glu Ala Arg Leu 1 5 <210> 129 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 129 Val Phe Leu Asn Gln Ile Tyr Thr Gln Leu 1 5 10 <210> 130 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 130 Val Tyr Gly Asp Gly His Tyr Leu Thr Phe 1 5 10 <210> 131 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 131 Lys Gln Leu Asp His Asn Leu Thr Phe 1 5 <210> 132 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 132 Val Tyr Asn Pro Val Ile Tyr Val Phe 1 5 <210> 133 120 CN 111548406 A 序 列 表 25/49 页 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 133 Ser Phe Asp Ser Asn Leu Leu Ser Phe 1 5 <210> 134 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 134 Thr Tyr Leu Thr Gly Arg Gln Phe 1 5 <210> 135 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 135 Val Ile Ala Pro Ile Ile Ser Asn Phe 1 5 <210> 136 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 136 Glu Tyr Asn Asn Ile Gln His Leu Phe 1 5 <210> 137 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 137 Lys Tyr Leu Ser Leu Ser Asn Ser Phe 1 5 <210> 138 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 138 121 CN 111548406 A 序 列 表 26/49 页 Lys Tyr Leu Ser Ile Pro Thr Val Phe 1 5 <210> 139 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 139 Pro Tyr Ala Ser Leu Ala Ser Glu Leu Phe 1 5 10 <210> 140 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 140 Lys Tyr Leu Ser Ile Pro Ala Val Phe 1 5 <210> 141 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 141 Lys Tyr Leu Ser Ile Pro Ala Val Phe Phe 1 5 10 <210> 142 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 142 Ser Ser Phe Pro Gly Ala Gly Asn Thr Trp 1 5 10 <210> 143 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 143 Phe Glu Leu Pro Thr Gly Ala Gly Leu Gln Leu 1 5 10 <210> 144 <211> 9 122 CN 111548406 A 序 列 表 27/49 页 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 144 Ile Pro Glu Pro Ser Ala Gln Gln Leu 1 5 <210> 145 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 145 Arg Val Pro Ser Tyr Thr Leu Ile Leu 1 5 <210> 146 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 146 Ser Pro Gly Asp Lys Arg Leu Ala Ala 1 5 <210> 147 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 147 Ser Pro Ile Lys Val Pro Leu Leu Leu 1 5 <210> 148 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 148 Val Pro Asp Gly Val Ser Lys Val Leu 1 5 <210> 149 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 149 Tyr Pro Leu Thr Gly Asp Thr Arg Leu 123 CN 111548406 A 序 列 表 28/49 页 1 5 <210> 150 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 150 Lys Pro Ser Ser Lys Ala Leu Gly Thr Ser Leu 1 5 10 <210> 151 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 151 Val Val His Pro Arg Thr Leu Leu Leu 1 5 <210> 152 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 152 Ile Pro Ser Arg Leu Leu Ala Ile Leu 1 5 <210> 153 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 153 Ala Pro Ala Ala Val Pro Ser Ala Pro Ala 1 5 10 <210> 154 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 154 Gly Pro Gly Thr Arg Leu Ser Leu 1 5 <210> 155 <211> 9 <212> PRT 124 CN 111548406 A 序 列 表 29/49 页 <213> Homo sapiens <400> 155 Phe Pro Tyr Pro Tyr Ala Glu Arg Leu 1 5 <210> 156 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 156 His Pro Gln Val Val Ile Leu Ser Leu 1 5 <210> 157 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 157 Ser Pro Ser Pro Gly Lys Asp Pro Thr Leu 1 5 10 <210> 158 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 158 Val Pro Glu Arg Gly Glu Pro Glu Leu 1 5 <210> 159 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 159 Phe Pro Ala His Pro Ser Leu Leu Leu 1 5 <210> 160 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 160 Arg Pro Ala Pro Ala Asp Ser Ala Leu 1 5 125 CN 111548406 A 序 列 表 30/49 页 <210> 161 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 161 Asn Pro Tyr Glu Gly Arg Val Glu Val 1 5 <210> 162 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 162 Met Pro Met Ile Ser Ile Pro Arg Val 1 5 <210> 163 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 163 Arg Pro Ala Ser Ser Leu Arg Pro 1 5 <210> 164 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 164 Ile Ser Thr Pro Ser Glu Val Ser Thr Pro Leu 1 5 10 <210> 165 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 165 Thr Pro Ile Ala Lys Val Ser Glu Leu 1 5 <210> 166 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens 126 CN 111548406 A 序 列 表 31/49 页 <400> 166 His Asp Pro Asp Val Gly Ser