技术摘要：
本发明提供了用于治疗和诊断神经变性疾病的新手段和方法。特别地，所述手段和方法包括含有CARD的凋亡相关斑点样蛋白质的配体。本文还提供了编码此类配体的核酸，以及包含该配体的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及药物组合物以及试剂盒和诊断试剂盒。
背景技术：
一起列出，但是，应该 理解，它们可以以任何方式和任何数量组合以创建额外的实施方式。各种描述的示例和优 选实施方式不应被解释为将本发明限制为仅明确描述的实施方式。该描述应被理解为支持 并涵盖将明确描述的实施方式与任何数量的所公开和/或优选要素相结合的实施方式。此 外，除非上下文另外指出，否则应认为本申请的说明书中公开了本申请中所有描述的要素 的任何排列和组合。 在整个说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则术语“包括”以 及诸如“包含”和“含有”之类的变体将被理解为暗示包括陈述的成员、整数或步骤，但并不 排除任何其他未陈述的成员、整数或步骤。术语“由……组成”是术语“包括”的特定实施方 式，其中排除了任何其他未陈述的成员、整数或步骤。在本发明的上下文中，术语“包括”涵 盖术语“由……组成”。因此，术语“包括”涵盖“包含”以及“由……组成”，如，“包括”X的组合 物可以仅由X组成或可以包括一些另外的例如X Y。 在描述本发明的上下文中(特别是在权利要求的上下文中)使用的术语“一种”和 “一个”以及“该”和类似提及应被解释为涵盖单数和复数二者，除非本文另有指示，或与上 下文明显矛盾。本文中数值范围的叙述仅意图用作分别指代落入该范围内的每个单独值的 简写方法。除非本文另外指出，否则每个单独的值都被并入说明书中，如同它在本文中被单 独叙述一样。说明书中的任何语言都不应解释为表示对实践本发明必不可少的任何未要求 保护的要素。 词语“基本上”不排除“完全”，如，“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。必要 时，可以从本发明的定义中省略词语“基本上”。 相对于数值x的术语“约”意思是x±10％。 ***** 详细描述 脑区域内和之间的病理学扩散代表神经变性疾病的标志。本发明部分基于如下发 现：含有CARD的凋亡-相关斑点样蛋白(ASC)“斑点”的炎性体驱动形成有助于阿尔兹海默症 (AD)和其他神经变性疾病中的β-淀粉样(Aβ)病理学。本发明人发现，通过小胶质细胞释放 的ASC斑点快速结合Aβ并增加Aβ寡聚物和团聚体形成，这起到Aβ病理学的炎性驱动交叉播 种(cross-seed)的作用。海马内(Intrahippocampal)ASC斑点注射导致APP/PS1小鼠中Aβ病 理学的扩散。相反，APP/PS1脑组织匀浆没有诱导ASC缺乏型APP/PS1小鼠中Aβ-病理学的播 种(seeding)和扩散。令人惊讶地，本发明人发现，共同施加ASC配体阻断扩大的Aβ病理学。 这些发现说明，炎性体激活与神经变性疾病诸如阿尔茨海默症中Aβ病理学的播种和扩散相 联系，并支持能够阻断ASC团聚的ASC配体作为治疗和预防此类疾病的可行选项。 淀粉样-β团聚体的沉积和扩散是阿尔茨海默症的关键特性并且也被认为参与其 他神经变性疾病。一旦团聚，淀粉样-β被小胶质细胞模式识别受体感测，导致病理学免疫激 活和NLRP3炎性体的激活。NLRP3炎性体(作为危险信号的中央传感器的多蛋白复合物)招募 7 CN 111556875 A 说　明　书 3/45 页 ACS并最终触发其组装为更大团聚体(“斑点”)，其被释放到细胞内空间。本发明人发现，释 放的ASC团聚体(“斑点”)快速结合淀粉样-β并增加淀粉样-β寡聚物和团聚体的形成，从而 起到淀粉样-β病理学的炎性驱动交叉播种的作用，最终导致神经变性。 根据本发明的ASC配体优选地起到ASC的抑制剂的作用，并减少或消除其组装为更 大团聚体(“斑点”)的能力。预防或减少这类ASC“斑点”的形成的ASC配体优选能够预防或减 少淀粉样-β寡聚物、团聚体和斑块的形成。本发明ASC配体因此设想可用于预防或治疗神经 变性疾病，其优选地以ASC团聚体(“斑点”)和/或淀粉样-β病理学的形成(特别是淀粉样-β 团聚体的形成和扩散)为特征或与其相关。 在第一方面，本发明特征为含有CARD的凋亡相关斑点样蛋白(ASC)的配体，其用于 治疗或预防神经变性疾病的方法中。 如本文所使用，术语“配体”指的是能够与含有CARD的凋亡相关斑点样蛋白(ASC) 相互作用，优选结合的(大-)分子。优选地，配体与ASC特异性相互作用或结。“特异性”相互 作用或结合意思是相比其他非靶蛋白，配体更容易与ASC相互作用或结合。在另一个实施方 式中，配体不与在涉及ASC的级联的上游或下游起作用的蛋白质相互作用。具体地，“配体” 可能不与pH-激活的蛋白酶，例如为NLRP3炎性体下游的pH-激活的蛋白酶相互作用。优选 地，“配体”不是β-淀粉样。更优选地，抗ASC-斑点抗体特异性预防或减少Aβ的ASC斑点诱导 的团聚。 配体优选能够调谐其靶标的生物学功能或生活活性。术语“生物学功能”(或“生物 活性”)在本文用于指在生物(比如，但不限于在其自然或天然)环境中通过所述靶标介导的 期望或正常作用。如果配体完全或部分预防、减少、抑制、干扰、阻断、增强、激活、刺激、增 加、加强或支持所述生物学功能，则配体“调谐”其靶标介导的生物学功能。 配体可以直接或间接与其靶标相互作用。因此，本发明的ASC配体可以与ASC直接 或间接相互作用，优选结合。本发明的ASC配体优选通过(特异性)结合ASC而与ASC直接相互 作用。然而，还设想了ASC配体可以间接地与ASC相互作用，如通过作用于影响ASC生物学功 能或活性的其他细胞或细胞间结构、成分或分子。“配体”可以例如通过与ASC相互作用靶向 ASC，从而阻断ASC与其他蛋白质例如NLRP3的相互作用。 术语“ASC”是指通过PYCARD基因或其等位基因变体或直向同源物编码的含有CARD 的人凋亡凋亡-相关的斑点样蛋白(UniProt  Acc.No.Q9ULZ3，进入版本2017年11月2日的# 172，序列版本#2)。其也可以被称为“CARD5”或“TMS1”。 “ASC”优选地包含对应于根据SEQ  ID  NO:1的氨基酸序列的氨基酸序列或由其组 成。下面描绘了通常被称为“规范”ASC序列的该序列： SEQ  ID  NO:1 热蛋白结构域(PYD)(上述序列中加下划线)位于范围从氨基酸1–91(SEQ  ID  NO: 2)的氨基酸一段序列中。其被认为介导与蛋白(诸如NLRP3、PYDC1、PYDC2和AIM2)的热蛋白 8 CN 111556875 A 说　明　书 4/45 页 结构域的同型相互作用。CARD结构域(上述序列中加粗)位于范围从氨基酸107–195(SEQ  ID  NO:3)的氨基酸一段序列中。其被认为介导与CASP1和NLRC4的相互作用。 术语“ASC”优选地还包括以根据SEQ  ID  NO:1的氨基酸为特征的ASC蛋白的同源 物、同工型、变体和片段。这些ASC同源物、同工型、变体和片段优选包含与根据SEQ  ID  NO:1 的“规范”ASC氨基酸序列相比，展现至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、 80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或 99％的，优选地至少70％，更优选地至少80％，甚至更优选地至少85％，甚至更优选地至少 90％和最优选地至少95％或甚至97％的序列同一性的氨基酸序列，或由其组成。 这些ASC同源物、同工型、变体和片段优选是功能性的，即，保留以上面描绘的“规 范”ASC氨基酸序列为特征的ASC蛋白的生物学功能或活性。因此，这类ASC同源物、同工型、 变体和片段可以通常至少保留负责所述生物学功能或活性的PYD和/或CARD结构域的最少 部分。 ASC是展示若干生物学功能或活性的衔接蛋白。在本发明的上下文中，以下功能和 活性拥有特定兴趣(通常按从(1)-(5)的顺序出现)：(1)被NLRP3炎性体招募的能力，通常通 过热蛋白(PYD)结构域相互作用，(2)在NLRP3招募后螺旋状原纤维组装，(3)效应胱天蛋白 酶-1的招募，通常经由CARD相互作用，(4)自动蛋白水解激活和随后的组装ASC原纤维为大 的副核ASC团聚体(“斑点”)和(5)诱导淀粉样-β寡聚和团聚。 功能性ASC同源物、同工型、变体和片段优选展现至少相同的生物学功能和活性 (1)-(5)。 术语“淀粉样-β”(或“Aβ”、“β-淀粉样”、淀粉样β蛋白)指从APP加工的39-43个氨基 酸残基的一组肽中的任一个。术语“APP”指通过APP基因或其同源物、同工型、变体或片段编 码的淀粉样-βA4蛋白(Uniprot  Ref  No.P05067,进入版本2017年11月22日的#266)。APP是 糖基化的单跨膜蛋白，其在许多哺乳动物组织的多种细胞中表达。目前已知存在于人中的 APP变体的实例是Kang  et .al .(1987)Nature  325:733-736描述的695氨基酸多肽 (APP695)：Ponte  et  al.(1988)Nature  331:525-527(1988)和Tanzi  et  al.(1988)Nature  331:528-530(SEQ  ID  NO:56-57)描述的751氨基酸多肽(APP751)；和Kitaguchi  et.al . (1988)Nature  331:530-532(SEQ  ID  NOs:54-55)描述的770-氨基酸多肽(APP770)。按照惯 例，即使提及较短的APP蛋白的密码子位置，也可以使用最长APP蛋白APP770的密码子编号。 通过分泌酶切割处理APP以产生可溶性APP或淀粉样-β肽。 术语“淀粉样-β”因此指源于APP的β分泌酶切割的任何肽。这包括39、40、41、42和 43氨基酸的肽，其从β-分泌酶切割位点延伸至β-分泌酶切割位点C-末端的39、40、41、42和 43氨基酸。 特别地设想了根据本发明的ASC配体用于治疗人的神经变性疾病。因此，ASC配体 优选能够(特异性地)与人ASC或其同工型、变体和片段相互作用，更优选与之结合。然而，还 设想将本发明的ASC配体用于治疗非人动物。因此，本发明的ASC配体还可以结合在非人动 物中发现的ASC同源物。 ASC“同源物”包括“直向同源物”和“种内同源物(paralog)”二者。ASC直向同源物 包括由不同物种的基因编码的ASC蛋白，这些物种是通过物种形成(直向同源物)从共同的 祖先基因进化而来的。直向同源物在进化过程中通常保留相同的功能(一种或多种)。因此， 9 CN 111556875 A 说　明　书 5/45 页 当比较一对直向同源物时，功能可能会丢失或获得。ASC种内同源物包括由基因组内基因复 制产生的基因编码的ASC蛋白。种内同源物通常会进化出新功能，或者最终可能成为假基 因。 示例性ASC“同源物”包括大猩猩(西部低地大猩猩)、白颊长臂猿(Nomascus  leucogenys)(北方白颊长臂猿)(白颊长臂猿(Hylobates  leucogenys))、普通猕猴(Macaca  mulatta)(恒河猕猴(Rhesus  macaque))、阿努比斯狒狒(Papio  anubis)(东非狒狒(Olive  baboon))、白枕白眉猴(Cercocebus  atys)(乌黑白眉猴(Sooty  mangabey))(煤黑白眉猴 (Cercocebus  torquatus  atys))、豚尾猴(Macaca  nemestrina)(猪尾猕猴(Pig-tailed  macaque))、大黑猩猩(Pan  troglodytes)(黑猩猩)、鬼狒狒(Mandrillus  leucophaeus)(黑 面山魈(Drill))(鬼狒(Papio  leucophaeus))、苏门答腊猩猩(Pongo  abelii)(苏门答腊猩 猩(Sumatran  orangutan))(婆罗洲猩猩(Pongo  pygmaeus  abelii))或姑息性安哥拉结肠 杆菌(Colobus  angolensis  palliates)的ASC蛋白。 根据本发明的ASC配体可以显示或可以不显示与不同的ASC同源物的交叉反应性 (cross-reactivity)，即与在两个或更多个不同物种中发现的ASC同源物相互作用或结合 的能力。 ASC“同工型”包括在翻译后修饰方面与“规范”ASC蛋白不同的ASC蛋白。翻译后修 饰(PTM)可能导致给定蛋白的共价或非共价修饰。常见的翻译后修饰包括糖基化、磷酸化、 泛素化、S-亚硝基化、甲基化、N-乙酰化、脂质化、二硫键形成、硫酸化、酰化、脱氨基等。翻译 后蛋白水解加工可能会改变给定蛋白的氨基酸序列。不同的PTM可以例如导致不同的化学、 活性、定位、相互作用或构象，并且任选地导致不同的氨基酸序列。 ASC“变体”包括ASC蛋白“序列变体”，即包含与参比(或“亲本”)ASC蛋白的参比(或 “亲本”)氨基酸序列至少一个氨基酸残基不同的氨基酸序列的蛋白。所述参比氨基酸序列 可以优选地是根据SEQ  ID  NO：1的规范氨基酸序列。因此，与各自的参比序列相比，ASC变体 可以优选地在其氨基酸序列中包括至少一个氨基酸突变、取代、插入或缺失。取代可以是保 守的(其中源自同一类别的氨基酸彼此交换)，或为非保守的。ASC变体包括天然存在的变 体，例如已进行翻译后蛋白水解加工的ASC前蛋白原、蛋白原和ASC蛋白(这可能涉及去除N 末端甲硫氨酸，信号肽，和/或转化灭活或无功能蛋白为活性或功能蛋白)，以及天然存在的 突变体ASC蛋白。ASC变体还包括“转录变体”(或：“剪接变体”)。转录变体由信使RNA产生，这 些信使RNA最初是从同一基因转录而来，但随后进行了选择性(或差异)剪接，其中特定的基 因外显子可能包含在最终加工的信使RNA(mRNA)中或从中排除。ASC变体还包括工程化ASC 变体。应当指出，ASC“变体”可以基本上由与参比蛋白的氨基酸序列不同的氨基酸序列限 定。因此，术语“变体”和“同源物”、“同工型”(当指改变氨基酸序列的翻译后修饰时)和“片 段”之间可能存在一定的重叠。本文定义的“变体”可以衍生自各自的参比蛋白、分离自各自 的参比蛋白、与各自的参比蛋白相关、基于各自的参比蛋白或与参比蛋白质同源。 示例性ASC“变体”包括ASC蛋白，其包括与根据SEQ  ID  NO:4或SEQ  ID  NO:5的氨基 酸序列对应的氨基酸序列或由其组成。 ASC“片段”包括ASC蛋白或(多)肽，其由参比(或“亲本”)ASC蛋白的全长氨基酸序 列的连续子序列组成。所述参比氨基酸序列可以优选是根据SEQ  ID  NO：1的规范氨基酸序 列。因此，就其氨基酸序列而言，“片段”与所述参比蛋白的氨基酸序列相比在N末端、C末端 10 CN 111556875 A 说　明　书 6/45 页 和/或序列内被截短。截短可分别在氨基酸水平或核酸水平上发生。换句话说，ASC蛋白“片 段”通常可能是全长ASC蛋白氨基酸序列的较短部分。因此，片段通常由与全长氨基酸序列 内的相应一段序列同一的序列组成。该术语包括天然存在的ASC蛋白“片段”(例如天然存在 的体内蛋白酶活性产生的片段)以及工程化的ASC蛋白片段。 优选地，ASC蛋白“片段”可以由与作为参比的ASC蛋白氨基酸序列中的氨基酸的连 续一段序列相对应的氨基酸的连续一段序列组成，其代表至少20％、优选至少30％、更优选 至少40％、更优选至少50％、甚至更优选至少60％、甚至更优选至少70％、和最优选至少 80％的参比氨基酸序列。ASC蛋白“片段”可以包含以下氨基酸序列或由其组成：ASC蛋白的 氨基酸序列的至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残 基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少 50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少连续80个 氨基酸残基、至少连续90个氨基酸残基、至少连续100个氨基酸残基、至少连续125个氨基酸 残基、至少150个连续氨基酸残基、至少连续175个氨基酸残基、至少连续200个氨基酸残基 或至少连续250个氨基酸残基。 关于各自的参比氨基酸序列，优选为根据SEQ  ID  NO:1的规范ASC氨基酸序列，根 据本发明的ASC同源物、同工型、变体或片段可以优选地展示至少5％、10％、20％、30％、 40％、50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、或99％，优选至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少85％、甚 至更优选至少90％和最优选至少95％或甚至97％的序列同一性。 因此，ASC配体优选地能够与本文所述的ASC蛋白特异性相互作用或结合。更优选 地，ASC配体可以能够与以根据SEQ  ID  NO：1的“规范”氨基酸序列为特征的ASC蛋白或其同 源物、同工型、变体或片段特异性地相互作用或结合。 通过与ASC相互作用或结合，根据本发明的ASC配体优选能够调谐，优选完全或部 分预防、减少、抑制、干扰或阻断上述生物学功能或活性，即(1)被NLRP3炎性体招募的能力， 通常通过热蛋白(PYD)结构域相互作用，(2)在NLRP3招募后螺旋状原纤维组装，(3)效应胱 天蛋白酶-1的招募，通常经由CARD相互作用，(4)自动蛋白水解激活和随后的组装ASC原纤 维为大的副核ASC团聚体(“斑点”)和(5)诱导淀粉样-β寡聚和团聚。 