技术摘要：
本发明公开了一种ATP依赖的甘露糖激酶及其在岩藻基乳糖合成中的应用，选自如下(a)～(c)所述的多肽：(a)由SEQ ID NO.1或者SEQ ID NO.2或者SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)由(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有催化甘露糖6‑磷酸 全部
背景技术：
人乳寡糖(主要包含岩藻基寡糖和唾液酸基寡糖)具有促进双歧杆菌在肠道上皮 增殖和定殖，抑制病原菌黏附，维持婴儿肠道菌群平衡、参加机体免疫、促进脑部发育等生 理功能，已逐渐成为人们关注的热点。目前欧盟已批准若干种人乳低聚寡糖作为食品配料， 应用于婴幼儿用奶粉、老人用健康功能食品原材料以及医药品原材料中，市场前景非常广 阔。迄今为止已鉴定了约200种结构各异的HMO，含量最为丰富同时最重要的是岩藻糖基乳 糖。 目前人乳低聚寡糖主要依赖于化学合成，然而化学合成过程复杂，需要多步保护 和去保护步骤，造成低选择性、低得率、溶剂有毒不适合于食品应用，同时化学合成需要昂 贵的岩藻糖或者唾液酸作为底物，造成生产成本高，所以如何降低人乳寡糖的生产成本，提 高合成效率和食品安全性已经成为迫切需要解决的问题；酶法催化合成岩藻基乳糖，往往 需要昂贵的前体GDP-岩藻糖，且前体来源有限，难以实现大规模生产。与化学合成和酶法催 化方法相比，微生物发酵法生产岩藻基乳糖具有明显优势；目前已经报道了多个微生物重 组菌株用于发酵合成岩藻基乳糖如CN201610562080 .9；CN201 811072267 .6； CN201811516891.0；CN201910093684.7等，这些菌株大都以葡萄糖或者岩藻糖和乳糖为原 料发酵合成岩藻基乳糖；相关研究发现以甘露糖为碳源进行发酵时，岩藻基乳糖合成前体 GDP-甘露糖细胞内积累量更高，因此相关专利CN201910396709.0公布了以甘露糖为原料制 备岩藻基乳糖方法。在该专利中，甘露糖通过葡萄糖激酶转化为甘露糖6-磷酸，后者经过甘 露糖6-磷酸变位酶转化为甘露糖1-磷酸，进而进入岩藻基乳糖合成途径，由于甘露糖6-磷 酸也可以异构为果糖6-磷酸，被细胞代谢，所以该专利中甘露糖转化率较低。甘露糖1-糖激 酶催化甘露糖和ATP转化为甘露糖1-磷酸和ADP，所获得的甘露糖1-磷酸可进入岩藻糖合成 途径用于合成岩藻基乳糖，与CN201910396709.0专利报道路径相比，含有甘露糖1-糖激酶 的岩藻基乳糖合成途径具有反应步骤短、效率高、降低细胞生长代谢消耗等优势；因此，筛 选效率高且催化甘露糖转化为甘露糖1-磷酸的糖激酶，对于提升甘露糖转化为岩藻基乳糖 的合成效率至关重要。
技术实现要素：
本发明的目的之一在于提供一种催化甘露糖磷酸化生成甘露糖1-磷酸的酶，在本 发明中，这种具有催化甘露糖磷酸化生成甘露糖1-磷酸功能的酶命名为甘露糖激酶MK，选 自如下(a)～(c)所述的多肽： (a)由SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.2,和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列组成的多肽； (b)由(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有催化甘 4 CN 111549013 A 说 明 书 2/6 页 露糖6-磷酸脱磷酸功能由(a)衍生的多肽； 在本领域中,用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功 能。同时，在C末端或N末端添加一个或数个氨基酸，通常也不会改变蛋白质的功能。 (c)与(a)中的氨基酸序列有70％以上同一性的氨基酸序列，且催化甘露糖磷酸化 生成甘露糖1-磷酸功能的多肽。 另外还包括如(a)中所示氨基酸序列的多肽的基础上的活性片段、或其活性衍生 物、类似物。所述“活性片段”、“活性衍生物”和“活性类似物”是指在基本上保持本发明M6PP 多肽相同的生物学功能或活性的多肽。 本发明的目的之二在于提供一种多核苷酸： (d)编码权利要求1中(a)～(c)所述多肽的多核苷酸。 (e)编码权利要求1中(a)～(c)所述多肽的片段、类似物或衍生物的多核苷酸； (f)在严格条件下与(d)或(e)限定的多核苷酸序列杂交且编码具有催化甘露糖6- 磷酸脱磷酸功能多肽的多核苷酸； (h)与(d)或(e)或(f)限定的多核苷酸序列有70％同一性且编码具有催化甘露糖 6-磷酸脱磷酸功能的蛋白质的多核苷酸。其中，与上述(d)或(e)或(f)限定的多核苷酸序列 杂交的核酸片段，长度至少含10个核苷酸，优选地，20个核苷酸以上，更优选地，50个核苷酸 以上，最佳为100个核苷酸以上。 进一步地，上述多核苷酸为DNA或RNA。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的 DNA。DNA可以单链的或者是双链的；DNA可以是编码链或非编码链。 本发明的目的之三在于提供一种含有编码甘露糖激酶MK多肽多核苷酸的重组载 体。 所述重组载体指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、动物 细胞病毒、逆转录病毒或其它载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的 基于T7启动子的表达载体，如pET-21a等，只要能在宿主细胞内稳定复制和存在，任何载体 都可以用于构建重组表达载体。 本发明的目的之四是提供用于发酵生产2'-岩藻糖基乳糖的谷氨酸棒杆菌重组菌 株。 所述重组菌株通过强化表达乳糖透过酶、α-1 ,2-岩藻糖转移酶、磷酸甘露糖变位 酶基因，甘露糖1-磷酸鸟苷转移酶基因，鸟苷二磷酸甘露糖4,6-脱水酶基因，鸟苷二磷酸岩 藻糖合成酶基因，糖外排转运蛋白基因的表达；进一步强化糖激酶MK基因表达获得的。 具体的乳糖透过酶基因可选自来源于大肠杆菌(E.coli)，α-1,2-岩藻糖转移酶基 因可选自幽门螺旋菌(Helicobacter pylori)或者E.coli，优选幽门螺旋菌，所述糖外排转 运蛋白选自伯氏耶尔森氏菌(Yersinia bercovieri)；磷酸甘露糖变位酶、甘露糖1-磷酸鸟 苷转移酶、鸟苷二磷酸甘露糖4,6-脱水酶、可选自来源于大肠杆菌，鸟苷二磷酸岩藻糖合成 酶均选自来源于E .coli；甘露糖激酶可选自来源于长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)。 本发明目的之五在于提供所述的合成2'-岩藻糖基乳糖的谷氨酸棒杆菌重组菌株 的构建方法，具体包括以下步骤： 1)构建包含乳糖透过酶基因、α-1 ,2-岩藻糖转移酶基因、糖外排转运蛋白基因的 5 CN 111549013 A 说 明 书 3/6 页 重组表达载体pX1。 所述重组表达载体pX1的具体方法包括以下步骤： PCR扩增来源于大肠杆菌的乳糖透过酶基因lacY(SEQ ID NO.4)，来源于幽门螺旋 菌的α-1,2-岩藻糖转移酶基因futC(SEQ ID NO.5)，来源于伯氏耶尔森氏菌的糖外排转运 蛋白基因yberc0001_9420(SEQ ID NO.6)；采用酶切连接方法将上述片段构建至表达载体 pXMJ19(Jakoby,M.；Ngouoto-Nkili,C.-E.；Burkovski,A.Construction and application of new Corynebacterium glutamicum vectors.Biotechnol.Tech.1999,13,437-441.) 中，获得重组表达载体pX1。 2)构建包含磷酸甘露糖变位酶基因，甘露糖1-磷酸鸟苷转移酶基因，鸟苷二磷酸 甘露糖4,6-脱水酶基因，鸟苷二磷酸岩藻糖合成酶基因的重组表达载体pE1。 所述重组表达载体pE1的具体方法包括以下步骤： PCR扩增来源于大肠杆菌的磷酸甘露糖变位酶基因(SEQ ID NO.7)，甘露糖1-磷酸 鸟苷转移酶基因(SEQ ID NO.8)，鸟苷二磷酸甘露糖4,6-脱水酶基因(SEQ ID NO.9)，鸟苷 二磷酸岩藻糖合成酶基因(SEQ ID NO.10)；采用酶切连接方法将上述片段构建至表达载体 pEC-XK99E(Kirchner ,O .；Tauch ,A .Tools for genetic engineering in the amino acid-producing bacterium Corynebacterium glutamicum .J .Biotechnol.2003,104 , 287-299)中，获得重组表达载体pE1。 