Asn Ser Leu 1 5 10 <210> 167 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 167 Tyr Pro Ser Glu Val Glu His Met Phe 1 5 <210> 168 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 168 Ile Pro Thr Asp Lys Leu Leu Val Ile 1 5 <210> 169 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 169 Phe Pro Thr Glu Val Thr Pro His Ala Phe 1 5 10 <210> 170 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 170 Ser Pro Met Trp His Val Gln Gln Leu 1 5 <210> 171 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 171 Ala Pro Lys Leu Phe Ala Val Ala Phe 1 5 <210> 172 127 CN 111548406 A 序 列 表 32/49 页 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 172 Lys Pro Ala His Tyr Pro Leu Ile Ala Leu 1 5 10 <210> 173 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 173 Met Val Pro Ser Ala Gly Gln Leu Ala Leu Phe 1 5 10 <210> 174 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 174 Val Pro Ser Leu Gln Arg Leu Met Leu 1 5 <210> 175 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 175 His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe 1 5 10 <210> 176 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 176 Ala Ala Met Ser Arg Tyr Glu Leu 1 5 <210> 177 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 177 128 CN 111548406 A 序 列 表 33/49 页 Asp Leu Lys Tyr Asn Ala Leu Asp Leu 1 5 <210> 178 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 178 His Ala Lys Glu Lys Leu Thr Ala Leu 1 5 <210> 179 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 179 Ile Gln Ile Tyr Lys Lys Leu Arg Thr Ser Ser Phe 1 5 10 <210> 180 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 180 Leu Leu Lys Ala Glu Pro Leu Ala Phe 1 5 <210> 181 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 181 Tyr Lys Lys Leu Arg Thr Ser Ser Phe 1 5 <210> 182 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 182 Leu Pro Phe Leu Arg Glu Asn Asp Leu 1 5 <210> 183 <211> 9 129 CN 111548406 A 序 列 表 34/49 页 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 183 Phe Gln Lys Leu Lys Leu Leu Ser Leu 1 5 <210> 184 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 184 Glu Pro Val Lys Lys Ser Arg Leu 1 5 <210> 185 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 185 Asn Pro Asn Leu Lys Thr Leu Leu 1 5 <210> 186 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 186 Ser Leu Ile Asp Arg Leu Val Leu 1 5 <210> 187 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 187 Tyr Val Lys Glu Arg Ser Lys Ala Met 1 5 <210> 188 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 188 Ser Ala Leu Asp His Val Thr Arg Leu 130 CN 111548406 A 序 列 表 35/49 页 1 5 <210> 189 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 189 His Ile Phe Leu Arg Thr Thr Leu 1 5 <210> 190 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 190 Ser Arg Ser Met Arg Leu Leu Leu Leu 1 5 <210> 191 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 191 Leu Ile Asn Leu Lys Tyr Leu Ser Leu 1 5 <210> 192 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 192 Leu Pro Met Leu Lys Val Leu Asn Leu 1 5 <210> 193 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 193 Leu Ser Tyr Asn Lys Tyr Leu Gln Leu 1 5 <210> 194 <211> 9 <212> PRT 131 CN 111548406 A 序 列 表 36/49 页 <213> Homo sapiens <400> 194 Glu Ala Lys Arg His Leu Leu Gln Val 1 5 <210> 195 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 195 Ala Glu Ala Val Leu Lys Thr Leu Gln Glu Leu 1 5 10 <210> 196 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 196 Ala Glu Gln Thr Gly Thr Trp Lys Leu 1 5 <210> 197 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 197 Glu Glu Ala Lys Gln Val Leu Phe Leu 1 5 <210> 198 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 198 Phe Glu Leu Pro Thr Gly Ala Gly Leu 1 5 <210> 199 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 199 Gly Glu Ala Thr Leu Gln Arg Ile Tyr 1 5 132 CN 111548406 A 序 列 表 37/49 页 <210> 200 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 200 Gly Glu Glu Leu Gly Phe Ala Ser Leu 1 5 <210> 201 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 201 Gly Glu His Thr Ser Lys Ala Thr Leu 1 5 <210> 202 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 202 Lys Glu Phe Asn Leu Gln Asn Met Gly Leu 1 5 10 <210> 203 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 203 Lys Glu Asn Phe Ala Gly Glu Ala Thr Leu 1 5 10 <210> 204 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 204 Lys Glu Ser Gln Leu Pro Thr Val Met 1 5 <210> 205 