换句话说，根据本发明的ASC配体优选充当ASC的抑制剂。更优选地，根据本发明的 ASC配体预防、减少、抑制、干扰或阻断ASC形成团聚体(或“斑点”)的能力和/或其诱导或促 进淀粉样-β团聚的能力。如本文所用，表述“ASC团聚体的形成”包括ASC的螺旋状原纤维组 装(上述#(2))和组装ASC原纤维为大的副核ASC团聚体(上述#(4))。ASC配体可以通过预防、 减少、抑制、干扰或阻断上述功能级联的任何一个步骤发挥其所需的抑制作用，最终诱导淀 粉样-β团聚体的形成(#(1)-(5)，优选#(2)和/或#(4)和#(5))。ASC配体的抑制作用可通过 使用所附实施例中描述的方法，特别是Aβ团聚试验(实施例1)进行评估。 因此，本发明的ASC配体可以例如与ASC的PYD或CARD结构域，特别是位于ASC的PYD 或CARD结构域内的表位相互作用或结合。本发明报道了，与CARD结构域中的突变相反，PYD 结构域)中的突变(均能够抑制ASC螺旋状原纤维组装(#(2))完全阻止了ASC团聚体对淀粉 样-β团聚的促进作用。不希望受具体理论的束缚，因此设想根据本发明的ASC配体可以(特 异性地)与ASC  PYD结构域或位于所述结构域内的表位相互作用或结合。所述表位可以包括 11 CN 111556875 A 说　明　书 7/45 页 “规范”ASC氨基酸序列(SEQ  ID  NO：1)的氨基酸K21、K22和/或K26。但是，同样可以想象，ASC 配体与ASC蛋白的其他部分(如位于CARD结构域或其他地方)相互作用或结合。例如，此类 ASC配体可通过对PYD相互作用的空间干扰或其他方式发挥其抑制功能。 “ASC配体”可以是任何类型的分子，并且可以优选地选自抗体或编码这类抗体的 核酸、核酸、蛋白、肽、适配体或小分子有机化合物。使用高通量筛选或计算机建模(in  silico  modelling)可以容易鉴定ASC配体。 抗体配体： 根据本发明的ASC配体可以是抗体或其变体、片段或衍生物。术语“免疫球蛋白” (Ig)和“抗体”在本文可互换使用。本文所用的术语“抗体”(Ab)包括单克隆抗体、多克隆抗 体、单特异性和多特异性抗体(如双特异性抗体)，以及抗体变体、片段和衍生物，只要它们 表现出所需的生物学功能即可，其通常是它们对预期靶标的结合亲和力。 “结合亲和力”或“亲和力”是生物分子(本文中：ASC)与其配体/结合配偶体(本文 中：抗体)之间的结合相互作用的强度。结合亲和力通常由平衡解离常数(KD)测量和报告。KD 是抗体与其靶标之间的koff/kon之比。KD和亲和力成反比。结合亲和力受两个分子之间非共 价分子间相互作用的影响，诸如氢键、静电相互作用、疏水力和范德华力。有许多方法测量 结合亲和力和解离常数，诸如ELISA、凝胶位移测定、下拉测定(pull-down  assays)、平衡透 析、分析超离心、SPR和光谱测定。等温滴定热法(ITC)。抗体ASC配体可在微摩尔(mM)、纳摩 尔(nM)、皮摩尔(pM)或飞摩尔(fM)范围内表现出结合亲和力。抗体ASC配体可优选对它们的 预期靶标表现出高结合亲和力。即，抗体ASC配体可以以至少约107M-1、至少约108M-1、至少约 109M-1、至少约10-10M-1、至少约10-11M-1或至少约10-12M-1的亲和力结合。 抗体ASC配体优选地能够与其预期靶标特异性相互作用或结合。如本文其他地方 所定义，术语“特异性结合”意思是指相比不同的非预期靶标，抗体更容易与其预期靶标结 合。如果抗体优先结合或识别靶标，即使在非靶标的存在下，如可通过可定量测定(诸如，放 射性配体结合测定、ELISA、基于荧光的技术(如，荧光偏振(FP)、荧光共振能量转移(FRET) 或表面等离子体共振)测量，则抗体优选理解为与其靶标“特异性结合”或表现出“结合特异 性”或“特异性亲和力”。“特异性结合”其靶标的抗体可以展示或可以不展示与衍生自不同 物种的(同源)靶标的交叉反应性。 天然存在的基础抗体是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成的异四 聚体糖蛋白。一些抗体可能含有额外的多肽链，诸如IgM和IgA抗体中的J链。每条L链通过一 个共价二硫键与H链相连，而两条H链则根据H链的同型通过一个或多个二硫键彼此相连。每 个H和L链也包含链内二硫键。每条H链均包含N末端可变结构域(VH)，然后是α和γ链的每个 的三个恒定结构域(CH)，以及μ和ε同型的四个CH域。每个L链在N-末端处具有可变结构域 (VL)，随后在其另一端具有恒定结构域。VL与VH对齐，和CL与重链的第一个恒定结构域(CH1) 对齐。据信特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。 基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以将来自任何脊椎动物物种的L链指定为两 种明显不同类型(称为κ和λ)的一个。根据其重链恒定结构域(CH)的氨基酸序列，免疫球蛋 白可指定为不同类别或同型。有五种免疫球蛋白类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分别具有指 定为α、β、ε、γ和μ的重链。γ和μ类别根据CH序列和功能的相对较小差异进一步分为子类， 例如，人表达以下子类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。 12 CN 111556875 A 说　明　书 8/45 页 VH和VL的配对一起形成单抗原结合位点。术语“可变的”是指在抗体之间可变结构 域的某些区段在序列上差异很大的事实。V结构域介导抗原结合并限定特定抗体对其特定 抗原的特异性。但是，可变性并未在可变结构域的整个范围内均匀分布。相反地，V区由约 15-30个氨基酸残基的相对不变的一段序列(被称为框架区(FR))组成，其被极度可变的较 短区(称为“高变区”，也称为“互补决定区”(CDR)，每个长度为大约9-12个氨基酸残基)分 开。天然重链和轻链的可变结构域每个包括四个FR，主要采用β-折叠结构，并通过三个高变 区连接，这三个高变区形成连接β-折叠结构并在某些情况下形成β-折叠结构一部分的环。 每条链中的高变区通过FR紧密结合在一起，并且与另一条链中的高变区一起，有助于抗体 的抗原结合位点的形成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，而是表现出多种效应 子功能，诸如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的参与。当在本文中使用时，术语“高变区”(也称 为“互补决定区”或CDR)是指抗体的氨基酸残基，其在免疫球蛋白的V区结构域内(通常是三 个或四个具有极端序列变异性的短区)，其形成抗原结合位点并且是抗原结合特异性的主 要决定因素。CDR残基可以基于跨物种序列可变性或抗原-抗体复合物的晶体学研究进行鉴 定。 因此，如本文所用，术语“抗体”优选是指免疫球蛋白分子或其变体、片段或衍生 物，其能够经由至少一个互补决定区与靶表位特异性结合。该术语包括单和多克隆抗体， 单、双和多特异性抗体，任何同型的抗体(包括IgM、IgD、IgG、IgA和IgE抗体)，以及通过任何 手段获得的抗体，包括天然存在的抗体，通过在宿主生物体中免疫产生的抗体，从天然存在 的抗体或通过在宿主生物体中免疫产生和通过本领域已知的生物分子方法重组产生的抗 体中分离和鉴定的抗体，单克隆和多克隆抗体以及嵌合抗体，人抗体，人源化抗体，体内抗 体(即在细胞中表达并任选位于特定细胞区室的抗体)，以及这些抗体中任何一种的变体、 片段和衍生物。 如本文所用，术语“单克隆抗体”(mab)是指从基本上均质的抗体群体中获得的抗 体，即，除了可能以少量存在的可能天然存在的突变以外，构成该群体的各个抗体是相同 的。单克隆抗体针对单个抗原位点具有高度特异性。此外，与包括针对不同表位的不同抗体 的“多克隆”抗体制品相反，每种单克隆抗体均针对抗原上的单个表位。除了它们的特异性 之外，单克隆抗体的优点在于它们可以被合成而不受其他抗体的污染。形容词“单克隆”不 应解释为要求通过任何特定方法生产抗体。例如，可通过首先由Kohler等人，Nature  256: 495(1975)描述的杂交瘤方法来制备可用于本发明的单克隆抗体，或者可以在细菌或真核 动物或植物细胞中使用重组DNA方法制备它们(参见如，美国专利号4,816,567)。例如，还可 以使用在Clackson等人，Nature  352:624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.222:581- 597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。 “抗体变体”或“抗体突变体”是指包含氨基酸序列或由其组成的抗体，其中与参比 或“亲本”抗体相比，氨基酸残基中的一个或多个已被修饰。这样的抗体变体因此可以依优 先增加顺序显示与参比或“亲本”抗体或其轻或重链至少约5％、10％、20％、30％、40％、 50％、60％、优选至少约70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、更优选至少约90％、91％、 92％、93％、94％、最优选至少约95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。可以想到的氨 基酸突变包括一个或多个氨基酸残基的缺失、插入或改变。突变可以位于恒定区或抗原结 合区(如，高变或可变区)中。保守氨基酸突变可以是优选的，其将氨基酸改变为具有相似生 13 CN 111556875 A 说　明　书 9/45 页 化特性(如，电荷、疏水性和大小)的不同氨基酸。 抗体变体包括“嵌合”和“人源化”抗体，其中部分重链和/或轻链与衍生自特定物 种或属于特定抗体类别或子类的抗体中的相应序列相同或同源，而链(一条或多条)的其余 部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或子类的抗体中的相应序列相同或同源。“人 源化”抗体包含(部分或全部)衍生自非人动物(如小鼠或非人灵长类动物(如，旧大陆猴、类 人猿等))的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列，它们优选能够有效介导Fc效应子功 能和/或在引入人体时显示出降低的免疫原性。“人源化”抗体可通过创建“嵌合”抗体(移植 到人Fc上的非人Fab)作为起始步骤，并选择性突变分子的Fab部分中的(非CDR)氨基酸来制 备。可选地，可通过将源自非人动物的适当“供体”CDR编码片段嫁接到人抗体“受体”支架 上，并任选性地突变(非CDR)氨基酸以获得最佳结合，来直接获得“人源化”抗体。 “抗体片段”包含完整抗体的一部分(即，包含抗原结合位点以及CL和至少一个重 链结构域CH1、CH2和CH3的抗体)，优选地完整抗体的抗原结合和/或可变区。抗体片段的实例 包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段。 木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”(片段，抗原结合) 片段，以及残余的“Fc”(片段，可结晶)片段。Fab片段由完整的L链以及H链的可变区结构域 (VH)和一个重链的第一恒定结构域(CH1)组成。每个Fab片段在抗原结合方面是单价的，即， 它具有单个抗原结合位点。胃蛋白酶处理抗体产生单个大的F(ab')2片段，该片段大致对应 于具有不同抗原结合活性的两个二硫键连接的Fab片段但仍能够交联抗原；和pFc'片段。F (ab')2片段可裂解为两个Fab'片段。Fab'片段与Fab片段的区别在于在CH1结构域的羧基末 端具有一些额外的残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中 Fab'的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基(一个或多个)带有游离硫醇基。F(ab')2抗体 片段最初作为Fab'片段对产生，它们之间具有铰链半胱氨酸。其他抗体片段及其化学片段 也是已知的。Fab/c或Fabc抗体片段缺少一个Fab区。Fd片段对应于Fab的重链部分，并含有C 末端恒定(CH1)和N末端可变(VH)结构域。 “Fc”片段包含通过二硫化物保持在一起的两条H链的羧基末端部分。抗体的效应 子功能由Fc区中的序列决定，该区也被某些类型的细胞上可见的Fc受体(FcR)识别。 “Fv”是包含完整抗原结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密非共价缔合的一个 重链和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中，产生六个高变环 (来自H和L链的每个的3个环)，这些环为抗原结合贡献了氨基酸残基，并赋予抗体抗原结合 特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包含三个对抗原特异性的CDR的Fv的一半)也具有 识别和结合抗原的能力，但是以低于整个结合位点的亲和力。 “抗体衍生物”是修饰的抗体变体，其包括新的或另外的生物学特性或功能。可以 对抗体衍生物进行化学或生物学修饰，以引入所需的生物学功能(如，通过引入或去除赋 予、增强、减少或废除靶结合亲和力或特异性或酶活性的部分或结构域)、制造特性(如，通 过引入赋予增加的溶解度或增强的排泄，或允许纯化的部分)或医学用途的药代动力学/药 效动力学性质(如，通过引入赋予增加的稳定性、生物利用度、吸收；分布和/或减少的清除 率的部分)。例如，可以修饰抗体衍生物以包含改变的糖基化模式，或可以与能够增加血清 半衰期和稳定性和/或降低免疫原性的部分缀合，诸如聚乙二醇(PEG)、葡聚糖、聚唾液酸 (PSA)、透明质酸(HA)、糊精、羟乙基淀粉(HES)、聚(2-乙基2- 唑啉)(PEOZ)、多肽(XTEN技 14 CN 111556875 A 说　明　书 10/45 页 术，PASylation)、脂肪酸(脂化)或(附加)抗体Fc部分。进一步抗体衍生物包括另外的治疗 部分，诸如药物、毒性剂、酶或衔接结构域。因此，术语“衍生物”还包括抗体-药物缀合物。进 一步抗体衍生物包括抗原结合抗体区(CDR和任选的FR区或抗体VL区)和其他蛋白结构域的 融合产物。示例性融合产物是嵌合抗原受体(CAR)。进一步抗体衍生物包含通常通过合适的 肽接头偶联的数个抗体片段。因此，抗体“衍生物”可以衍生自(并因此任选地包括)天然存 在的(野生型)抗体或其变体或片段。示例性的抗体“衍生物”包括双抗体、线性抗体、单链抗 体以及衍生自抗体片段、CAR和抗体-药物缀合物的双或多特异性抗体。本文还设想了所描 述的修饰的组合。 也缩写为“sFv”或“scFv”的“单链Fv”是抗体衍生物，其包含连接到单个多肽链中 的VH和VL抗体结构域。优选地，sFv多肽在VH和VL结构域之间进一步包含多肽接头，其使sFv 能够形成抗原结合所需的结构。 术语“双抗体”(也称为双价(或二价)单链可变片段、“双-scFv”、“二-scFv”)是指 通过连接两个scFv片段(参见上段)制备的抗体衍生物，通常在VH和VL结构域之间具有短的 接头(约5-10个残基)，以便实现V结构域的链间配对而不是链内配对。另一种可能性是构建 具有两个VH和两个VL区的单条肽链(串联scFv)。所得的二价衍生物具有两个抗原结合位点。 同样，可以生产三价scFv三聚体(也称为“三抗体”或“三抗”)和四价scFv四聚体(“四抗 体”)。二价或多价抗体衍生物可以是单特异性的，即每个抗原结合位点可以针对相同的靶 标。这样的单特异性二价或多价抗体或抗体片段衍生物优选表现出高结合亲和力。可选地， 二价或多价抗体衍生物的抗原结合位点可以针对不同的靶标，形成双特异性或多特异性抗 体衍生物。 “双或多特异性”抗体衍生物包含一个以上的特异性抗原结合区，每个都能够特异 性结合不同的靶标。“双特异性”衍生物通常是两个“交换型”scFv片段的异二聚体，其中两 个抗体的VH和VL结构域存在于不同的多肽链上。双或多特异性衍生物可以充当效应子和各 自靶标之间的衔接分子，从而将效应子(如，毒素、药物和细胞因子或效应细胞(诸如CTL、NK 细胞、巨噬细胞和粒细胞))招募到通常由靶细胞表达的目标抗原。因此，“双或多特异性”衍 生物优选使效应分子或细胞和所需靶标紧密接近和/或介导效应子与靶标之间的相互作 用。被称为双特异性T细胞接合子(engager)(BiTE抗体构建体)的双特异性串联二-scFv是 二价和双特异性抗体衍生物的一个实例。 抗体的结构和性质在本领域中是众所 周知的 ，尤其是在J a n e w a y’s  Immunobiology ,9thed .(rev.) ,Kenneth  Murphy和Casey  Weaver(eds) ,Taylor&Francis  Ltd.2008中进行描述。 在本发明的上下文下，示例性ASC配体抗体可以选自653902克隆TMS-1 (BioLegend ,San  Diego ,CA ,U .S .A .)；AL177(AdipoGen ,AG-25B-0006-C100 ,Liestal , Switzerland)、LS-C331318-50(LifeSpan  BioSciences)；AF3805(R&D  Systems)；NBP1- 78977(Novus  Biologicals)；600-401-Y67(Rockland  Immunochemicals,Inc.)