4)将重组表达载体pX1和pE1电转化至谷氨酸棒杆菌13032中，获得重组菌株 CglFL-1。 具体的，制备谷氨酸棒杆菌感受态，采用电转化方式，将重组表达载体pX1和pE1共 转入野生型谷氨酸棒杆菌13032中，得到重组菌株CglFL-1。 5)构建包含甘露糖激酶，磷酸甘露糖变位酶基因，甘露糖1-磷酸鸟苷转移酶基因， 鸟苷二磷酸甘露糖4,6-脱水酶基因，鸟苷二磷酸岩藻糖合成酶基因的重组表达载体pE2。 所述重组表达载体pE2的具体方法包括以下步骤： PCR扩增来源于长双歧杆菌的甘露糖激酶基因(SEQ ID NO.11)；采用酶切连接方 法将上述片段构建至重组表达载体pE1中，获得重组表达载体pE2。 6)将重组表达载体pX1和pE2电转化至谷氨酸棒杆菌13032中，获得重组菌株 CglFL-2。 具体的，制备谷氨酸棒杆菌感受态，采用电转化方式，将重组表达载体pX1和pE2共 转入野生型谷氨酸棒杆菌13032中，得到重组菌株CglFL-2。 本发明目的之六在于提供谷氨酸棒杆菌重组菌株CglFL-1和CglFL-2在2'-岩藻糖 基乳糖合成方面的应用，其特征表现为，重组菌株CglFL-1和CglFL-2可以发酵甘露糖和乳 糖合成2'-岩藻基乳糖。 在优选地实施方式中，所述的方法，其特征在于，发酵生产条件初始菌体密度菌体 浓度(OD600)为0.5-60；温度30-37℃；甘露糖为20-80g/L，乳糖浓度10-40g/L。 在更优选地实施方式中，所述的方法，其特征在于，初始菌体浓度(OD600)为40，甘 露糖为40g/L,乳糖浓度20g/L。 本发明的有益效果为所构建的含有甘露糖激酶的重组谷氨酸棒杆菌，以甘露糖为 碳源进行发酵时，岩藻基乳糖产量明显高于以葡萄糖为碳源进行发酵，生产的岩藻基乳糖 6 CN 111549013 A 说 明 书 4/6 页 将在食品和医药行业具有广泛的应用前景。 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
本发明公开了一种ATP依赖的甘露糖激酶及其在岩藻基乳糖合成中的应用，选自如下(a)～(c)所述的多肽：(a)由SEQ ID NO.1或者SEQ ID NO.2或者SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)由(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有催化甘露糖6‑磷酸 全部
背景技术：
人乳寡糖(主要包含岩藻基寡糖和唾液酸基寡糖)具有促进双歧杆菌在肠道上皮 增殖和定殖，抑制病原菌黏附，维持婴儿肠道菌群平衡、参加机体免疫、促进脑部发育等生 理功能，已逐渐成为人们关注的热点。目前欧盟已批准若干种人乳低聚寡糖作为食品配料， 应用于婴幼儿用奶粉、老人用健康功能食品原材料以及医药品原材料中，市场前景非常广 阔。迄今为止已鉴定了约200种结构各异的HMO，含量最为丰富同时最重要的是岩藻糖基乳 糖。 目前人乳低聚寡糖主要依赖于化学合成，然而化学合成过程复杂，需要多步保护 和去保护步骤，造成低选择性、低得率、溶剂有毒不适合于食品应用，同时化学合成需要昂 贵的岩藻糖或者唾液酸作为底物，造成生产成本高，所以如何降低人乳寡糖的生产成本，提 高合成效率和食品安全性已经成为迫切需要解决的问题；酶法催化合成岩藻基乳糖，往往 需要昂贵的前体GDP-岩藻糖，且前体来源有限，难以实现大规模生产。与化学合成和酶法催 化方法相比，微生物发酵法生产岩藻基乳糖具有明显优势；目前已经报道了多个微生物重 组菌株用于发酵合成岩藻基乳糖如CN201610562080 .9；CN201 811072267 .6； CN201811516891.0；CN201910093684.7等，这些菌株大都以葡萄糖或者岩藻糖和乳糖为原 料发酵合成岩藻基乳糖；相关研究发现以甘露糖为碳源进行发酵时，岩藻基乳糖合成前体 GDP-甘露糖细胞内积累量更高，因此相关专利CN201910396709.0公布了以甘露糖为原料制 备岩藻基乳糖方法。在该专利中，甘露糖通过葡萄糖激酶转化为甘露糖6-磷酸，后者经过甘 露糖6-磷酸变位酶转化为甘露糖1-磷酸，进而进入岩藻基乳糖合成途径，由于甘露糖6-磷 酸也可以异构为果糖6-磷酸，被细胞代谢，所以该专利中甘露糖转化率较低。甘露糖1-糖激 酶催化甘露糖和ATP转化为甘露糖1-磷酸和ADP，所获得的甘露糖1-磷酸可进入岩藻糖合成 途径用于合成岩藻基乳糖，与CN201910396709.0专利报道路径相比，含有甘露糖1-糖激酶 的岩藻基乳糖合成途径具有反应步骤短、效率高、降低细胞生长代谢消耗等优势；因此，筛 选效率高且催化甘露糖转化为甘露糖1-磷酸的糖激酶，对于提升甘露糖转化为岩藻基乳糖 的合成效率至关重要。