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens 133 CN 111548406 A 序 列 表 38/49 页 <400> 205 Gln Glu Val Leu Leu Gln Thr Phe Leu 1 5 <210> 206 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 206 Ser Glu Pro Ile Asn Ile Ile Asp Ala Leu 1 5 10 <210> 207 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 207 Thr Glu Ala Thr Met Thr Phe Lys Tyr 1 5 <210> 208 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 208 Ala Glu His Asp Ala Val Arg Asn Ala Leu 1 5 10 <210> 209 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 209 Tyr Glu Val Asp Thr Val Leu Arg Tyr 1 5 <210> 210 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 210 Ser Glu Asn Ile Val Ile Gln Val Tyr 1 5 <210> 211 134 CN 111548406 A 序 列 表 39/49 页 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 211 Thr Glu Lys Glu Met Ile Gln Lys Leu 1 5 <210> 212 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 212 Ala Glu Glu Thr Cys Ala Pro Ser Val 1 5 <210> 213 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 213 Thr Thr Met Asp Gln Lys Ser Leu Trp 1 5 <210> 214 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 214 Ala Glu Gln Pro Asp Gly Leu Ile Leu 1 5 <210> 215 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 215 Ala Phe Ile Thr Ala Gln Asn His Gly Tyr 1 5 10 <210> 216 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 216 135 CN 111548406 A 序 列 表 40/49 页 Leu Gln Glu Glu Lys Val Pro Ala Ile Tyr 1 5 10 <210> 217 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 217 Asn Glu Ile Asn Glu Lys Ile Ala Pro Ser Phe 1 5 10 <210> 218 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 218 Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp 1 5 10 <210> 219 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 219 Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val 1 5 <210> 220 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 220 Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile 1 5 <210> 221 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 221 Ala Glu Glu Arg Ala Glu Ala Lys Lys Lys Phe 1 5 10 <210> 222 <211> 9 136 CN 111548406 A 序 列 表 41/49 页 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 222 Asn Glu Ile Ser Thr Phe His Asn Leu 1 5 <210> 223 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 223 Ser Glu Val Pro Val Ala Arg Val Trp 1 5 <210> 224 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 224 Ser Glu Ser Ala Val Phe His Gly Phe 1 5 <210> 225 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 225 Ser Glu Ala Phe Pro Ser Arg Ala Leu 1 5 <210> 226 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 226 Glu Glu Leu Leu His Gly Gln Leu Phe 1 5 <210> 227 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 227 Thr Glu His Thr Gln Ser Gln Ala Ala Trp 137 CN 111548406 A 序 列 表 42/49 页 1 5 10 <210> 228 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 228 Ala Glu Lys Gln Thr Pro Asp Gly Arg Lys Tyr 1 5 10 <210> 229 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 229 Lys Glu Ser Asp Gly Phe His Arg Phe 1 5 <210> 230 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 230 Ala Glu Asn Leu Phe Arg Ala Phe Leu 1 5 <210> 231 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 231 Ala Glu Ile His Thr Ala Glu Ile 1 5 <210> 232 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 232 Ala Glu Lys Asp Gly Lys Leu Thr Asp Tyr 1 5 10 <210> 233 <211> 10 <212> PRT 138 CN 111548406 A 序 列 表 43/49 页 <213> Homo sapiens <400> 233 Asp Glu Ser Glu Lys Thr Thr Lys Ser Phe 1 5 10 <210> 234 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 234 Glu Glu Glu Ser Leu Leu Thr Ser Phe 1 5 <210> 235 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 235 Glu Glu Phe Glu Thr Leu Lys Glu Phe 1 5 <210> 236 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 236 Glu Glu Lys Leu Ile Ile Gln Asp Phe 1 5 <210> 237 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 237 Leu Glu Met Pro His Tyr Ser Thr Phe 1 5 <210> 238 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 238 Ser Glu Asn Pro Glu Thr Ile Thr Tyr 1 5 139 CN 111548406 A 序 列 表 44/49 页 <210> 239 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 239 Thr Glu Val Leu Asp Ser His Ile His Ala Tyr 1 5 10 <210> 240 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 240 His Glu Leu Glu Asn His Ser Met Tyr 1 5 <210> 241 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 241 Arg Glu Ala Glu Pro Ile Pro Lys Met 1 5 <210> 242 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 