；AF3805-SP (R&D  Systems)；orb160033(Biorbyt)；orb223237(Biorbyt)；676502(BioLegend)；653902 (BioLegend)；MBS150936(MyBioSource.com)；MBS420732(MyBioSource.com)；MBS9401386 (MyBioSource .com)；MBS9404874(MyBioSource .com)；MBS8504703(MyBioSource .com)； MBS841111(MyBioSource .com)；AB3607(Merck)；04-147克隆2EI-7(Merck)；NB300-1056 15 CN 111556875 A 说　明　书 11/45 页 (Novus  Biologicals)；NB100-56075(Novus  Biologicals)；NBP1-78978(Novus  Biologicals)；NBP1-78977SS(Novus  Biologicals)；NBP1-78978SS(Novus  Biologicals)； NBP1-77297(Novus  Biologicals)；AP07343PU-N(OriGene  Technologies)；AP06792PU-N (OriGene  Technologies)；AM26452AF-N(OriGene  Technologies)；AP32825PU-N(OriGene  Technologies)；AP23602PU-N (OriGene  Technologies)；TA306044 (OriGene  Technologies)；3291-100(BioVision)；3291-30T(BioVision)；STJ25245(St  John 's  Laboratory)；STJ91730(St  John 's  Laboratory)；LS-C180180-100(LifeSpan  BioSciences)；LS-C48292-100(LifeSpan  BioSciences)；STJ70108(St  John 's  Laboratory)；STJ113135(St  John 's  Laboratory)；LS-C155196-100(LifeSpan  BioSciences)；GTX22236(GeneTex)；GTX102474(GeneTex)；GTX28394(GeneTex)；D086-3 (MBL  International)；13833S(Cell  Signaling  Technology)；CAE04552(Biomatik)；ADI- 905-173-100(Enzo  Life  Sciences,Inc.)；40618(Signalway  Antibody  LLC)；E-AB-30582 (Elabscience  Biotechnology  Inc.)；ab180799(Abcam)；168-10230(Raybiotech,Inc.)； ER-03-0001(Raybiotech,Inc.)；A3598-05B-100ug(United  States  Biological)；A3598- 05N-50ug(United  States  Biological)；AP5631(ECM  Biosciences)；ABIN1001824 (antibodies-online)；2287(ProSci ,Inc)；70R-11744(Fitzgerald  Industries  International)；AHP1606(Bio-Rad)；PA1-41405(Invitrogen  Antibodies)；PA5-19957 (Invitrogen  Antibodies)；PA5-27715(Invitrogen  Antibodies)；PA1-9010(Invitrogen  Antibodies)；10500-1-AP(Proteintech  Group  Inc)；sc-514414(Santa  Cruz  Biotechnology,Inc.)；和sc-514559(Santa  Cruz  Biotechnology,Inc.)。 本发明的ASC配体可以选自上述抗体中任一种，或其变体(诸如人源化或其他方式 工程化的变体)、片段(诸如Fab或Fv片段)或衍生物(诸如scFv或双抗体)。提供这类变体、片 段或衍生物的手段和方法在本领域中是已知的，并且尤其是在Kontermann,Roland；Dübel, Stefan(Eds.)Antibody  Engineering  Series:Springer  Lab  Manuals  2001,ISBN:978-3- 540-41354-7中描述。本文特别设想了由人源化抗体变体制备的片段或衍生物。 蛋白质或肽ASC配体： 根据本发明的ASC配体可以选自蛋白质或肽。蛋白质或肽ASC配体优选结合蛋白质 或肽，而不是抗体或其变体、片段或衍生物，其展示了对ASC的特异性亲和力。 蛋白质或肽配体通常包含介导与ASC的(特异性)相互作用或结合的结合结构域。 这类结合结构域可以包括或衍生自FN3(纤连蛋白III型结构域) ,、β-折叠框、Kunitz结构 域、PDZ结构域(PSD-95/Discs-大/ZO-1-结构域)、人A-结构域、重复单位结构域(诸如锚蛋 白重复单位结构域)或葡萄球菌蛋白A(SPA)，如 S  and Journal  of  Biotechnology.140(2009):254–269中所综述的。 蛋白质或肽ASC配体包括天然存在的蛋白质和肽，以及其工程化变体和衍生物。 术语“特异性亲和力”、“变体”和“衍生物”在抗体ASC配体的上下文中解释，并且经 过必要的修改同样适用于蛋白质或肽ASC配体。因此，衍生物包括例如嵌合融合体，其包括 (任选地通过合适的肽接头)与第二氨基酸序列融合的第一氨基酸序列(蛋白质)，该第二氨 基酸序列限定了对第一蛋白质的任何结构域外来的且基本不同源的结构域。该结构域可以 衍生自或可以不衍生自不同物种。 16 CN 111556875 A 说　明　书 12/45 页 示例性的蛋白质或肽ASC配体包括可溶性受体、模拟抗体蛋白(adnectin)、 anticalin、DARPin(设计的锚蛋白重复蛋白)、avimer、亲和体、肽适配体或其变体、片段或 衍生物。 核酸ASC配体： 根据本发明的ASC配体可以选自核酸。 核酸ASC配体可以是单链的或双链的或其混合物，并且包括DNA和RNA分子。核酸 ASC配体可以具有任何长度。它们可以包括或可以不包括修饰的核苷、核苷酸或磷酸二酯 键。核酸ASC配体可以是编码的或非编码的。 核酸ASC配体可以是对ASC表现出特异性亲和力的结合核酸。术语“特异性亲和力” 在抗体ASC配体的上下文中解释，并且经过必要的修改同样适用于核酸ASC配体。这样的核 酸ASC配体可以选自适配体。 “适配体”或“寡核苷酸适配体”是由RNA或单链DNA寡核苷酸组成的小核酸配体，其 折叠成三维(3D)结构。适配体通过结构识别与其靶标相互作用并与其结合，该过程类似于 抗原-抗体反应的过程。如本文所用，术语“适配体”包括单价、二价和多价适配体，单特异 性、双特异性和多特异性适配体，包含任选地经由合适接头与药物共价连接的适配体的适 配体-药物缀合物(ApDC)、与高分子量聚合物(如，PEG)连接的适配体、适配体-束缚的DNA纳 米火车(nanotrain)(aptNTr)、与载体(如，共聚物、脂质体金属纳米颗粒或病毒样颗粒)相 关联的适配体、适配体-Fc缀合物和适配体-siRNA或适配体-miRNA嵌合体(参见Sun  et  al.Molecular  Therapy  Nucleic  Acids(2014)3,e182，进行综述)。 可选地，核酸ASC配体可以间接与ASC功能和活性相互作用，如，通过调谐ASC表达。 这类核酸ASC配体可以选自微小RNA、siRNA、shRNA或反义RNA。 “微小RNA”或“miRNA”是小的(～20-24个核苷酸)非编码双链RNA(dsRNA)，其能够 将AGO-2RISC复合体招募到互补靶转录物上，从而优选诱导miRNA介导的RNAi途径。微小RNA 通常从原(pri)-微小RNA加工成称为前(pre)-微小RNA的短茎环结构，并最后加工成成熟的 miRNA。前-微小RNA的茎的两条链都可以加工成成熟微小RNA。加工后，与RNA诱导的沉默复 合物(RISC)中的Argonaute  2(AGO2)相关的成熟单链微小RNA通常结合其胞质mRNA靶标的 3'UTR，导致mRNA转录物的翻译减少或去腺苷酸化和降解。因此，微小RNA的主要功能是通过 与靶mRNA的互补序列结合来(负向)调节蛋白质翻译。术语“微小RNA”包括miRNA、成熟的单 链miRNA、前体miRNA(前-miRNA)、原始miRNA转录物(原-miRNA)、双链体miRNA及其变体。特 别设想微小RNA能够与靶核酸的3'非翻译区内的靶位点结合。 “小干扰RNA”或“siRNA”是能够诱导RNAi的小的(～12-35个核苷酸)非编码RNA分 子。siRNA包含RNA双链体(双链区)，该双链体是通过互补碱基与磷酸化的5'-端和羟基化的 3'端(任选地带有一个或两个单链突出的核苷酸)配对而形成的。双链体部分通常包含17至 29个核苷酸。siRNA可以从杂交在一起的两个RNA分子生成，或者可以可选地从包括自杂交 部分(shRNA)的单个RNA分子生成。siRNA的双链体部分可以但通常不包括在双链体的一条 或两条链中的含有一个或多个未配对和/或错配核苷酸的一个或多个凸起，或可含有一个 或多个非互补核苷酸对。siRNA的一条链(称为反义链)包括与靶转录物(如，靶mRNA)杂交的 部分。反义链可以与靶转录物的互补区精确地互补(即，siRNA反义链可以与靶序列杂交而 没有单个错配、摆动碱基配对或核苷酸凸起)，或者在siRNA反义链与靶转录物的互补区之 17 CN 111556875 A 说　明　书 13/45 页 间可以存在一个或多个错配、摆动(G：U)碱基配对和/或核苷酸凸起。 “短发夹RNA”或“shRNA”是包含至少两个互补部分的单链RNA分子，该至少两个互 补部分杂交或能够杂交以形成足够长以介导RNAi的双链(双链体)结构。这些互补部分的长 度通常在17～29个核苷酸之间，通常长度为至少19个碱基对。shRNA进一步包含至少一个单 链部分，通常长度在1～10个核苷酸之间，其形成连接形成双链体部分的互补链的环。双链 体部分可以但通常不包含由一个或多个未配对核苷酸组成的一个或多个凸起。如上所述， shRNA被认为是由RNAi机器加工成siRNA(参见上文)。因此，shRNA是siRNA前体，并被认为通 过siRNA介导的RNAi途径诱导基因沉默。 “反义RNA”或“asRNA”是单链或双链RNA分子，其表现与天然存在的mRNA序列的一 部分优选至少90％、更优选95％、和尤其100％的(dsRNA的核苷酸)序列同一性。在本发明的 上下文中，这种天然存在的mRNA序列可以编码ASC。反义RNA通常表现出与编码或非编码部 分的互补性，但是，在一些情况下，只要不消除反义RNA结合其靶标的能力，就可存在摆动碱 基(G：U)配对，核苷酸凸起和/或错配。 小分子ASC配体： 根据本发明的ASC配体可以选自小有机分子。所述小有机分子可以优选展示对ASC 的特异性亲和力。术语“特异性亲和力”在抗体ASC配体的上下文中解释，并且经过必要的修 改同样适用于小有机分子ASC配体。 术语“小有机分子ASC配体”包括能够直接或间接与ASC相互作用的任何小有机分 子化合物及其药学上可接受的盐、酯、衍生物、类似物和模拟化合物。 优选地，ASC相互作用化合物不是酯化合物，更优选地不是咖啡酸苯基酯(CAPE)、 CAPEN、DHC或DMC，特别不是CAPE。 编码ASC配体的核酸分子 在进一步方面，本发明提供了编码本文描述的ASC配体的核酸分子——诸如抗体、 蛋白、肽或核酸配体。“编码”ASC配体的核酸分子能够在适当的条件下被表达以提供所述配 体。核酸分子可以是单链的或双链的或其混合物，并且包括DNA和RNA分子。示例性核酸分子 可选自构建体、包括有义和反义DNA的基因组DNA、互补DNA(cDNA)、异源核RNA(hnRNA)、前体 mRNA(前-mRNA)、(成熟)信使RNA(mRNA)、DNA：RNA杂合分子、微型基因和基因片段。 本发明的核酸分子可以具有任意长度。本发明的核酸分子可以包括天然核苷(如， 腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)、核苷类似物(如， 2-氨基腺苷、2-硫胸苷、肌苷、吡咯并-嘧啶、3-甲基腺苷、C5-丙炔基胞苷、C5-丙炔基尿苷、 C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-甲基胞苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧腺苷、8-氧 鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫胞苷)和/或包含化学或生物修饰的碱基(如，甲基化碱基)、 插层碱基和/或修饰的糖(如，2′-氟核糖、核糖、2′-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)的核苷。本 发明的核酸分子可以包括磷酸二酯键，或任意其他类型的键，诸如硫代磷酸酯和5′-N-亚磷 酰胺键。包含非天然存在的核苷或核苷酸、序列、主链或核苷酸间键的核酸分子在本文中也 称为“修饰的”核酸分子。 本发明的核酸分子可以通过使用生物手段(例如，酶促地)在体内或体外获得，或 者可以化学合成。 根据本发明的核酸分子的特征在于其多核苷酸序列。所述序列优选包含编码目标 18 CN 111556875 A 说　明　书 14/45 页 ASC配体的“编码区”或“编码序列”(cds)。如本文所用，术语“编码”意思是能够在合适的环 境如合适的宿主细胞中或在合适的体外条件下表达以提供所需的表达产物(如蛋白、肽或 核酸)。编码ASC的开放阅读框的多核苷酸序列可以很容易地从基因组DNA来源、cDNA来源中 分离，或者可以合成(例如，通过PCR)。 因此，本发明的核酸分子可以包含编码本文所述的(蛋白质性质的)ASC配体以及 任选地与其可操作地连接的调节元件的cds或由其组成。 术语“可操作地连接”是指多核苷酸序列与另一多核苷酸序列的连接，使得该序列 以其预期方式起作用。例如，当编码蛋白质的多核苷酸序列以使所述多核苷酸序列表达产 生编码的蛋白质的功能性方式与调节元件连接时，该编码蛋白质的多核苷酸与所述调节元 件“可操作地连接”。 术语“调节元件”和“调节序列”可互换使用，并且指能够调谐宿主细胞中可操作连 接的多核苷酸序列的生物学功能或活性的多核苷酸序列。例如，调节元件包括能够指导或 调谐(如，增加)来自编码蛋白质的多核苷酸序列的蛋白质表达。因此，该术语涵盖促进或调 节转录的元件，包括启动子、RNA聚合酶与转录因子基本相互作用所需的核心元件、剪接信 号、聚腺苷酸化信号、上游元件、增强子和应答元件。能够指导原核生物中表达的调节元件 包括启动子、操纵子序列和核糖体结合位点。调节元件可以是基因组(如，病毒或真核生物) 来源的，或者可以是合成生成的。调节元件可以衍生自文库或数据库并经化学合成的。可以 将调节元件引入本发明的核酸分子中以优化转录、mRNA加工和稳定以及翻译成编码的氨基 酸序列。调节元件可通过在合适的限制性位点上连接或使用本领域技术人员已知的限制性 核酸内切酶通过插入序列中的接合体或接头与目标多核苷酸序列连接。 “启动子”或“启动子序列”是位于转录起始位点(通常在转录起始位点的上游或 5′)并起始特定目标多核苷酸序列转录的核苷酸序列。启动子可以是组成型的或诱导型的。 诱导型启动子仅在某些生理条件下才启动可操作连接的cds的转录，并可根据宿主细胞、所 需的表达水平、宿主细胞的性质等进行控制。 启动子包括真核启动子、病毒启动子和合成启动子，如β-肌动蛋白启动子、SV40早 期和晚期启动子、免疫球蛋白启动子、人巨细胞病毒(CMV)启动子、逆转录病毒启动子等。启 动子可以与或可以不与增强子缔合，其中该增强子可以与特定的启动子自然缔合或与不同 的启动子缔合。 术语“增强子”指顺式作用核苷酸序列，其增强可操作连接的多核苷酸序列的转录 并以与方向和位置无关的方式起作用。增强子可以在相对于转录起始位点的上游或下游的 任何位置起作用。当增强子与启动子可操作地连接时，增强子可以包含能够增加由启动子 的转录水平的任何核苷酸序列或由其组成。示例性增强子包括RSV  LTR增强子、杆状病毒 HR1、HR2或HR3增强子或CMV立即早期基因产物增强子。 可以将“标记”引入本发明的核酸分子中，以使得能够检测或选择已经被本发明的 核酸分子和/或载体成功转化(即包含本发明的核酸分子和/或载体)的宿主细胞。标记通常 是基因，将其引入宿主细胞后会表达显性表型，从而可以对携带该基因的细胞进行阳性选 择或检测。这种类型的基因是本领域已知的，尤其包括绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白 (YFP)、红色荧光蛋白(RFP)、萤光素酶、β-半乳糖苷酶(β-Gal)、β-葡萄糖醛酸酶、潮霉素B磷 酸转移酶基因(hph)、氨基糖苷磷酸转移酶基因(neo或aph)、二氢叶酸还原酶(DHFR)基因、 19 CN 111556875 A 说　明　书 15/45 页 腺苷脱氨酶基因(adenosine  daminase  gene)(ADA)和多药耐药性(MDR)基因。 