技术实现要素：
本发明的目的之一在于提供一种催化甘露糖磷酸化生成甘露糖1-磷酸的酶，在本 发明中，这种具有催化甘露糖磷酸化生成甘露糖1-磷酸功能的酶命名为甘露糖激酶MK，选 自如下(a)～(c)所述的多肽： (a)由SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.2,和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列组成的多肽； (b)由(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有催化甘 4 CN 111549013 A 说 明 书 2/6 页 露糖6-磷酸脱磷酸功能由(a)衍生的多肽； 在本领域中,用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功 能。同时，在C末端或N末端添加一个或数个氨基酸，通常也不会改变蛋白质的功能。 (c)与(a)中的氨基酸序列有70％以上同一性的氨基酸序列，且催化甘露糖磷酸化 生成甘露糖1-磷酸功能的多肽。 另外还包括如(a)中所示氨基酸序列的多肽的基础上的活性片段、或其活性衍生 物、类似物。所述“活性片段”、“活性衍生物”和“活性类似物”是指在基本上保持本发明M6PP 多肽相同的生物学功能或活性的多肽。 本发明的目的之二在于提供一种多核苷酸： (d)编码权利要求1中(a)～(c)所述多肽的多核苷酸。 (e)编码权利要求1中(a)～(c)所述多肽的片段、类似物或衍生物的多核苷酸； (f)在严格条件下与(d)或(e)限定的多核苷酸序列杂交且编码具有催化甘露糖6- 磷酸脱磷酸功能多肽的多核苷酸； (h)与(d)或(e)或(f)限定的多核苷酸序列有70％同一性且编码具有催化甘露糖 6-磷酸脱磷酸功能的蛋白质的多核苷酸。其中，与上述(d)或(e)或(f)限定的多核苷酸序列 杂交的核酸片段，长度至少含10个核苷酸，优选地，20个核苷酸以上，更优选地，50个核苷酸 以上，最佳为100个核苷酸以上。 进一步地，上述多核苷酸为DNA或RNA。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的 DNA。DNA可以单链的或者是双链的；DNA可以是编码链或非编码链。 本发明的目的之三在于提供一种含有编码甘露糖激酶MK多肽多核苷酸的重组载 体。 所述重组载体指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、动物 细胞病毒、逆转录病毒或其它载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的 基于T7启动子的表达载体，如pET-21a等，只要能在宿主细胞内稳定复制和存在，任何载体 都可以用于构建重组表达载体。 本发明的目的之四是提供用于发酵生产2'-岩藻糖基乳糖的谷氨酸棒杆菌重组菌 株。 所述重组菌株通过强化表达乳糖透过酶、α-1 ,2-岩藻糖转移酶、磷酸甘露糖变位 酶基因，甘露糖1-磷酸鸟苷转移酶基因，鸟苷二磷酸甘露糖4,6-脱水酶基因，鸟苷二磷酸岩 藻糖合成酶基因，糖外排转运蛋白基因的表达；进一步强化糖激酶MK基因表达获得的。 具体的乳糖透过酶基因可选自来源于大肠杆菌(E.coli)，α-1,2-岩藻糖转移酶基 因可选自幽门螺旋菌(Helicobacter pylori)或者E.coli，优选幽门螺旋菌，所述糖外排转 运蛋白选自伯氏耶尔森氏菌(Yersinia bercovieri)；磷酸甘露糖变位酶、甘露糖1-磷酸鸟 苷转移酶、鸟苷二磷酸甘露糖4,6-脱水酶、可选自来源于大肠杆菌，鸟苷二磷酸岩藻糖合成 酶均选自来源于E .coli；甘露糖激酶可选自来源于长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)。 