242 Phe Ser Asp Lys Glu Leu Ala Ala Tyr 1 5 <210> 243 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 243 Arg Ser Pro Asn Asn Phe Leu Ser Tyr 1 5 <210> 244 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens 140 CN 111548406 A 序 列 表 45/49 页 <400> 244 Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asn Val 1 5 <210> 245 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 245 Ile Thr Glu Lys Asn Ser Gly Leu Tyr 1 5 <210> 246 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 246 Tyr Ser Asp Leu His Ala Phe Tyr Tyr 1 5 <210> 247 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 247 Arg Ser Asp Pro Gly Gly Gly Gly Leu Ala Tyr 1 5 10 <210> 248 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 248 Tyr Ser His Ala Ala Gly Gln Gly Thr Gly Leu Tyr 1 5 10 <210> 249 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 249 Ala Leu Phe Pro Glu Arg Ile Thr Val 1 5 <210> 250 141 CN 111548406 A 序 列 表 46/49 页 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 250 Lys Met Ile Leu Lys Met Val Gln Leu 1 5 <210> 251 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 251 Arg Leu Ala Ser Arg Pro Leu Leu Leu 1 5 <210> 252 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 252 Arg Ile Tyr Asn Gly Ile Gly Val Ser Arg 1 5 10 <210> 253 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 253 Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys 1 5 <210> 254 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 254 Ala Val Ala Thr Lys Phe Val Asn Lys 1 5 <210> 255 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 255 142 CN 111548406 A 序 列 表 47/49 页 Leu Pro Asp Gly Ser Arg Val Glu Leu 1 5 <210> 256 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 256 Leu Pro Ala Leu Pro Gln Gln Leu Ile 1 5 <210> 257 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 257 Ser Pro Leu Arg Gly Gly Ser Ser Leu 1 5 <210> 258 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 258 Ala Pro Ser Gly Thr Arg Val Val Gln Val Leu 1 5 10 <210> 259 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 259 Arg Pro Ala Val Gly His Ser Gly Leu 1 5 <210> 260 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 260 Glu Glu Ala Pro Leu Val Thr Lys Ala Phe 1 5 10 <210> 261 <211> 9 143 CN 111548406 A 序 列 表 48/49 页 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 261 Ile Glu Ala Leu Leu Glu Ser Ser Leu 1 5 <210> 262 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 262 Met Glu Leu Leu Leu Val Asn Lys Leu 1 5 <210> 263 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 263 Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Tyr 1 5 <210> 264 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 264 Asp Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe 1 5 10 <210> 265 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 265 Glu Glu Val Asp Val Pro Ile Lys Leu Tyr 1 5 10 <210> 266 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 266 Ala Arg Leu Thr Pro Ile Pro Phe Gly Leu 144 CN 111548406 A 序 列 表 49/49 页 1 5 10 <210> 267 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 267 Lys Thr Leu Gly Lys Leu Trp Arg Leu 1 5 <210> 268 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 268 Asp Tyr Ile Pro Tyr Val Phe Lys Leu 1 5 <210> 269 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 269 Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val 1 5 10 <210> 270 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 270 Tyr Leu Leu Pro Ala Ile Val His Ile 1 5 145 CN 111548406 A 说 明 书 附 图 1/23 页 图1A 146 CN 111548406 A 说 明 书 附 图 2/23 页 图1B 147 CN 111548406 A 说 明 书 附 图 3/23 页 图1C 148 CN 111548406 A 说 明 书 附 图 4/23 页 图1D 149 CN 111548406 A 说 明 书 附 图 5/23 页 图1E 150 CN 111548406 A 说 明 书 附 图 6/23 页 图1F 151 CN 111548406 A 说 明 书 附 图 7/23 页 图1G 152 CN 111548406 A 说 明 书 附 图 8/23 页 图1H 153 CN 111548406 A 说 明 书 附 图 9/23 页 图1I 154 CN 111548406 A 说 明 书 附 图 10/23 页 图1J 155 CN 111548406 A 说 明 书 附 图 11/23 页 图1K 156 CN 111548406 A 说 明 书 附 图 12/23 页 图1L 157 CN 111548406 A 说 明 书 附 图 13/23 页 图1M 158 CN 111548406 A 说 明 书 附 图 14/23 页 图1N 159 CN 111548406 A 说 明 书 附 图 15/23 页 图1O 160 CN 111548406 A 说 明 书 附 图 16/23 页 图1P 161 CN 111548406 A 说 明 书 附 图 17/23 页 图2 图3 162 CN 111548406 A 说 明 书 附 图 18/23 页 图4 163 CN 111548406 A 说 明 书 附 图 19/23 页 图5 164 CN 111548406 A 说 明 书 附 图 20/23 页 图6 165 CN 111548406 A 说 明 书 附 图 21/23 页 图7 166 CN 111548406 A 说 明 书 附 图 22/23 页 图8 167 CN 111548406 A 说 明 书 附 图 23/23 页 图9 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