进一步，目标调控元件包括“复制起点”(“ori”)，其赋予了在期望的宿主细胞中复 制的能力。任选地，核酸分子可以包含调节元件，其影响连接或插入期望的宿主细胞中。 载体 在进一步方面，本发明提供包含根据本发明的核酸分子的载体。换句话说，本发明 提供包含编码本文描述的ASC配体——诸如抗体——的多核苷酸序列的载体。 “载体”(本文中也称为“媒介物”或“构建体”)是用作转移、表达、复制、增殖、整合 和/或存储目标多核苷酸序列的媒介物的核酸分子。 根据本发明的载体可以选自病毒或非病毒载体。 非病毒载体包括质粒(整合的或非整合的)、质粒小环、转座子、粘粒和人工染色 体，例如细菌人工染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)。这样的非病毒载体可以与聚合物 或脂质复合，或者可以以“裸”RNA或DNA的形式提供。 病毒载体包括逆转录病毒、疱疹病毒、慢病毒、腺病毒和腺伴随病毒。逆转录病毒、 慢病毒和腺伴随病毒整合到宿主细胞DNA中，并因此具有在宿主中长期表达的潜力。逆转录 病毒可以选自鼠白血病病毒(MLV)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、莫洛尼 鼠白血病病毒(Mo  MLV)、藤浪氏肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、埃布尔森鼠 白血病病毒(A-MLV)和禽成红细胞瘤病毒(AEV)。慢病毒可以选自人类免疫缺陷病毒(HIV)、 猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、山羊关节炎脑 炎病毒(CAEV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和基于空泡病病毒(Jembrana  disease  virus)(JDV) 的载体。腺病毒可以选自第一代和第二代5型腺病毒以及无肠载体。腺伴随病毒可以选自所 有腺伴随血清型。 根据本发明的载体可以整合到宿主细胞的基因组中，或者作为独立的遗传元件 (如，附加体、质粒)存在。载体可以作为单个核酸分子或作为两个或更多个分开的核酸分子 存在。载体可以是单拷贝载体或多拷贝载体(指示通常在宿主细胞中维持的载体的拷贝 数)。载体通常是重组的，即自然界中不存在的人工分子。载体可以以直线和/或环状形式存 在。一些环状核酸载体可以在递送到细胞中之前被有意地直线化。 可以使用本领域中已知的方法将编码本发明的ASC配体的多核苷酸序列插入载体 “主链”中(参见Sambrook  J  et  al.,2012(4th  ed .) ,Molecular  cloning:a  laboratory  manual.Cold  Spring  Harbor  Laboratory,Cold  Spring  Harbor,New  York)。这些方法可 以包括体外重组DNA和合成技术以及基因重组。所得的载体被称为“重组”载体，因为其包含 来自供体基因组的核酸序列与载体核酸序列的新组合。可以通过已知技术鉴定包含所需多 核苷酸序列的重组载体，所述技术包括(a)测序；(b)核酸杂交；(c)“标记”基因功能的存在 或不存在；和(d)插入的多核苷酸序列的表达。 载体可以在其“主链”中包含另外的调节元件，如复制起点、增强子、限制性位点或 调节元件，如本文其他地方所述的。载体可包含指导其连接和整合入宿主细胞基因组等的 调节序列。 根据本发明的载体可以选自存储载体、克隆载体、转移或穿梭载体、表达载体、基 因治疗载体和其他载体。如将容易理解的，以上定义可以在一定程度上重叠，如，一些转移 载体也可以作为表达载体起作用。 20 CN 111556875 A 说　明　书 16/45 页 优选地，根据本发明的载体可以是基因治疗载体或表达载体。 “表达载体”是能够实现编码的表达产物表达的载体。“表达载体”通常是重组核酸 分子，其包含以“表达弹夹”形式编码目标表达产物的一个或多个多核苷酸序列。“表达弹 夹”包括所述多核苷酸序列(一个或多个)和促进所述多核苷酸序列(一个或多个)有效转录 的适当调节元件。通常将其插入载体主链中的多个克隆位点。合适的调节元件可包括转录 启动子和任选的增强子、翻译信号以及转录和翻译终止信号。表达载体的选择将受到宿主 表达系统选择的影响。用于稳定转化的表达载体通常具有可选择标记，其允许选择和维持 转化的细胞。在一些情况下，复制起点可用于扩增载体的拷贝数。 “基因治疗载体”是可以转移至待治疗的对象的载体，在对象中其实现多核苷酸序 列的表达。 宿主细胞 在进一步方面，本发明提供了包含根据本发明的ASC配体、核酸分子和/或载体的 宿主细胞。 合适的宿主细胞的选择取决于它们期望的用途和功能。 本发明尤其设想用于表达编码根据本发明的ASC配体的核酸分子和/或载体的多 核苷酸序列的宿主细胞。可以使用多种宿主-载体系统来表达编码ASC配体的多核苷酸序 列。这些包括用病毒(如牛痘病毒、腺病毒和其他病毒)感染的哺乳动物细胞系统；用病毒 (如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；微生物，诸如含酵母载体的酵母；或用噬菌体、DNA、质 粒DNA或粘粒DNA转化的细菌。 更具体地，宿主细胞可以选自原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动 物细胞。 原核细胞，例如大肠杆菌，可以用于产生大量的(蛋白质性质的)ASC配体。大肠杆 菌的转化是本领域技术人员众所周知的简单而快速的技术。大肠杆菌的表达载体可包含诱 导型启动子，例如，用于诱导高水平的蛋白表达和用于表达对宿主细胞显示一些毒性的蛋 白。诱导型启动子的实例包括lac启动子、trp启动子、杂合tac启动子、T7和SP6RNA启动子以 及温度调节的λPL启动子。 (蛋白质性质的)ASC配体可以在大肠杆菌的细胞质环境中表达。可选地，可以将前 导序列融合至所需的蛋白质产物，从而将蛋白质引导至氧化性周质空间。前导通常被周质 内部的信号肽酶去除。靶向周质的前导序列的实例包括来自果胶酸裂合酶基因的pelB前导 和源自碱性磷酸酶基因的前导。在一些情况下，周质表达允许表达的蛋白质泄漏到培养基 中。蛋白质的分泌允许从培养上清液中快速并简便的纯化。可以通过渗透裂解从周质中获 得未被分泌的蛋白质。与细胞质表达类似，在一些情况下，蛋白质可能会变得不溶，而变性 剂和还原剂可用于促进溶解和重折叠。可使用还原剂(诸如二硫苏糖醇和β-巯基乙醇)和变 性剂(诸如胍-HCl和尿素)来增加表达的蛋白质产物的溶解度。诱导和生长的温度也可以影 响表达水平和溶解度，通常使用25℃至37℃之间的温度。通常，细菌产生无糖基化的蛋白 质。因此，如果蛋白质需要糖基化才能发挥功能，则可以在从宿主细胞中纯化后在体外添加 糖基化。 酵母细胞(诸如酿酒酵母、裂殖酵母、解脂耶氏酵母、乳酸克鲁维酵母和巴斯德毕 赤酵母)是众所周知的酵母表达宿主，其可用于产生蛋白质，诸如本文所述的(蛋白质性质 21 CN 111556875 A 说　明　书 17/45 页 的)ASC配体。可以用附加型复制载体或通过同源重组的稳定染色体整合来转化酵母细胞。 通常，诱导型启动子被用于调节基因表达。这种启动子的实例包括GAL1、GAL7和GAL5和金属 硫蛋白启动子，诸如CUP1、AOX1或其他毕赤酵母或其他酵母启动子。表达载体可以包括可选 择标记，诸如LEU2、TRP1、HIS3和URA3，用于选择和维持转化的DNA。酵母中表达的蛋白质通 常是可溶的。与伴侣蛋白(诸如Bip和蛋白二硫键异构酶)的共表达可改善表达水平和溶解 度。另外，可以使用分泌信号肽融合物(诸如来自酿酒酵母的酵母交配型α因子分泌信号)和 与酵母细胞表面蛋白(例如Aga2p交配粘附受体或阿糖胞苷葡糖淀粉酶)的融合物来指导在 酵母中表达的蛋白质进行分泌。可以对诸如Kex-2蛋白酶的蛋白酶切割位点进行工程化，以 在它们离开分泌途径时从表达的多肽中去除融合序列。酵母还能够在Asn-X-Ser/Thr基序 处进行糖基化。 昆虫细胞表达系统表达高水平的蛋白质，并且能够进行高级真核生物使用的大多 数翻译后修饰。杆状病毒具有限制性宿主范围，其提高了安全性并减少了对真核表达的调 节关注。典型的表达载体使用用于高水平表达的启动子，例如杆状病毒的多角体基因启动 子。常用的杆状病毒系统包括杆状病毒，诸如苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa  californica  nuclear  polyhedrosis  virus)(AcNPV)和家蚕核型多角体病毒(Bombyx  mori  nuclear  polyhedrosis  virus)(BmNPV)和昆虫细胞系，诸如来自草地贪夜蛾的Sf9、 一星黏虫(Pseudaletia  unipuncta)(A7S)和黑脉金斑蝶(DpN1)。为了高水平表达，可以就 在病毒的多角体基因起始密码子的下游融合待表达的分子的核苷酸序列。哺乳动物分泌信 号在昆虫细胞中得到精确加工，并且可用于将表达的蛋白质分泌到培养基中。此外，细胞系 一星黏虫(A7S)和黑脉金斑蝶(DpN1)产生的蛋白质具有类似于哺乳动物细胞系统的糖基化 模式。 昆虫细胞中的可选的表达系统是使用稳定转化的细胞。可以使用诸如Schneider  2(S2)和Kc细胞(黑腹果蝇)和C7细胞(白纹伊蚊)等的细胞系进行表达。果蝇金属硫蛋白启 动子可用于在镉或铜的重金属诱导的存在下诱导高水平表达。通常通过使用诸如新霉素和 潮霉素的可选择标记来维持表达载体。 表达载体可以通过病毒感染(诸如腺病毒)或通过直接DNA转移(诸如脂质体、磷酸 钙、DEAE-葡聚糖)以及通过物理手段(例如电穿孔和显微注射)转移至哺乳动物细胞。用于 哺乳动物细胞的表达载体通常包括mRNA帽位点、TATA盒、翻译起始序列(Kozak共有序列)和 聚腺苷酸化元件。也可以添加IRES元件以允许与另一个基因(诸如可选择标记)的双顺反子 表达。这样的载体通常包括用于高水平表达的转录启动子-增强子，例如SV40启动子-增强 子、人巨细胞病毒(CMV)启动子和劳斯肉瘤病毒(RSV)的长末端重复序列。这些启动子-增强 子在许多细胞类型中都有活性。组织和细胞型启动子和增强子区也可以用于表达。示例性 启动子/增强子区包括但不限于来自下述基因的那些，诸如弹性蛋白酶1、胰岛素、免疫球蛋 白、小鼠乳腺肿瘤病毒、白蛋白、α甲胎蛋白、α1抗胰蛋白酶、β球蛋白、髓鞘碱性蛋白、肌球蛋 白轻链2和促性腺素释放素基因对照。可选择标记可用于选择和维持带有表达构建体的细 胞。可选择标记基因的实例包括但不限于潮霉素B磷酸转移酶、腺苷脱氨酶、黄嘌呤-鸟嘌呤 磷酸核糖基转移酶、氨基糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶(DHFR)和胸苷激酶。例如，可以 在氨甲蝶呤存在下进行表达以仅选择表达DHFR基因的那些细胞。与细胞表面信号传导分子 如TCR-ζ和FcεRI-γ融合可指导蛋白质在细胞表面以活性状态表达。 22 CN 111556875 A 说　明　书 18/45 页 许多细胞系可用于哺乳动物表达，包括小鼠、大鼠、人、猴、鸡和仓鼠细胞。示例性 细胞系包括但不限于CHO、Balb/3T3、HeLa、MT2、小鼠NS0(非分泌)和其他骨髓瘤细胞系、杂 交瘤和异源杂交瘤细胞系、淋巴细胞、成纤维细胞、Sp2/0、COS、NIH3T3、HEK293、293S、2B8和 HKB细胞。还可用适用于无血清培养基的细胞系，该培养基有助于从细胞培养基中纯化分泌 的蛋白质。实例包括CHO-S细胞(Invitrogen,Carlsbad,Calif.,目录号#11619-012)和无血 清EBNA-1细胞系(Pham  et  al.,(2003)Biotechnol.Bioeng.84:332-342)。还可用适合在针 对最大表达进行优化的特殊培养基中生长的细胞系。例如，DG44CHO细胞适合在化学成分确 定的无动物产品培养基中的悬浮培养物中生长。 转基因植物细胞和植物可用于表达蛋白质，诸如本文所述的任何蛋白质。通常使 用直接DNA转移如微粒轰击(microprojectile  bombardment)和PEG介导转移入原生质体以 及农杆菌介导的转化，将表达载体转移至植物。表达载体可包括启动子和增强子序列、转录 终止元件和翻译控制元件。表达载体和转化技术通常分为双子叶植物宿主(例如拟南芥和 烟草)和单子叶植物宿主(例如玉米和水稻)。用于表达的植物启动子的实例包括花椰菜花 叶病毒启动子、胭脂碱合成酶启动子、核糖双磷酸羧化酶启动子以及泛素和UBQ3启动子。诸 如潮霉素、磷酸甘露糖异构酶和新霉素磷酸转移酶的可选择标记通常用于促进转化的细胞 的选择和维持。转化的植物细胞可以作为细胞、团聚体(愈伤组织)维持在培养物中，或者可 以再生成完整的植物。转基因植物细胞还可以包括经工程改造以产生透明质酸酶多肽的藻 类。由于植物的糖基化模式不同于哺乳动物细胞，因此这可影响这些宿主中产生的蛋白质 的选择。 (蛋白质性质的)ASC配体可以使用本领域已知的任何合适的技术从宿主细胞中纯 化。分泌的蛋白质通常在去除细胞后从培养基中纯化。细胞内表达的蛋白质通常在宿主细 胞裂解后从细胞提取物中纯化。纯化技术可能涉及SDS-PAGE、尺寸分级和尺寸排阻色谱、硫 酸铵沉淀和离子交换色谱(例如阴离子交换)。亲和力纯化技术也可以用于纯化抗体或其他 蛋白质或肽。所述抗体或蛋白质或肽也可以被工程化以添加亲和力标签，诸如myc表位、GST 融合物或His6，并能够分别用myc抗体、谷胱甘肽树脂和Ni-树脂进行亲和力纯化。可以通过 本领域已知的任何方法来评估纯度，其包括凝胶电泳以及染色和分光光度技术。 (药物)组合物 在进一步方面，本发明提供了一种组合物，其包含本文所述的ASC配体、核酸、载体 或宿主细胞中任一种，或其组合，以及任选地至少一个药学上可接受的赋形剂。该组合物可 以优选地是药物组合物。药物组合物通常是根据对监管机构或根据公认的药典制备的用于 动物和人类的其他机构的批准而制备的。 出于生产增强、患者可接受性、改善稳定性、控制释放等目的，可以添加赋形剂。通 常，赋形剂是药物组合物的主要成分，活性剂仅以相对少量存在。有时，赋形剂也称为“非活 性”或“惰性”成分。但是，一些赋形剂也可能对药代动力学或药效动力学产生影响，尤其是 对共同施用活性剂的吸收、分布、代谢和消除(ADME)过程产生影响。 赋形剂通常基于其在药物制剂中的作用以及基于影响药物递送的相互作用—— 基于其化学和物理化学性质进行分类。赋形剂的主要类别包括抗氧化剂、包衣材料、乳化剂 (emulgent)、味道和气味改善剂、软膏基质、防腐剂、稠度改善剂、崩解材料、稀释剂、填料、 膨胀剂、载体、粘合剂、润滑剂、助流剂、溶剂和助溶剂、缓冲剂、润湿剂、消泡剂、增稠剂和保 23 CN 111556875 A 说　明　书 19/45 页 湿剂。一些赋形剂可以起到多种作用；例如，甲基纤维素是包衣材料，用于制备悬浮液，以增 加粘度，作为片剂中的崩解剂或粘合剂。 术语“药学上可接受的”是指与一种或多种活性剂相容并且不干扰和/或基本上降 低其/它们的药学作用的化合物。药学上可接受的赋形剂优选具有足够高的纯度和足够低 的毒性，以使其适合与活性剂(一种或多种)共同施用至对象。 合适的药学上可接受的赋形剂的选择通常由药物组合物的选择施用途径和制剂 决定。 根据本发明的药物组合物可以通过皮下、静脉内、肌肉内、动脉内、皮内、腹膜内、 血管内(i.v.)、鼻内、透皮、病变内、肿瘤内、颅内、肺内、心内、舌下、直肠、颊或阴道施用途 径进行施用。适用于这种途径的制剂是本领域技术人员已知的。施用可以是局部的或者是 全身的。可以通过(例如但不限于)手术过程中的局部输注、外部应用(例如结合手术后的伤 口敷料)、通过注射、借助导管、借助栓剂或借助植入物实现在需要治疗的面积中的局部施 用。全身施用可以通过口服施用或通过注射来实现，所述注射可以是无针注射(喷射注射) 和/或针注射。 药物组合物可以配制成片剂、胶囊剂、丸剂、粉末剂、颗粒剂、栓剂、无菌肠胃外溶 液或混悬剂、口服溶液或混悬剂、油水乳剂和缓释制剂。制剂应适合于施用模式。根据本发 明的药物组合物也可以作为冻干粉剂提供，其可以重构为溶液、乳液和其他混合物进行施 用。它们也可以被重构并配制成固体或凝胶。 用于外部施用的药物组合物可以配制成乳膏、凝胶剂、软膏剂、乳液、溶液、酏剂、 洗剂、悬浮液、酊剂、糊剂、泡沫剂、气溶胶、灌洗剂、喷雾剂、栓剂、绷带、皮肤贴剂、气雾剂或 任何其他适于外部施用的制剂。用于直肠施用的药物组合物可以配制成直肠栓剂、胶囊剂 和片剂。用于口服施用的药物组合物可以配制成片剂或胶囊剂。药物组合物也可以通过控 释制剂和/或递送装置进行施用。根据本发明的(药物)组合物可以以液体、固体或半固体形 式配制。 根据本发明的药物组合物可以以单位剂型或多倍剂型提供。每个单位剂量通常包 含有效量的活性剂(一种或多种)，以及所需的药学上可接受的赋形剂。单位剂型的实例包 括安瓿和注射器以及单独包装的片剂或胶囊。单位剂量的肠胃外制剂可以包装在例如安 瓿、药筒、小瓶或带针的注射器中。单位剂型可以以其分数或倍数施用。多倍剂型是包装在 单个容器中的多个相同的单位剂型，以便以分开的单位剂型施用。多倍剂型的实例包括小 瓶、片剂或胶囊剂的瓶、或品脱或加仑的瓶。因此，多倍剂型是在包装中没有分开的多个单 位剂量。 优选地肠胃外施用本发明的ASC配体。 肠胃外施用可以通过注射或输注来完成，如，皮下、肌肉内、静脉内或皮内注射或 输注。可选地，肠胃外施用可以通过吸入来实现。肠胃外施用的药物组合物可以制备成液体 溶液或悬浮液、乳剂或能够在施用前在合适的液体介质中重构的固体形式。肠胃外施用的 药物组合物通常存储在小瓶、静脉输液袋(IV  bag)、安瓿、药筒或预装注射器中。 