本发明目的之五在于提供所述的合成2'-岩藻糖基乳糖的谷氨酸棒杆菌重组菌株 的构建方法，具体包括以下步骤： 1)构建包含乳糖透过酶基因、α-1 ,2-岩藻糖转移酶基因、糖外排转运蛋白基因的 5 CN 111549013 A 说 明 书 3/6 页 重组表达载体pX1。 所述重组表达载体pX1的具体方法包括以下步骤： PCR扩增来源于大肠杆菌的乳糖透过酶基因lacY(SEQ ID NO.4)，来源于幽门螺旋 菌的α-1,2-岩藻糖转移酶基因futC(SEQ ID NO.5)，来源于伯氏耶尔森氏菌的糖外排转运 蛋白基因yberc0001_9420(SEQ ID NO.6)；采用酶切连接方法将上述片段构建至表达载体 pXMJ19(Jakoby,M.；Ngouoto-Nkili,C.-E.；Burkovski,A.Construction and application of new Corynebacterium glutamicum vectors.Biotechnol.Tech.1999,13,437-441.) 中，获得重组表达载体pX1。 2)构建包含磷酸甘露糖变位酶基因，甘露糖1-磷酸鸟苷转移酶基因，鸟苷二磷酸 甘露糖4,6-脱水酶基因，鸟苷二磷酸岩藻糖合成酶基因的重组表达载体pE1。 所述重组表达载体pE1的具体方法包括以下步骤： PCR扩增来源于大肠杆菌的磷酸甘露糖变位酶基因(SEQ ID NO.7)，甘露糖1-磷酸 鸟苷转移酶基因(SEQ ID NO.8)，鸟苷二磷酸甘露糖4,6-脱水酶基因(SEQ ID NO.9)，鸟苷 二磷酸岩藻糖合成酶基因(SEQ ID NO.10)；采用酶切连接方法将上述片段构建至表达载体 pEC-XK99E(Kirchner ,O .；Tauch ,A .Tools for genetic engineering in the amino acid-producing bacterium Corynebacterium glutamicum .J .Biotechnol.2003,104 , 287-299)中，获得重组表达载体pE1。 4)将重组表达载体pX1和pE1电转化至谷氨酸棒杆菌13032中，获得重组菌株 CglFL-1。 具体的，制备谷氨酸棒杆菌感受态，采用电转化方式，将重组表达载体pX1和pE1共 转入野生型谷氨酸棒杆菌13032中，得到重组菌株CglFL-1。 5)构建包含甘露糖激酶，磷酸甘露糖变位酶基因，甘露糖1-磷酸鸟苷转移酶基因， 鸟苷二磷酸甘露糖4,6-脱水酶基因，鸟苷二磷酸岩藻糖合成酶基因的重组表达载体pE2。 所述重组表达载体pE2的具体方法包括以下步骤： PCR扩增来源于长双歧杆菌的甘露糖激酶基因(SEQ ID NO.11)；采用酶切连接方 法将上述片段构建至重组表达载体pE1中，获得重组表达载体pE2。 6)将重组表达载体pX1和pE2电转化至谷氨酸棒杆菌13032中，获得重组菌株 CglFL-2。 具体的，制备谷氨酸棒杆菌感受态，采用电转化方式，将重组表达载体pX1和pE2共 转入野生型谷氨酸棒杆菌13032中，得到重组菌株CglFL-2。 本发明目的之六在于提供谷氨酸棒杆菌重组菌株CglFL-1和CglFL-2在2'-岩藻糖 基乳糖合成方面的应用，其特征表现为，重组菌株CglFL-1和CglFL-2可以发酵甘露糖和乳 糖合成2'-岩藻基乳糖。 在优选地实施方式中，所述的方法，其特征在于，发酵生产条件初始菌体密度菌体 浓度(OD600)为0.5-60；温度30-37℃；甘露糖为20-80g/L，乳糖浓度10-40g/L。 在更优选地实施方式中，所述的方法，其特征在于，初始菌体浓度(OD600)为40，甘 露糖为40g/L,乳糖浓度20g/L。 本发明的有益效果为所构建的含有甘露糖激酶的重组谷氨酸棒杆菌，以甘露糖为 碳源进行发酵时，岩藻基乳糖产量明显高于以葡萄糖为碳源进行发酵，生产的岩藻基乳糖 6 CN 111549013 A 说 明 书 4/6 页 将在食品和医药行业具有广泛的应用前景。 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