肠胃外施用的药物组合物优选地包括易于施用的无菌溶液、悬浮液或乳剂或其浓 缩形式，在使用前其必须在合适的溶剂中稀释。溶液、悬浮液和乳液可以是水性或非水性 的。 24 CN 111556875 A 说　明　书 20/45 页 水性媒介物的实例包括氯化钠注射剂、林格注射剂、等渗右旋糖注射剂、无菌水注 射剂、右旋糖和乳酸林格注射剂。非水性媒介物包括植物来源的不挥发油、杏仁油、油性酯、 棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油。液体药物组合物可进一步包含缓冲剂、润湿剂、乳化剂、 稳定剂、溶解度增强剂、抗微生物剂、等渗剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮和分散剂、乳化 剂、隔离剂或螯合剂。抑细菌或抑真菌浓度的抗微生物剂包括苯酚或甲酚、汞、苯甲醇、氯丁 醇、甲基和丙基对羟基苯甲酸酯、硫柳汞、苯扎氯铵、山梨酸和苄索氯铵。等渗剂包括氯化钠 和右旋糖。缓冲剂包括磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉药包括盐酸普 鲁卡因。悬浮剂和分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。乳化 剂包括聚山梨酯80(吐温80)。金属离子的隔离剂或螯合剂包括EDTA或环糊精。增稠剂和增 溶剂包括葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇。悬浮剂包括山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食 用脂肪。乳化剂包括卵磷脂或阿拉伯胶。进一步感兴趣的赋形剂包括用于与水混溶的媒介 物的聚乙二醇和丙二醇；用于pH调节的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。 用于静脉内施用的液体药物组合物优选是无菌的和等渗的。合适的赋形剂优选地 包括无菌和等渗的水性媒介物，诸如生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)作为载体，以及增稠 剂或增溶剂例如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇。 药物组合物可包含递送系统，诸如脂质体、脂质纳米颗粒、脂质复合物 (lipoplexes)、微粒或微胶囊。 药物组合物可进一步包含可用于治疗或预防本文定义的神经变性疾病的额外活 性剂。此类额外活性剂可以选自促智剂、神经保护剂、抗帕金森病药物、淀粉样蛋白沉积抑 制剂、β淀粉样合成抑制剂、抗抑郁剂、抗焦虑药、抗精神病药和抗多发性硬化症药物、或其 组合。 试剂盒 在进一步方面，本发明涉及包含根据本发明的ASC配体、核酸、载体、宿主细胞、药 物组合物或其任何组合的试剂盒或部分试剂盒(kit-of-parts)。任选地，试剂盒可额外包 含如“(药物)组合物”部分中所述的药学上可接受的赋形剂或进一步活性剂。 ASC配体、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物可以以任何合适形式如以液体或冻 干形式提供。 试剂盒或部分试剂盒可以是两个或更多个部分的试剂盒，并且通常在合适的容器 中包含其组分。例如，每个容器可以是小瓶、瓶、挤压瓶、广口瓶、密封套筒、包封或小袋、试 管或泡罩包装的形式，或任何其他合适的形式，只要该容器被配置为防止成分的过早混合 即可。可以分别提供每种不同的成分，或者可以将一些不同的成分一起提供(即，在同一容 器中)。 容器也可以是小瓶、试管、广口瓶或包封内的隔室或腔室，或者是套筒、泡罩包装 或瓶，条件是在由药剂师或医师有意混合之前一个隔室的内容物不能与另一个隔室的内容 物在物理上相关联。 此外，试剂盒或部分试剂盒可以含有具有关其任何成分的使用、施用和剂量的信 息的技术说明书。 医疗使用和治疗 在进一步方面，本发明涉及治疗神经变性疾病的方法，该方法包括向有需要的对 25 CN 111556875 A 说　明　书 21/45 页 象施用有效量的根据本发明的ASC配体、核酸分子、载体、宿主细胞或药物组合物，或其任何 组合。 这样的方法可以包括在向对象施用有效量的本发明的ASC配体、核酸分子、载体、 宿主细胞或药物组合物之前制备本发明的ASC配体、核酸分子、载体、宿主细胞或药物组合 物的任选的第一步骤。 神经变性疾病： 本发明提供了用于治疗或预防神经变性疾病的ASC配体。神经变性疾病通常是慢 性进行性疾病，其特征在于中枢神经系统(CNS)例如脑的离散区域中的神经元逐渐丢失。 设想通过使用本发明的ASC配体进行治疗或预防的神经变性疾病可以优选地特征 在于痴呆和/或伴有痴呆。“痴呆”是心智能力下降的通用术语，其严重程度足以干扰日常生 活。痴呆可包括记忆力、沟通和语言、聚焦和专注的能力、推理和判断、视觉感知或其组合下 降或丧失。它可能由多种神经变性疾病中的神经变性引起。 本发明人发现，在先天免疫炎症事件过程中能够阻断其团聚的ASC配体可用于预 防或减少脑内Aβ-斑块的形成。因此，特别设想根据本发明的ASC配体用于治疗特征在于和/ 或伴有Aβ相关病理学的神经变性疾病。术语“Aβ相关病理学”是指脑中淀粉样β的异常产生、 沉积和团聚。 优选地，所述神经变性疾病选自阿尔兹海默症、帕金森氏病、亨廷顿氏病、多系统 萎缩症、肌萎缩性侧索硬化症、髓脑小脑性共济失调、额颞痴呆、额颞叶变性、轻度认知障 碍、帕金森叠加综合症、皮克病、进行性孤立性失语症、灰质变性[Alpers]、亚急性坏死性脑 病或路易体痴呆，尤其优选阿尔兹海默症。 “阿尔兹海默症”(“AD”)是神经变性脑病，其是老年人中痴呆的主要原因。AD的症 状可能包括学习和记忆功能的逐步丧失、人格改变、神经肌肉改变、癫痫发作以及偶发的精 神病行为。阿尔兹海默症的特征在于淀粉样-β斑块沉积在脑区域中，这些区域对于记忆和 其他认知功能至关重要。据认为，淀粉样β斑块在脑的这些关键区域中的沉积干扰脑的功 能。 然而，根据本发明的ASC配体的用途并不一定限于以Aβ-斑块形成为特征的神经变 性疾病。ASC是实现多种生物学功能的衔接蛋白。因此，其他神经变性疾病也有望用本发明 的ASC配体进行治疗或预防。 根据本发明设想治疗或预防的进一步神经变性疾病包括遗传性共济失调、先天性 非进行性共济失调、早发性小脑性共济失调、晚发性小脑性共济失调、伴有缺陷性DNA修复 的小脑性共济失调、遗传性痉挛性截瘫、婴儿性脊髓性肌萎缩、I型韦-霍二氏病[Werdnig- Hoffman]、遗传性脊髓性肌萎缩症、主要影响中枢神经系统的系统性萎缩症、副肿瘤性神经 肌病和神经病、脊髓灰质炎后综合征、基底神经节变性疾病、哈-斯二氏病、进行性核上眼肌 麻痹[斯-里-奥三氏病]、神经源性体位性低血压[希-德二氏病]、肌张力障碍、震颤、舞蹈 病、不安腿综合征、僵硬综合征、锥体束外和运动障碍、多发性硬化症、急性弥漫性脱髓鞘、 视神经脊髓炎[德维克病]、急性和亚急性出血性脑白质炎[赫斯特病]、周围性脑炎、谢耳德 氏病、胼胝体中心性脱髓鞘、中央脑桥髓鞘溶解、中枢神经系统脱髓鞘疾病的急性横贯性脊 髓炎、亚急性坏死性脊髓炎、同心性硬化、癫痫症、局部相关的(局灶性)(部分)特发性癫痫 和伴局部癫痫发作的癫痫综合征、局部相关的(局灶性)(部分)的症状性癫痫和伴简单部分 26 CN 111556875 A 说　明　书 22/45 页 发作的癫痫综合征、局部相关的(局灶性)(部分)的症状性癫痫和伴复杂部分发作的癫痫综 合征、婴儿期肌阵挛性癫痫、新生儿惊厥(家族性)、童年失神癫痫[类癫痫发作]、失神癫痫、 肌阵挛性癫痫[冲动性癫痫小发作]、伴有肌阵挛性失神的癫痫、肌阵挛性静息性癫痫发作、 小儿痉挛、伦-加二氏综合征、萨拉姆发作、有症状的早期肌阵挛性脑病、韦斯特综合征、持 续性不全癫痫[Kozhevnikof]、癫痫大发作、癫痫小发作、癫痫持续状态、癫痫大发作状态、 癫痫小发作状态、复杂性部分癫痫状态、偏头痛、丛集性头痛综合征、血管性头痛、紧张型头 痛、慢性创伤后头痛、发作性睡眠和猝倒、克-列二氏(Kleine-Levin)综合征。 “治疗”或“处理”包括以下目标：(1)预防在尚未诊断出患有不期望症状或病理状 态的对象中不期望的症状或病理状态发生；(2)抑制不期望的症状或病理状态，即阻止其发 展；或(3)改善或缓解不期望症状或病理状态，即使得不期望症状或病理状态消退。 本发明的ASC配体、核酸分子、载体、宿主细胞和(药物)组合物可以用于人类，并且 也可以用于兽医医学目的，优选用于人类医学目的。因此，本文所用的术语“对象”、“患者” 或“个体”通常包括人类和非人类动物，并且优选地包括哺乳动物(如，非人类灵长类动物， 包括绒猴、绢毛猴、蜘蛛猴、枭猴、黑长尾猴、松鼠猴、和狒狒、猕猴、黑猩猩、猩猩、大猩猩； 牛；马；棉羊；猪；鸡；猫；狗；小鼠；大鼠；兔；豚鼠等)，包括嵌合和转基因动物和疾病模型。在 本发明的上下文中，术语“对象”优选是指非人灵长类动物或人，最优选是指人。 “有效量”意思是足以在所寻求的组织、系统、动物或人类中引起期望的生物学或 医学应答的活性剂(一种或多种)或组合物的量。因此，“有效量”优选地足以诱导待治疗的 疾病的阳性改变，即，减轻所治疗的疾病的症状、减轻疾病的进展或预防所预防的疾病的症 状。然而，同时，“有效量”优选是安全的，即足够小以避免严重的副作用，也就是说，允许有 利与风险之间的合理的关系。通常，“有效量”可能会关于待治疗的特定病症以及待治疗的 患者的年龄、身体条件、体重、性别和饮食，病症的严重程度，治疗的持续时间，共同治疗的 性质，所用的具体药学上可接受的赋形剂，治疗方案和类似因素而改变。“有效量”可以通过 细胞培养物或实验动物中的标准制药程序确定，如，用于确定LD50(对50％的群体致死的剂 量)和ED50(对50％的群体治疗有效的剂量)。适用于确定“有效量”的示例性动物模型包括 但不限于兔、绵羊、小鼠、大鼠、狗和非人类灵长类动物模型。毒性和治疗效果之间的剂量比 是治疗指数，并且可以表示为LD50/ED50之比。通常优选表现出大治疗指数的活性剂或组合 物。从细胞培养物测定和动物研究中获得的数据可用于配制用于人类的剂量范围。此类化 合物的剂量优选在包括很少或没有毒性的ED50的循环浓度范围内。在本发明的上下文中， “有效量”范围可以为约0.001mg至10mg、约0.01mg至5mg、约0.1mg至2mg每剂量单位或约 0.01nmol至1mmol每剂量单位，诸如1nmol至1mmol每剂量单位，或1μmol至1mmol每剂量单 位。“有效量”范围还可以在(每kg体重)约0.01mg/kg至10g/kg、约0.05mg/kg至5g/kg、或约 0.1mg/kg至2.5g/kg。 可以通过皮下、静脉内、肌肉内、动脉内、皮内、腹膜内、血管内(i.v.)、鼻内、透皮、 病变内、肿瘤内、颅内、肺内、心内、舌下、直肠、颊或阴道施用途径来完成施用。施用可以是 局部的或者是全身的。可以通过(例如但不限于)手术过程中的局部输注、外部应用(如)结 合手术后的伤口敷料、通过注射、借助导管、借助栓剂或借助植入物实现在需要治疗的面积 中的局部施用。全身施用可以通过口服施用或通过注射来实现，所述注射可以是无针注射 (喷射注射)和/或针注射。 27 CN 111556875 A 说　明　书 23/45 页 ASC配体、核酸、载体、宿主细胞或(药物)组合物可以每天多次、每天、每隔一天、每 周或每月向有需要的对象施用。 ASC配体、核酸、载体、宿主细胞或(药物)组合物，以及“药物组合物”部分中描述的 任选其他活性剂顺序(在不同时间通过相同或不同的施用途径)或同时(在相同时间通过相 同或不同的施用途径)或在相同的药物组合物中。顺序施用方案也称为“时间错开(time- staggered)”施用。时间错开施用包括如下方案，其中在第二剂量的相同ASC配体、核酸、载 体、宿主细胞或(药物)组合物，或一定剂量的另一活性剂(其可以是本发明的ASC配体、核 酸、载体、宿主细胞或(药物)组合物或另一活性剂)之前、同时或之后，施用第一剂量的ASC 配体、核酸、载体、宿主细胞或(药物)组合物。 编码根据本发明的ASC配体的核酸或载体也可以用于基因治疗。“基因治疗”通常 是指出于治疗目的而对基因组进行的操作，并且包括使用基因组编辑技术来校正导致疾病 的突变，向基因组中添加治疗基因，去除有害基因或基因组序列，以及调谐基因表达。基因 治疗可能涉及对象细胞的体内或离体转化。例如，可以将编码根据本发明的ASC配体的核酸 或载体施用至患有神经变性疾病的对象，在该对象中它们被表达以产生编码的ASC配体。通 常，核酸可以以合适的载体的形式递送至对象，所述载体能够转移和表达编码的ASC配体。 这样的载体在本文其他地方描述，并且包括如病毒载体。可选地，核酸可以以“裸”形式递 送，或与脂质、聚合物或其他合适的复合剂复合。 诊断方法和试剂盒 本发明进一步涉及利用针对ASC团聚体的自身抗体的存在的诊断方法。本文所述 的诊断用途和方法可使用待诊断的对象的分离样品在体内或体外进行。 因此，在进一步方面，本发明涉及包含CARD的凋亡相关斑点样蛋白质(ASC)，其用 于诊断对象中神经变性疾病或发展成神经变性疾病的风险的方法中，所述方法包括(i)使 所述样品与ASC蛋白或其同源物、同工型、变体、片段、衍生物或团聚体接触，所述ASC蛋白包 含对应于SEQ  ID  NO：1的氨基酸序列或由其组成，和(iii)检测分析物与所述ASC蛋白或其 同源物、同工型、变体、片段、衍生物或团聚体的结合。 此外，本发明还涉及诊断对象中神经变性疾病或发展成神经变性疾病的风险的方 法，所述方法包括(i)任选地从怀疑患有所述疾病或处于发展所述疾病风险下的对象中收 集样品；(ii)使所述样品与ASC蛋白或其同源物、同工型、变体、片段、衍生物或团聚体接触， 所述ASC蛋白包含对应于SEQ  ID  NO：1的氨基酸序列或由其组成，和(iii)检测分析物与所 述ASC蛋白或其同源物、同工型、变体、片段、衍生物或团聚体的结合。 诊断用途和方法可涉及在固体支持物上提供所述ASC结合蛋白或其同源物、同工 型、变体、片段、衍生物或团聚体。可以使用众所周知的技术完成分析物检测，其包括免疫扩 散、免疫印迹技术、免疫荧光、酶免疫测定和基于多重磁珠测定的流式细胞术。 分析物可以优选是自身抗体。自身抗体是如此抗体，其识别或结合产生所述抗体 的宿主的抗原。本发明人提出人抗ASC团聚体抗体可以防止淀粉样-β肽在脑中的交叉播种 (cross-seeding)。然而，在衰老相关的免疫衰老过程中，抗体生成和免疫监视的受损可能 会导致针对ASC团聚体的自身抗体的降低水平的生产，并从而导致较高风险的淀粉样-β团 聚。因此，内源性抗ASC团聚体抗体滴度可用作疾病进展的可能标记，尤其是在诸如阿尔兹 海默症之类的神经变性疾病的临床沉默前期(pre-stage)。 28 CN 111556875 A 说　明　书 24/45 页 因此，诊断用途和方法可以包括定量样品中的分析物并且任选地将所述量与参比 进行比较的进一步步骤。 参比可以是诸如通过对健康对象或源自所述健康对象的样品进行相同的诊断方 法获得的抗体滴度的值。参比可以源自与待诊断的对象不同的对象，或者可以源自已经在 较早的时间点诊断的相同对象。参比也可以是诸如来自多个健康对象的抗体滴度之类的 值，例如，中值。 与参比相比，待诊断的对象中分析物或源自所述待诊断的对象的样品的量减少指 示神经变性疾病或发展所述疾病的风险。据认为，衰老过程中降低的免疫监视和自身抗体 产生增加淀粉样-β团聚的风险。 因此，本文所述的诊断用途和方法可以优选地特征在于或伴有ASC团聚和/或淀粉 样-β团聚的存在。 优选地，所述神经变性疾病可以选自阿尔兹海默症、帕金森氏病、亨廷顿氏病、多 系统萎缩、肌萎缩性侧索硬化症、髓脑小脑性共济失调、额颞痴呆、额颞叶变性、轻度认知障 碍、帕金森叠加综合征、皮克病、进行性孤立性失语症、灰质变性[Alpers]、亚急性坏死性脑 病或路易体痴呆，尤其优选阿尔兹海默症。 本发明进一步提供了用于执行本文所述的诊断方法和用途的诊断试剂盒，其包含 ASC蛋白或ASC团聚体以及用于检测自身抗体与所述蛋白或团聚体结合的检测工具。 组合疗法 本发明的ASC配体、核酸分子、载体、宿主细胞或药物组合物也用于组合疗法。为 此，可用于治疗或预防神经变性疾病的任何治疗或预防手段可与根据本发明的治疗组合使 用。 因此，受神经变性疾病折磨的对象可以用本发明的ASC配体、核酸分子、载体、宿主 细胞或药物组合物治疗，并且另外地接受以下化合物或活性剂中的一种或多种：胆碱酯酶 抑制剂，诸如多奈哌齐、加兰他敏、卡巴拉汀或他克林；MDA(N-甲基-D-天冬氨酸)受体拮抗 剂，诸如美金刚胺；维生素E；维生素A；α-生育酚；硒；锌；叶酸；维生素B12；ω-3脂肪酸；二十 二碳六烯酸(DHA)；或其组合。这些化合物和活性剂可以以与本发明的ASC配体、核酸分子、 载体、宿主细胞或药物组合物相比的时间错开施用方案同时或顺序施用。 体外方法 在进一步方面，本发明还提供了体外方法，用于确定候选配体是否能够与包含对 应于SEQ  ID  NO：1的氨基酸序列或由其组成的ASC蛋白或其同源物、同工型、变体、片段或衍 生物相互作用，优选地与之结合，所述方法包括：(i)使候选配体与包含对应于SEQ  ID  NO：1 的氨基酸序列或由其组成的ASC蛋白或其同源物、同工型、变体、片段或衍生物接触；和(ii) 检测候选配体的结合。 该方法可以进一步包括评估候选配体是否在体外抑制a)ASC团聚和/或b)淀粉样- β团聚的步骤。该额外的方法步骤可以使用所附实施例中描述的方法来完成。 在进一步方面，本发明提供了用于ASC配体的体外筛选方法，所述方法包括以下步 骤：(a)提供包含对应于SEQ  ID  NO：1的氨基酸序列或由其组成的ASC蛋白或其同源物、同工 型、变体、片段或衍生物，(b)使所述ASC蛋白与候选配体接触；和(c)检测所述候选配体与所 述ASC蛋白的特异性结合。 29 CN 111556875 A 说　明　书 25/45 页 本发明进一步涉及通过所述方法可获得的ASC配体，所述ASC配体选自抗体、蛋白 质、肽、核酸或小分子有机化合物。 在进一步方面，本发明涉及用于确定样品中ASC团聚体存在的体外方法，其包括以 下步骤：i)使从对象获得的样品与本文所述的ASC配体接触，和ii)检测所述ASC配体的特异 性结合；其中所述ASC配体的可检测结合指示对象中ASC团聚体的存在。 样品可以例如是脑活组织检查。所述ASC配体的可检测结合可以指示特征在于或 伴随ASC团聚和/或淀粉样-β团聚的存在的神经变性疾病或发展其的风险。所述神经变性疾 病可以选自本文描述的任何神经变性疾病，并且可以优选地是阿尔兹海默症。 附图说明 在下文中，将给出附图的简要描述。这些附图旨在更详细地说明本发明。然而，它 们无意以任何方式限制本发明的主题。 图1.小胶质细胞释放的ASC斑点结合并交叉播种β-淀粉样肽。(a)AD脑和年龄匹配 的非痴呆对照(Con)的海马切片中小胶质细胞中(Con-in,AD-in)和外部(Con-ex,AD-ex)检 测的ASC斑点，(n＝10个生物学上独立的人情况，均值±SEM，单向ANOVA，Tukey检验，***p< 0.0001)。(b)各种年龄APP/PS1小鼠的海马中含有ASC斑点和无ASC斑点的小胶质细胞和量 化(n＝5个生物学上独立的动物，均值±SEM，单向ANOVA，Tukey检验，***p＝0.0002)(a ,b： 比例尺(Bar)＝10μm)。(c)暴露至尼日菌素(10μM)或ATP(5mM)的LPS-初免的小鼠小胶质细 胞释放的Alexa-488-标记的ASC斑点的流式细胞术。(d)每μl的静置或激活的小胶质细胞(n ＝3个技术重复，均值±SD)的无细胞上清液的ASC-Alexa  488 斑点的量化和包括细胞外 ASC斑点的放大的LPS-初免的、ATP-激活的小胶质细胞的共焦成像(比例尺＝6μm)。(e)细胞 外TAMRA-Aβ1-42-结合THP-1-细胞释放的GFP-连接的ASC斑点。(f)通过免疫刺激的原代小胶 质细胞采用ASC释放的Aβ结合实验的实验示意图。(g)在Aβ1-42存在或不存在的情况下，源自 wt或ASC-/-和对照(Con)和免疫刺激的(激活的)原代小胶质细胞的上清液的流式细胞分析， 和(h)在wt和ASC-/-上清液中ASC/Aβ1-42事件的数目的量化(n＝4个生物学上独立的实验，均 值±SEM，单向ANOVA，Tukey检验，***p<0.0001)。(i)ASC斑点和Aβ1-42共培育的硫黄素-T荧 光试验(n＝2个生物学上独立的样品，均值±SEM)。(j)通过免疫印迹检测的ASC斑点增强的 Aβ1-42寡聚物形成的确认和(k)在单个时间点的量化(n＝4个生物学上独立的实验，均值± SEM，双尾学生t-检验，2h**p＝0.0089，4h**p＝0.0093，6h***p＝0.001，24h***p<0.0001)。 独立地重复d、i、j中所示实验两次。 图2.ASC斑点与Aβ共沉降并形成小鼠和人Aβ斑块核。(a)0和6h的ASC斑点-Aβ共沉 降实验的示意图。(b)(1)Aβ1-42或Aβ1-40单独、(2)Aβ1-42或Aβ1-40连同ASC斑点或(3)ASC斑点单 独的体外培育的上清液(sup)和沉淀(pellet)。在与Aβ1-40或Aβ1-42共培育后0和6h时ASC斑点 水平的密度计量，以百分比给出(n＝4个生物学上独立的样品，均值±SEM)。(c)说明在野生 型(wt)和APP/PS1(tg)脑组织匀浆中使用Aβ-抗体82E1进行检测的Aβ与ASC斑点结合的共免 疫沉淀实验，以及(d)年龄在3、8和12月龄时的量化(n＝4个生物学上独立的动物，均值± SEM，单向ANOVA，Tukey检验，***p<0 .0001)。(e)对通过从8月龄的APP/PS1(tg)和野生型 (wt)小鼠蔗糖梯度离心的小鼠Aβ沉积物的蓬松的纤维和核心区室的点印迹分析。(f)在4月 龄(4m)的APP/PS1小鼠中使用ASC(AL177)和Aβ(6E10)抗体(比例尺＝10μm)对早期Aβ沉积物 30 CN 111556875 A 说　明　书 26/45 页 的共免疫组织化学。(g)检测来自年龄匹配的非痴呆对照(Con)和阿尔茨海默患者(AD)的人 脑组织匀浆中ASC结合的Aβ的免疫沉淀实验和(h)量化(n＝27个生物学商独立的人情况，均 值±SEM，双尾学生t检验，***p<0.0001)。(i)对通过蔗糖梯度离心来自年龄匹配的非痴呆 对照(Con)、患有由于AD造成的轻度认知障碍(MCI)和AD的患者的Aβ沉积物的蓬松纤维和核 心区室的点印迹分析。(j)使用ASC(AL177)和Aβ(6E10)抗体在AD患者的海马中的沉积物的 共免疫组织化学。箭头指示AL177(红色)和6E10(绿色)免疫阳性(比例尺＝10μm)。c、e、g和h 中显示的实验已独立地重复3次。F、h中显示的实验已独立地重复5次。 图3.APP/PS1小鼠中ASC敲除减少的Aβ病理学和空间记忆缺陷。分析APP/PS1/ ASC-/-小鼠和各自的对照的Aβ负载和空间记忆机能障碍。(a)使用抗体6E10对Aβ染色的海马 的代表显微照片(比例尺＝500μm)。(b)总的Aβ免疫染色的面积和Aβ免疫阳性沉积物的数量 (n＝8个生物学上独立的动物，均值±SEM，双尾学生t检验，***p<0.0001)。(c)在莫里斯水 迷宫中评估空间记忆(均值±SEM)。Wt、ASC-/-、APP/PS1和APP/PS1/ASC-/-小鼠到达隐藏平台 所需的时间(延迟(latency))。(d)积分的行进时间(AUC＝曲线下面积)(对于wt，n＝12；对 于ASC-/-，n＝19；对于APP/PS1，n＝14，以及对于APP/PS1/ASC-/-，n＝21，个生物学上独立的 动物的均值±SEM；单向ANOVA，Tukey检验，APP/PS1vs  APP/PS1/ASC-/-：***p＝0.0009，其 他：***p<0.0001)。(e)在第9天进行了空间探测试验，其中去除了平台并记录在象限中花费 的时间。Q1：第1-8天的平台位置。将所有其他象限中花费的时间值取平均值(o.a .)(对于 wt，n＝12；对于ASC-/-，n＝19；对于APP/PS1，n＝14，以及对于APP/PS1/ASC-/-，n＝21个生物 学上独立的动物的均值±SEM；单向ANOVA，Tukey检验，APP/PS1***p＝0.0002，APP/PS1/ ASC-/-*p＝0.0236)。(f)单只小鼠的代表性试验(run)。(g)在3月龄时APP/PS1和APP/PS1/ ASC-/-小鼠接受了双侧海马注射APP/PS1或wt小鼠的裂解物(lys)。在8月龄时分析了脑。注 射的海马的代表性显微照片(比例尺＝500μm)。在APP/PS1小鼠中，但不在APP/PS1/ASC-/-动 物中，与wt脑裂解物相比，APP/PS1脑裂解物注射增加了Aβ病理学(APP/PS1-lys  vs  wt- lys)如对以下所检测(h)总Aβ免疫染色的面积(总面积)或Aβ沉积物数目(n＝8个生物学上 独立的样品，均值±SEM，单向ANOVA，Tukey检验，*p＝0.0252，***p<0.0001)。(i)来自独立 动物组的解剖海马的ELISA分析证实了组织学评估(n＝10个生物学上独立的样品，均值± SEM，单向ANOVA，Tukey检验，***p<0.0001)。(j)淀粉样前体蛋白(APP)和c末端切割片段(α- CTF，β-CTF)的水平保持不变。未注射的APP/PS1或APP/PS1/ASC-/-脑(未注射)以及wt脑作为 对照，(k)密度计量化(n＝8个生物学上独立的样品，均值±SEM，单向ANOVA，Tukey检验，*** p<0.0001)。重组Aβ1-42肽用作阳性对照(Pos.con)。a，g中所示的实验独立地重复两次，j中 所示的实验独立地重复4次。 图4.通过ASC缺乏的APP/PS1脑裂解物或抗ASC抗体共同注射减少的Aβ病理学的扩 散。在3月龄时APP/PS1小鼠接受了源自APP/PS1或APP/PS1/ASC-/-动物的脑裂解物的双侧海 马内注射。通过使用抗体6E10的Aβ免疫染色在8月龄时量化Aβ沉积。(a)注射的海马的代表 性显微照片(比例尺＝500μm)。(b)总Aβ免疫染色的面积和Aβ斑块的数目(n＝5个生物学上 独立的样品，均值±SEM，单向ANOVA，Tukey检验，总面积：*p＝0.0105，***p＝0.0003，Aβ沉 积物的数目：APP/PS1vs  APP/PS1/ASC-/-**p＝0.0011，APP/PS1vs  non-inj.**p＝0.0081)。 (c)针对APP、α和βC末端片段(α-CTF和β-CTF)、总Aβ，对脑裂解物进行免疫印迹，和对(d)脑A β单体和寡聚物(>20kDa)水平进行量化(n＝5个生物学上独立的样品，均值±SEM，单向 31 CN 111556875 A 说　明　书 27/45 页 ANOVA，Tukey检验，单体：*p＝0.0497，**p＝0.0097，寡聚物：APP/PS1vs  APP/PS1/ASC-/-*** p＝0.0001，APP/PS1vs  non-inj.p＝0.0008)。(e)与ASC斑点的Aβ1-40共培育并增加浓度的 抗ASC斑点抗体或同种型特异性IgG(iso-IgG)对照(IgG1/2)的硫黄素-T(ThT)测定。(f) APP/PS1小鼠双侧注射具有抗ASC斑点抗体或iso-IgG的APP/PS1脑裂解物。注射了iso-IgG 或抗ASC斑点抗体的海马的代表性显微照片(比例尺＝500μm)。(h)总Aβ免疫染色的面积和A β斑块的数目(n＝5个生物学上独立的样品，均值±SEM，单向ANOVA，Tukey检验，**p＝ 0.0058，***p<0.0001)。(g)如(c)中所述对脑裂解物进行免疫印迹，并对(i)脑Aβ单体和寡 聚物(>20kDa)水平进行量化(n＝5个生物学上独立的样品，均值±SEM，单向ANOVA，Tukey检 验，单体：APP/PS1 Iso-IgG  vs  APP/PS1 抗-ASC***p＝0.0002，APP/PS1 Iso-IgG  vs  non- inj.***p<0.0001，寡聚物：*p＝0.0418，**p＝0.0053)。a、f中所示的实验进行两次，c、g中 所示的实验独立地重复4次，e中所示的实验独立地重复3次。 图5.小鼠和男人中小胶质细胞ASC斑点形成的表征。源自以下的切片中小胶质细 胞标记CD11b和ASC的免疫组织化学：(a)阿尔茨海默患者(AD)的脑或(b)非痴呆对照(Con)， 省略1st或2nd抗体(比例尺＝15μm)。(c)通过免疫组织化学在源自AD患者脑(AD-in，AD-ex) 和非痴呆、年龄匹配的对照(Con-in，Con-ex)的切片中的小胶质细胞内和外部检测的ASC斑 点的百分比(n＝10个生物学上独立的人情况，均值±SEM，单向ANOVA，Tukey检验，***p< 0.0001)或(d)在以月为单位(m)给出的指示年龄的APP/PS1小鼠的海马的切片中的小胶质 细胞内和外部检测的ASC斑点的百分比(n＝10个生物学上独立的动物，均值±SEM，双尾学 生t检验，***p<0.0001)。(e)观察到与Aβ沉积物结合的ASC斑点数量/视野(n＝5个生物学上 独立的动物，均值±SEM，双尾学生t检验，*p＝0.0216)。(f)源自4、8、12和24月龄时野生型 (WT)和APP/PS1转基因小鼠的脑裂解物中的ASC表达。(g)在存在1st和2nd抗体(左图)或不存 在各自的1st抗体(右图)的情况下，对8月龄的野生型(wt)、ASC-/-、APP/PS1和APP/PS1/ASC-/- 小鼠的海马切片针对小胶质细胞标记CD11b和ASC进行染色(比例尺＝15μm)。(h)在存在1st 和2nd抗体(左图)或不存在各自的2nd抗体(右图)的情况下，对8月龄的野生型(wt)、ASC-/-、 APP/PS1和APP/PS1/ASC-/-小鼠的海马切片针对小胶质细胞标记CD11b和ASC进行染色(比例 尺＝15μm)。a、b、g、h中所示的实验已独立地重复3次，c、d、e中所示的实验已进行一次。f中 描绘的实验已独立地重复两次。 图6.在原代小鼠小胶质细胞和人THP1细胞中的实验ASC斑点形成。(a)使用2和6μm 荧光珠对ASC斑点进行门控，对原代小鼠小胶质细胞的条件培养基进行流式细胞术分析。 (b)暴露于对照溶剂(Con)、单独的LPS或LPS然后尼日菌素(LPS Nig)或ATP(LPS ATP)的原 代鼠小胶质细胞的共焦成像。用抗ASC抗体，然后A488缀合物对细胞进行染色。箭头显示细 胞外ASC斑点(比例尺＝24μm；插图为以正方形显示的区域的4X(底部左侧)和8X(底部右侧) 放大)。(c)用于检测未处理的(-)或LPS-初免的、尼日菌素激活的(10μM)(LPS Nig)表达 ASC-mCerulean的THP-1细胞的无细胞上清液中ASC斑点的门控策略。(d)LPS-初免、尼日菌 素处理的THP-1的共焦成像，在细胞外空间显示绿色荧光ASC斑点(比例尺＝38μm、8μm)。(e) 来自两个独立实验代表(n＝3个技术重复，均值±SD)的无细胞上清液中细胞外斑点的定 量。(f)在不存在TAMRA-Aβ1-42的情况中，THP-1细胞的图像，(g)显示TAMRA-Aβ表面结合和早 期并入，(h)ASC(绿色)的随后上调，(i)细胞中早期ASC斑点形成，其已经并入TAMRA-Aβ1-42 和(j)细胞内形成的ASC斑点。A、b、c和f-j中显示的实验已独立地重复3次，d、e中显示的实 32 CN 111556875 A 说　明　书 28/45 页 验已进行了两次。 [0200] 图7.Aβ-ASC结合的定性和定量描述。(a)实验设计和时间线：3h  LPS和1h尼日菌素 诱导高度炎性形式的程序性细胞死亡(细胞焦亡(pyroptosis))，其导致ASC斑点释放。随后 将含有ASC斑点的上清液与Aβ1-42培育6小时，然后通过流式细胞术进行分析。(b)上图：未刺 激、免疫激活的野生型(wt)和ASC敲除(ASC-/-)巨噬细胞中ASC的免疫沉淀和免疫印迹检测。 ASC单体检测限于免疫激活的ASC感受态wt细胞的上清液，未刺激的wt细胞或ASC-/-巨噬细 胞中不存在。下图：在与上图描述的相同实验条件下，对ASC进行免疫沉淀，然后对Aβ进行免 疫印迹检测。ASC结合的Aβ仅在源自免疫激活的wt巨噬细胞的上清液中检测到，在源自未刺 激的wt或ASC-/-细胞中未检测到。(c)上图：未刺激的、免疫激活的wt和ASC-/-中的ASC的免疫 沉淀和ASC的免疫印迹检测。ASC单体检测限于免疫激活的ASC感受态wt细胞的上清液，未刺 激的wt细胞或ASC-/-巨噬细胞中不存在。下图：在与上图描述的相同实验条件下，对ASC进行 免疫沉淀，然后对Aβ进行免疫印迹检测。ASC结合的Aβ仅在源自免疫激活的wt巨噬细胞的上 清液中检测到，在源自未刺激的wt或ASC-/-细胞中未检测到。(d)门控策略和对照组：对碎片 进行门控以排除剩余的细胞和较大的颗粒。独立象限Q1和Q3中标记有CFP的重组ASC和标记 有TAMRA信号的Aβ1-42。当一起培育时，分子在Q2中积累并发出信号。(n＝3个生物学上独立 的样品，均值±SEM，单向ANOVA，Tukey检验，***p<0.0001)。(e)实验组：表达ASC-mCerulean 的永生化巨噬细胞显示出相似的结果。ASC-/-巨噬细胞显示无ASC斑点形成和无Aβ1-42积累 ASC-/-(n＝3个生物学上独立的样品，均值±SEM，单向ANOVA，Tukey检验，activ. Aβ1-42vs  Con***p＝0.0002，activ. Aβ1-42vs  Con Aβ1-42***p＝0.0009，activ. Aβ1-42vs  activ.***p ＝0.0002)。(f)小胶质细胞免疫刺激后ASC-TAMRA标记的Aβ1-40的流式细胞术定量。实验设 计和时间线：3h  LPS和1h  ATP引起高度炎性形式的程序性细胞死亡(细胞焦亡)，从而释放 ASC斑点。随后将含有ASC斑点的上清液与Aβ1-40培育3h，然后通过FACS分析。b中描绘的实验 已独立地重复3次。 [0201] 图8.生成高纯ASC斑点的基于免疫沉淀和酶切割的方法。(a)通过免疫沉淀和酶切 割在炎性体组装和纯化ASC斑点后ASC斑点形成的示意图。用含有带有Flag标签的ASC- mCerulean以及ASC和mCerulean之间的烟草蚀刻病毒蛋白酶(TEV)的精确位点的构建体转 导永生化的ASC缺陷型巨噬细胞。这些细胞中的炎性体激活导致ASC团聚和形成ASC斑点。可 以对含有mCerulean和Flag标签的ASC斑点进行免疫纯化，然后通过TEV蛋白酶对 mCerulean-Flag标签进行蛋白水解切割以生成纯的ASC斑点。(b)使用抗-GFP抗体免疫沉淀 随后TEV蛋白酶的酶切割(–)之前或之后对分离自ASC-mCerulean-Flag巨噬细胞的ASC斑点 进行免疫印迹分析。(c)对未处理的vs  IP TEV处理的ASC斑点中的ASC和GFP进行免疫染色 后的共焦成像(比例尺＝3 .8μm(顶行)、6 .3μm(中间行)、9μm(底行))。(d)分离自ASC- mCerulean-Flag巨噬细胞的抗-ASC-Alexa  Fluor  488和anti-GFP-Alexa  Fluor  647双染 色的ASC斑点的流式细胞术分析。与Alexa  Fluor  488或647缀合的抗小鼠IgG用作对照(底 图)。b-d中描绘的实验已独立地重复四次。 [0202] 图9.ASC斑点增加了Aβ肽以时间和浓度依赖性方式团聚的倾向。(a)ASC斑点和A β1-40共培育的硫黄素-T荧光测定法显示ASC斑点以时间依赖性方式的交叉播种潜能。(b)时 间依赖性ASC斑点诱导的Aβ1-40团聚的蛋白质印迹检测。将Aβ1-40与ASC斑点共培育增加了团 聚体的倾向并增加高分子量Aβ寡聚物和初原纤维的形成。(c)在指定的时间点量化(n＝4个 33 CN 111556875 A 说　明　书 29/45 页 生物学上独立的样品，均值±SEM，双尾学生t检验，6h：***p＝0 .0002，4和24h***p< 0.0001)，(d)在0和24h时与增加浓度的ASC斑点(0.0-1.75μM)共培育的Aβ1-42的蛋白质印迹 分析。(e)在0和24hr时与增加浓度的ASC斑点(0.0-1.75μM)共培育的Aβ1-40的蛋白质印迹分 析。对于两种Aβ肽，与ASC斑点的共培育增加团聚体的倾向并增加高分子寡聚物的形成。注 意，对于Aβ1-42，寡聚物形成的增加与Aβ单体和二聚体水平的减少并行。(f)96h培育后，A β1-42、ASC和ASC-Aβ1-42团聚的电子显微照片(比例尺＝200nm)。(g)通过浊度测定确认ASC斑 点增强的Aβ1-40和Aβ1-42团聚(n＝3个生物学上独立的样品，均值±SEM)。(h)ASC斑点和Aβ42-1 共培育的硫黄素-T荧光测定显示了没有ASC斑点对反向肽的交叉播种潜能。(i)与ASC斑点 和两种不同浓度牛血清白蛋白共培育的Aβ1-40的硫黄素-T荧光测定。尽管ASC斑点以时间依 赖性方式交叉播种Aβ1-40，但0.22μM和0.66μM  BSA都不会影响Aβ1-40团聚。A、b、d和e中描绘的 实验独立地重复四次，f、h、i中所示的实验独立地重复三次。 [0203] Franklin等人的出版物(Nature  Immunology,2014,15(8):727-737)描述了传播 炎症的ASC和其细胞外和朊蛋白(prionoid)活性。其中，作者描述了ASC抗体调理 (opsonize)ASC斑点并由此增加炎症。然而，由此导致的炎症对阿尔兹海默症的病因是次要 的。相反，本发现对阿尔兹海默症的病因是关键的，如由Aβ团聚触发的炎性事件。图9的体内 试验显示了这类Aβ团聚由ASC斑点触发。 [0204] 图10.ASC  PYD结构域对于Aβ交叉播种至关重要。(a)使用抗体82E1探测Aβ的免疫 印迹，揭示了Aβ1-40的时间依赖性团聚。Aβ1-40与重组ASC斑点(recASC)的共培育促进团聚并 增加高分子量Aβ寡聚物的形成。值得注意的是，观察到中间Aβ寡聚物的形成(从28-62kDa 带)，并且随着培育时间的增加而增加。(b)ASC的免疫印迹揭示了时间依赖性自团聚。(c)使 用抗体82E1探测Aβ的免疫印迹，揭示了Aβ1-42的时间依赖性团聚。Aβ1-42与重组ASC斑点 (recASC)的共培育促进团聚并增加高分子量Aβ寡聚物的形成。值得注意的是，观察到中间A β寡聚物的形成(从28-62kDa带)，并且随着培育时间的增加而增加。(d)探测ASC的免疫印 迹，揭示了时间依赖性自团聚。(e)通过在ASC-PYD结构域的残基K21A、K22A和K26A处引入点 突变来生成重组突变体ASC。纯化的重组突变体ASC斑点用于Aβ团聚测定。使用抗体82E1探 测Aβ的免疫印迹，揭示了Aβ的时间依赖性团聚。重组突变体ASC斑点(recASC；K21A、K22A和 K26A)的共培育未能提高高分子量Aβ寡聚物水平。在补充了重组突变体ASC斑点的Aβ中没有 观察到中间Aβ寡聚物(从28-62kDa带)。(f)染色ASC的免疫印迹揭示了重组突变体ASC斑点 没有自团聚。(g)通过在ASC-CARD结构域的D134R和Y187E残基处引入点突变生成的纯化的 重组突变体ASC用于Aβ团聚测定。使用抗体82E1探测Aβ的免疫印迹，揭示了Aβ1-40的时间依 赖性团聚。加入重组突变体ASC(recASC；D134R和Y187E)斑点，在Aβ样品中培育2小时后，高 分子量Aβ寡聚物水平升高是明显的。Aβ寡聚物的水平随培育时间而增加。中间Aβ寡聚物(从 28-62kDa带)的形成也很明显，并且随着培育时间而增加。(h)ASC染色的免疫印迹揭示了重 组ASC-CARD突变体ASC(D134R和Y187E)斑点的自团聚。(i)在指定的时间点的量化(n＝3个 生物学上独立的样品，均值±SEM，双尾学生t检验，2h：**p＝0.0012，4h：**p＝0.0052， 6h：**p＝0.0032，12h：**p＝0.0033，48h：***p＝0.0003，24和72h：***p<0.0001)。(j)在指 定的时间点的量化(n＝3个生物学上独立的样品，均值±SEM，双尾学生t检验，2h：*p＝ 0.0212，4h：**p＝0.0012，6h：*p＝0.0240，12h：**p＝0.0018，24h：**p＝0.0069，48h**p＝ 0.0031，72h：***p＝0.0002)。(k)带状图显示了ASC的PYD和CARD结构域中各自突变的位置。 34 CN 111556875 A 说　明　书 30/45 页 a-h中描绘的实验已独立地重复3次。 [0205] 图11.硫黄素荧光扫描和Aβ肽和ASC斑点的伴随共沉降试验。以446nm激发，460和 605nm之间的λ下监测的，培育后0h和6h时，Aβ1-40(Aβ1-40单独或与ASC组合(Aβ1-40 ASC))的 (a)上清液和(b)沉淀部分的硫黄素t(ThT)荧光光谱(均值±SEM)。激发和发射狭缝设置为 10nm。(c)最大发射值(485nm)的定量和统计分析(n＝3个生物学上独立的样品，±SEM，双尾 学生t检验，**p＝0.0011，p＝***0.0003)。在于上述相同条件下获得的，培育后0h和6h时，A β1-42(Aβ1-42单独或与ASC组合(Aβ1-42 ASC))的(d)上清液和(e)沉淀部分的ThT荧光光谱。(f) λ最大值(485nm)的定量和统计分析(n＝3个生物学上独立的样品，±SEM，双尾学生t检 验，**p＝0.0023，***p<0.0001)。(g)Aβ1-40或(h)Aβ1-42在ASC斑点与抗-Aβ抗体(82E1)存在或 不在的情况下(1＝Aβ单独，2＝Aβ ASC，3＝ASC)。g和h中描绘的实验独立地重复3次。 [0206] 图12.在APP/PS1小鼠和AD患者的Aβ沉积物的中心发现ASC免疫阳性。(a)仅使用用 于ASC检测的二抗探测图3中分析的来自小鼠纤维或核心制品的相同样品。(b)仅使用用于 ASC检测的二抗探测图2中分析的来自人类纤维或核心制品的相同样品。(c)重组ASC和合成 Aβ 顺序稀释并使用ASC(AL177)或Aβ(6E10)抗体进行免疫探测。进一步方法阅读32xx311-42 (d) 在具有和不具有1st和2nd抗体的情况下，对源自APP/PS1小鼠的切片中的Aβ(6E10)和ASC (AL177)进行免疫染色(比例尺＝15μm)。(e)对来自ASC-/-动物的对照切片的Aβ或ASC进行染 色(比例尺＝20μm)。对来自非痴呆对照和AD患者(AD)的脑样品中的(f)ASC进行免疫沉淀随 后免疫印迹检测，或(g)Aβ进行免疫印迹检测。进一步对照显示了，Aβ1-42、ASC和Aβ1-42 ASC的 体外共培育的相同检测。(h)对源自AD脑(AD)和年龄匹配的非痴呆对照(Con)的切片中的Aβ (绿色)和ASC(红色)进行免疫染色，并且省略作为阴性对照的两种1st抗体(比例尺＝15μm)。 免疫沉淀实验显示：(i)对来自遭受血管痴呆(VD)、额颞痴呆(FTD)、皮质基底变性(CBD)和 阿尔兹海默症(AD)的患者的脑样品中的ASC进行免疫沉淀，随后对ASC进行蛋白质印迹检 测。(j)在相同的脑样品中对ASC进行免疫沉淀，随后对Aβ进行蛋白质印迹检测。仅在AD患者 中检测到ASC-结合的Aβ。a-c和f、g、i中描绘的实验已独立地重复3次。D、e、h中描绘的实验 已独立地重复五次。 [0207] 图13.8和12月龄时APP/PS1/ASC-/-小鼠中Aβ水平和空间导航记忆。(a)对来自8月 龄的APP/PS1和APP/PS1/ASC-/-小鼠的SDS和FA部分进行Aβ1-38、Aβ1-40和Aβ1-42的ELISA量化(n ＝5个生物学上独立的动物，±SEM；双尾学生t检验，SDS：Aβ1-38**p＝0.0016，Aβ1-40**p＝ 0 .0025，Aβ1-42***p＝0 .0008，FA：Aβ1-38**p＝0 .0021，Aβ1-40**p＝0 .0040，Aβ1-42*p＝ 0.0106)。(b)在莫里斯水迷宫中评估空间记忆。Wt、ASC-/-、APP/PS1和APP/PS1/ASC-/-小鼠行 进至平台的距离(均值±SEM)。通过积分行进距离进行量化(曲线下面积)(对于wt，n＝12 个；对于ASC-/-，n＝19个；对于APP/PS1，n＝14；和对于APP/PS1/ASC-/-，n＝21个，生物学上独 立的动物，均值±SEM；单向ANOVA，Tukey检验，APP/PS1vs  APP/PS1/ASC-/-***p＝0.0005，其 他：***p<0.0001)。(c)对来自12月龄的APP/PS1和APP/PS1/ASC-/-小鼠的SDS和FA部分进行A β1-38、Aβ1-40和Aβ1-42的ELISA量化(n＝5个生物学上独立的动物，均值±SEM；双尾学生t检验， SDS：Aβ1-38***p<0.0001，Aβ1-40**p＝0.0015，Aβ1-42***p＝0.0002，FA：Aβ1-38***p＝0.0009，A β1-40**p＝0.0084，Aβ1-42**p＝0.0010)。(d)来自12月龄的wt、ASC-/-、APP/PS1和APP/PS1/ ASC-/-动物的海马切片(比例尺＝500μm)和总面积以及Aβ沉积物数目的量化(n＝6个生物学 上独立的动物，均值±SEM，双尾学生t检验，***p<0.0001)。通过莫里斯水迷宫测试评估空 35 CN 111556875 A 说　明　书 31/45 页 间记忆。(e)野生型(wt)、ASC-/-、APP/PS1、和APP/PS1/ASC-/-小鼠(均值±SEM)到达平台所需 的时间(延迟)和积分的行进时间(AUC＝曲线下面积)(对于wt，n＝11个；对于ASC-/-，n＝11 个；对于APP/PS1，n＝17个；和对于APP/PS1/ASC-/-，n＝15个，生物学上独立的动物，均值± SEM；单向ANOVA，Tukey检验，wt  vs  APP/PS1***p<0.0001，ASC-/-vs  APP/PS1***p＝0.0003， APP/PS1vs  APP/PS1/ASC-/-**p＝0.0022)。(f)wt、ASC-/-、APP/PS1和APP/PS1/ASC-/-小鼠行 进至平台的距离(到平台的距离)(均值±SEM)和积分的行进距离(对于wt，n＝11个；对于 ASC-/-，n＝11个；对于APP/PS1，n＝17个；和对于APP/PS1/ASC-/-，n＝15个，生物学上独立的 动物，均值±SEM；单向ANOVA，Tukey检验，APP/PS1vs  APP/PS1/ASC-/-***p＝0.0004，其 他：***p<0.0001)。在第9天，在最后一次训练后24h，进行空间探测试验，其中平台被移除， 并记录了动物在象限中花费的时间。(g)Q1：第1-8天平台位置。将所有其他象限中花费的时 间的值取平均值(o.a.)(对于wt，n＝12个；对于ASC-/-，n＝19个；对于APP/PS1，n＝14个；和 对于APP/PS1/ASC-/-，n＝21个，生物学上独立的动物，均值±SEM；单向ANOVA，Tukey检验， ASC-/-*p＝0.0329)。(h)描绘了单个小鼠的代表性试验。d中显示的实验独立地重复两次。 [0208] 图14.APP/PS1小鼠中ASC对皮层Aβ水平的年龄依赖性调节及胱天蛋白酶-1切割、 NEP和IDE分析。(a)使用抗体6E10对3、8和12月龄的wt、ASC-/-、APP/PS1和APP/PS1/ASC-/-动 物的皮质切片的免疫组织化学。(b)以8月龄(n＝3个生物学上独立的动物，均值±SEM，双尾 学生t检验，Aβ沉积物的数目***p＝0.0009，总面积***p<0.0001)和12月龄(n＝6个生物学 上独立的动物，均值±SEM，双尾学生t检验，Aβ沉积物的数目***p＝0.0003，总面积***p＝ 0.0002)的APP/PS1和APP/PS1/ASC-/-小鼠的各自皮质切片的总Aβ覆盖面积(总面积)和Aβ沉 积物的数目给出Aβ沉积的定量。(c-f)进行各自实验方案的动物中胱天蛋白酶-1、脑啡肽酶 和胰岛素降解酶水平的实验I-IV分析(还参见延伸数据图11b、c：EXPI)。β-肌动蛋白水平的 检测用作负荷对照。阳性对照代表wt小鼠脑裂解物，其掺有胱天蛋白酶-1、NEP和IDE。(R＝ 右半球裂解物，L＝左半球裂解物)。给出注射动物的遗传背景(EXPI：APP/PS1小鼠；EXPII： APP/PS1，APP/PS1/ASC-/-小鼠；EXPIII：APP/PS1小鼠；EXP  IV：APP/PS1小鼠)和各自的对照 以及注射的材料/脑裂解物。a中显示的实验独立地重复两次。c-f中显示的实验独立地重复 3次。 [0209] 图15.8月龄的APP/PS1和APP/PS1/ASC-/-小鼠的小胶质细胞Aβ吞噬作用及Aβ体内 播种实验的实验示意图(a)小鼠经腹膜内(i.p)注射甲氧基-XO4(MxO4)并在8月龄时分离小 胶质细胞后的小胶质细胞淀粉样含量分析的代表性散点图，对淀粉样含量的量化揭示了各 组之间没有差异(对于APP/PS1，n＝11个；对于APP/PS1/ASC-/-，n＝10个，生物学上独立的动 物，均值±SEM，双尾学生t检验)。(b)体内实验EXP  I-IV的设计显示了宿主小鼠和注射材料 的遗传背景。(c)实验I的时间安排。(d)实验II-IV的时间安排。(e)生成脑裂解物，如 Fritschi  et  al.Acta  Neuropathol.2014Oct；128(4):477-84以及还有Meyer-Luehmannet  al.Science.2006Sep  22；313(5794):1781-4所描述。由小鼠前脑制备注射材料的方案。使 用抗体82E1和抗肌动蛋白抗体通过免疫印迹分析APP/PS1和APP/PS1//ASC-/-小鼠的脑组织 匀浆的等分试样的Aβ含量，以对蛋白质负载量标准化。(f)双海马注射部位和分析彼此具有 120μm等距离的切片。A、e中所示的实验独立地重复两次。 [0210] 图16.ASC斑点引起APP/PS1小鼠中Aβ病理学的头尾(rostro-caudal)扩散，而不会 影响小胶质细胞的吞噬作用。(a)注射海马的代表性显微照片(比例尺＝500μm)，和(b)Aβ免 36 CN 111556875 A 说　明　书 32/45 页 疫染色面积(总面积)和Aβ免疫阳性沉积物的数目(n＝8个生物学上独立的样品，(APP/PS1 小鼠Con-(Con.sol.)，ASC斑点注射的(ASC斑点))，n＝4个生物学上独立的样品(未注射的 (non-inj .)APP/PS1小鼠)，均值±SEM，单向ANOVA，Tukey检验，总面积ASC斑点vs  con .sol***p<0 .0001，ASC斑点vs  non .-inj.***p＝0.0006，Aβ沉积物的数目ASC斑点vs  con.sol***p＝0.0003，ASC斑点vs  non.-inj.***p<0.0001)。(c)来自注射的半球的APP、α 和βc-末端片段(α-CTF,β-CTF)以及Aβ的免疫印迹。来自未注射的(non-inj.)6月龄APP/PS1 动物或wt小鼠的脑裂解物作为对照。(d)Aβ单体的量化(n＝5个生物学上独立的样品，均值 ±SEM，单向ANOVA，Tukey检验，ASC斑点vs  con.sol***p<0.0001，ASC斑点vs  non.-inj.*** p＝0.0005)。确定Aβ病理学的头尾ASC斑点诱导的扩散。(e-h)每个切片显示的Aβ阳性( )沉 积物的数量：(e)Exp-I(c,f)Exp-II(g)Exp-III和(h)Exp-IV(EXP-1:n＝7个生物学上独立 的样品，EXP-II:n＝3个生物学上独立的样品，EXP-III:n＝3个生物学上独立的样品，EXP- IV:n＝5个生物学上独立的样品，均值±SEM，单尾学生t检验，(水平从-4至 4)EXP-I:-2**p ＝0.0028，1*p＝0.0194，2**p＝0.061，4***p＝0.0007，EXP-II:-3*p＝0.0175，-2*p＝ 0 .0216，1**p＝0 .0090，2*p＝0 .0312，EXP-III:-4*p＝0 .0181，-2*p＝0 .0194，2*p＝ 0.0195，3**p＝0.0072，EXP-IV:-4***p＝0.0008，-3*p＝0.0037，-2*p＝0.0414，-1*p＝ 0.0144，1***p<0.0001，2**p＝0.0088，3**p＝0.0012)。(i)腹膜内(i.p)注射甲氧基-XO4 (MxO4)并在注射后一个月分离小胶质细胞后分析动物小胶质细胞淀粉样含量的代表性散 点图。在未对Cd11b/CD45进行免疫染色的情况下(上图)和i.p.施用甲氧基-XO4后(下图)的 小胶质细胞群体的野生型小鼠(wt)分离。APP/PS1小鼠接受海马内注射——对照溶剂(上 图)和ASC斑点(下图)，对CD11b/CD45/甲氧基-XO4进行免疫染色。吞噬作用的量化显示各组 之间无差异(n＝3个生物学上独立的动物，均值±SEM，双尾学生t检验)。a中显示的实验已 独立地重复两次，c中显示的实验五次。I中所示的实验已执行过一次。 [0211] 图17 .IDE缺乏和吞噬作用调制体内播种实验。腹膜内(i .p)注射甲氧基-XO4 (MxO4)后并在注射后一个月分离小胶质细胞后分析动物的小胶质细胞淀粉样含量的代表 性散点图。(a)i.p.施用MxO4之前和之后(下图)来自野生型小鼠(wt)的小胶质细胞群体(上 图)的分析。APP/PS1或APP/PS1/ASC-/-小鼠(宿主动物：红色)注射APP/PS1或WT小鼠脑组织 匀浆(注射材料：绿色)。(b)淀粉样含量的量化揭示各组之间没有差异(n＝3个生物学上独 立的样品，均值±SEM，单向ANOVA，Tukey检验)。(c)使用FRET底物(5-FAM/QXL520)，从源自 EXPI-IV的小鼠脑组织匀浆中分析酶促IDE活性，并以每mg脑组织的相对荧光单位(RFU)表 示。(EXP-I:n＝7个生物学上独立的样品(APP/PS1小鼠Con-(Con.sol.)，ASC斑点-注射的 (ASC斑点))，n＝4生物学上独立的样品(未注射的(non-inj.)APP/PS1小鼠)，EXP-II:n＝4 个生物学上独立的样品，EXP-III:n＝3个生物学上独立的样品，EXP-IV:n＝6个生物学上独 立的样品，均值±SEM，单向ANOVA，Tukey检验)。a中所示的实验进行一次。 [0212] 图18.在施用增加体积的ASC斑点后的细胞生存力研究。图18A描绘了来自生存力 分析(图18B)的实验结果(对照vs增加体积的ASC斑点)，可见，存在存活神经元的浓度依赖 性降低。因此得出结论，在暴露至ASC斑点后，初级神经元经历细胞消亡。通过使用抗ASC斑 点抗体治疗方法，因此当能够团聚Aβ的ASC斑点的量减少时，增强了神经元保护作用。因此 通过抗-ASC斑点抗体减少了细胞生存力的损失。 37 CN 111556875 A 说　明　书 33/45 页 实施例 [0213] 在下文中，呈现了示出本发明的各种实施方式和方面的特定示例。但是，本发明的 范围不应受到本文所述的
技术实现要素：
的限制。给出以下制备和实施例以使本领域技术人 员能够更清楚地理解和实践本发明。然而，本发明的范围不受示例性实施方式的限制，这些 示例性实施方式仅意图作为本发明的单个方面的说明，并且功能上等效的方法在本发明的 范围内。实际上，根据本文的前述描述、附图和以下实施例，除本文所述的那些之外，本发明 的各种修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见。所有这些修改都落入所附权利要求 的范围内。 [0214] 材料和方法 [0215] 试剂：超纯LPS(E.coli  0111:B4)来自Invivogen(San  Diego,CA,U.S.A.)；尼日菌 素来自Invitrogen(Carlsbad ,CA,U.S.A.)和ATP来自Sigma-Aldrich(Munich,Germany)。 ASC抗体来自BioLegend(San  Diego ,CA ,U .S .A .,mAb ,653902，克隆TMS-1 ,1:500)和 AdipoGen(ASC ,AL177 ,AG-25B-0006-C100 ,Liestal ,Switzerland)。纯化的小鼠IgG1 (Invitrogen,02-6100)和正常兔IgG(Santa  Cruz  Biotechnology,sc-2027,Heidelberg, Germany)分别用作BioLegend  ASC抗体和AdipoGen  ASC抗体的同种型对照抗体。 [0216] 动物：APP/PS1转基因动物(The  Jackson  Laboratory,Bar  Harbor,ME,U.S.A.,株 系#005864)，和ASC-/-动物(Millennium  Pharmaceuticals,Cambridge,MA,U.S.A.)两者都 在C57Bl/6遗传背景。在标准条件下将小鼠圈养在22℃和12h的明暗循环中，自由进食和饮 水。根据赫尔辛基宣言并得到当地伦理委员会批准，对动物进行了护理和处理(LANUV  NRW# 84-02.04.2017.A226)。该分析中仅包括雌性动物。分析了以下动物组的组织：WT、ASC-/-、 APP/PS1、APP/PS1/ASC-/-。来自8月龄的APP/PS1和APP/PS1/ASC-/-小鼠的组织作为EXP-II、 III和IV的未注射对照(扩展数据图11b)。所有动物实验都是由对动物基因型不了解的研究 人员进行的。在体内研究的情况中，功效分析用于确定样本大小。在后者中，将动物随机分 配到实验行为中。 [0217] 人组织样品：来自组织学确认的AD、血管痴呆(VD)、额颞痴呆(FTD)和皮质基底变 性(CBD)病例以及年龄匹配的死于非神经系统疾病的对照的验尸脑材料均来自 Neurological  Tissue  Bank  of  the  Biobank  of  the  Hospital  Clínic-IDIBAPS。所有患 者均签署了知情同意书，并同意将其脑材料用于医学研究。对照和AD病例之间的年龄和验 尸时间相似。验尸时间从3.5-5小时不等。移植后，立即将脑标本速冻并保存在-80℃下直至 进一步使用。患者和对照年龄为75±6岁。 [0218] 小鼠和男人中免疫组织化学(ASC/CD11b/Aβ)：将自由浮动的40-μm厚的连续切片 在振动切片机(Leica ,Wetzlar,Germany)上切割。获得的切片保存在0.1％NaN3、PBS中。对 于免疫组织化学，用50％甲醇处理切片15分钟，然后在PBS中洗涤3次，进行5分钟并在3％ BSA、0.1％Triton  X-100、PBS(封闭缓冲液)中封闭30min，然后在封闭缓冲液中用初级抗体 培育过夜。在0.1％Triton  X-100、PBS中洗涤切片3次并用Alexa  488或Alexa  594抗体缀合 物(1:500，Invitrogen,Eugene,OR,USA)培育90min，用0.1％Triton  X-100、PBS洗涤3次进 行5min。使用Immu-Mount(9990402,Thermo  Scientific,Cheshire,UK)固定切片。以各自的 浓度使用以下初级抗体：大鼠抗小鼠CD11b(1:200,MCA711 ,Serotec,Oxford ,UK)，兔抗小 ASC(1:200,AL177,AG-25B-0006-C100,AdipoGen,Liestal,Switzerland)和Aβ抗人(1:400, 38 CN 111556875 A 说　明　书 34/45 页 6E10,SIG-39320,Covance,Münster,Germany)。 [0219] 细胞内和细胞外ASC斑点的量化：对于人对象，分析10个对照和10个AD病例。从每 位患者中，评估了彼此具有确定距离的6个海马脑切片。在40倍放大下，在每切片随机选择 的10个视野中，对细胞内和细胞外ASC斑点进行计数。同样，在2、4和8月龄对WT和APP/PS1小 鼠的海马切片进行了分析。细胞内或细胞外ASC斑点的比例以每小胶质细胞的细胞内或细 胞外ASC斑点或所检测的所有ASC斑点的百分比给出。 [0220] 细胞培养：如前所详细描述的，制备原代小胶质细胞培养物26。简言之，由新生wt小 鼠制备混合的胶质细胞培养物并在DMEM(31966,ThermoFisher,Darmstadt,Germany)中培 养，DMEM补充10％FCS(10270,ThermoFisher,Darmstadt,Germany)和100U/ml青霉素/链霉 素(15070,ThermoFisher,Darmstadt,Germany)。在14天初代培养后使用小胶质细胞细胞。 通过摇动收集它们，并重新平板接种并使其附着在基底上30-60分钟。为了评估ASC斑点的 释放，未刺激的或LPS-初免的小胶质细胞保持不处理，或用尼日菌素(10μM)或ATP(5mM)进 行激活。固定细胞，洗涤并用抗-ASC(1:100BioLegend，克隆HASC-71)或纯化的IgG1(02- 6100,ThermoFisher,Darmstadt,Germany)染色，然后用山羊抗-小鼠-Alexa  Fluor  488(A- 11017,ThermoFisher,Darmstadt,Germany)染色。已经描述了用表达mCerulean-ASC的构建 体稳定转导的单核细胞系THP-116。在补充有10％FBS和青霉素/链霉素的RPMI  1640中培养 细胞。对于刺激试验，用100nM的佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA ,Sigma-Aldrich , Munich,Germany)处理细胞过夜，用1μg/ml的LPS进行初免3h并进一步用10μM的尼日菌素激 活90min。通过常规测试已排除支原体污染。 [0221] ASC斑点释放的FACS分析：在使用0.7-0 .9μm(Spherotech ,Lake  Forest ,IL , U.S.A.)或6.0μm(BD  Biosciences,Heidelberg,Germany)的微米级珠对碎片大小的事件进 行门控，作为它们在FSC  vs.SSC散射仪上分布的参考之后，在MACSQuant分析仪(Miltenyi  Biotec,Bergisch  Gladbach,Germany)上进行小胶质细胞的无细胞上清液中ASC斑点的量 化。用抗ASC(克隆TMS-1 ,1:500 ,BioLegend ,San  Diego ,CA ,U .S .A .)或等效量的直接与 Alexa  Fluor  488染料缀合的纯化的IgG1同种型(02-6100 ,ThermoFisher ,Darmstadt , Germany)染色无细胞上清液。碎片大小的A488 事件被计数为ASC斑点。用FlowJo  X  10.0.7 (Ashland,OR,U.S.A.)分析数据。 [0222] 共焦激光扫描显微镜：在Leica  TCS  SP5SMD共焦系统(Leica  Microsystems , Wetzlar ,Germany)中对小胶质细胞或THP-1细胞进行成像。使用63倍物镜——数值孔径 1.2，获取图像，并使用Volocity  6.01软件(PerkinElmer,Waltham,MA,USA)进行分析。 [0223] ASC斑点与Aβ的缔合：为了对ASC斑点与Aβ1-42的体外缔合成像，在存在可溶性 TAMRA–Aβ(PSL ,Heidelberg ,Germany)的情况下，用尼日菌素(10μM)激活PMA处理的 (100nM)、LPS-初免的(1μg/mL)的表达ASC-mCerulean的THP-1，持续90min。使用环境控制室 (Life  Imaging  Services  and  Solent  Scientific)在37℃、5％CO2的条件下对细胞成像。 使用63倍物镜——数值孔径1 .2，获取图像，并使用LAS  AF版本2 .2 .1 (L e i ca  Microsystems)或Volocity  6.01软件进行分析。 [0224] ASC斑点的生成和分离。ASC斑点的生成和分离基本上如先前所述16,27,28。炎性体报 告巨噬细胞在15cm的培养皿中培养，直至达到80％汇合。用细胞刮刀在5ml  PBS中收获细 胞，并通过离心沉淀(400x  g/5min)。为了除去残留的培养基，将它们重悬于1ml  PBS中，并 39 CN 111556875 A 说　明　书 35/45 页 转移至1.5ml  Eppendorf管中，并在4℃下再次以1500rpm/5min离心。去除上清液，将沉淀置 于-80℃下至少15分钟以破坏细胞质膜稳定。之后，将细胞重悬于2X体积的CHAPS缓冲液中， 并使用带有20G针头的2ml注射器裂解细胞。为了去除细胞碎片，将样品离心(14,000rpm/ 8min/4℃)，并将上清液转移至无菌的1ml聚碳酸酯超速离心管(Beckmann)中，并在Beckman  Optima  TLX台式超速离心机中以100,000g离心30分钟以获得S100上清液。将这些上清液转 移至0.5ml  PVDF  0.22μm过滤管中，并通过离心(14000rpm/5min/4℃)过滤。将流通液(flow  through)在37℃下培育60-90min，以诱导ASC斑点的组装。ASC斑点在4℃下用TEV处理1h，并 在PBS中洗涤两次，然后用于实验(扩展数据图4)。 [0225] 由大肠杆菌制备重组ASC：将编码全长人ASC的cDNA，然后是TEV蛋白酶切割位点， 和mCherry克隆到提供C末端六组氨酸标签的pET-23a表达载体中(pET23a-ASC-Tev- mCherry-His)。将质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中。转化的大肠杆菌细胞在37℃下生 长，并通过1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷在OD600为0.8下诱导表达4小时。通过离心 收集细胞，并在含有20mM  Tris(pH  8.0)、500mM  NaCl、5mM咪唑的缓冲液(缓冲液A)中进行 超声处理。将细胞裂解物在4℃下以20,000rpm离心30分钟。将细胞沉淀重悬于补充有2M盐 酸胍的缓冲液A中并离心，并在4℃下针对缓冲液A对上清液进行透析(透析袋，纤维素，型号 36132，MWCO  14,000道尔顿；Carl  Roth,Karlsruhe,Germany)。再次离心样品，并使用 Prime  FPLC系统(GE  Healthcare)将上清液施用至预平衡的HisTrap柱上。用10个柱体积的 20mM  Tris(pH  8.0)、500mM  NaCl、20mM咪唑洗涤该柱，然后在含有200mM咪唑的相同缓冲液 中洗脱蛋白质。将纯化的蛋白质针对含有20mM  Tris(pH  8.0)、300mM  NaCl的缓冲液进行透 析。为了诱导ASC-mCherry嵌合蛋白的原纤维化，将溶液在4℃下以100,000g离心1小时，随 后在37℃下培育1小时。将样品保持在冰上，并立即进行进一步分析，避免冷冻/融化循环。 除野生型ASC蛋白外，还生成了五个突变体。这些突变体被设计为仅在PYD或CARD中或在两 个结构域中均破坏均聚寡聚界面。基于结构域原纤维化的结构分析鉴定突变体位点1 ,2。 PYD-PYD组装界面的K到E突变(K21E、K22E、K26E)，同一界面的K到A突变(K21A、K22A、K26A)， 推定的CARD组装界面的D到R和Y到E突变(D134R ,Y187E)，和两个组合K到E/D到R/Y到E (K21E、K22E、K26E、D134R、Y187E)以及K到A/D到R/Y到E(K21E、K22E、K26E、D134R、Y187E)。通 过序列分析确认所有蛋白质表达构建体。蛋白质表达、纯化和制备以及用于原纤维化的方 案与野生型蛋白质相同。 [0226] 来自免疫刺激的小鼠小胶质细胞和巨噬细胞的上清液中的Aβ和ASC斑点的FACS分 析。用200ng/ml的LPS在100μl完全培养基中初免初级小鼠小胶质细胞和永生化的ASC- mCerulean和巨噬细胞——有或没有ASC缺陷。随后，通过添加5mM的ATP激活NLRP3炎性体60 分钟。移出上清液，并与TAMRA标记的Aβ在37℃下培育6小时，随后在4℃下用Alexa  Fluor  647抗ASC(ThermoFisher,Darmstadt,Germany)染色过夜。之后，使用MACSQuant(Miltenyi  Biotec)进行FACS分析。 [0227] Aβ寡聚物形成的免疫印迹：合成的Aβ1 - 4 2采购自Pe ptid e  S pe c ia l ty  Laboratories(PSL,Heidelberg,Germany)。将冻干的肽溶解在10mM  NaOH中至1mg/ml的终 浓度(221μM)，在水浴中超声处理5分钟，并保存在-80℃。在50mM  Sorenson磷酸盐缓冲液 (pH  7.0)中将Aβ1-42稀释至100μM。在37℃下用或不用ASC斑点(0.53μM)培育Aβ1-42持续24h。 在0、1、2、4、6和24h时收集样品。通过电泳在4-12％NuPAGE上分离样品，并将其转移到硝酸 40 CN 111556875 A 说　明　书 36/45 页 纤维素膜上。将膜用5％的PBS中牛奶，0.05％的Tween  20(封闭溶液)封闭，并在封闭溶液中 在4℃下与6E10抗体(SIG-39320,Covance,Münster,Germany)培育过夜。膜与抗体缀合物一 起培育，并使用Odyssey  Clx成像系统(Li-COR,Bad  Homburg,Germany)检测免疫反应性。 [0228] 鼠脑裂解物的免疫印迹。使用MES或MOPS缓冲液通过4-12％NuPAGE(Invitrogen, Karlsruhe,Germany)分离样品，并将其转移到硝酸纤维素膜上。对于胱天蛋白酶-1印迹，通 过沉淀野生型永生化鼠巨噬细胞的上清液生成阳性对照，其先用200ng/ml  LPS处理3h，再 用10μM尼日菌素处理1小时。使用抗体6E10(Covance,Münster,Germany)和c-末端APP抗体 14029(CT15)检测APP和Aβ。IDE使用抗体PC730(Calbiochem ,Darmstadt ,Germany)印迹 (blotted)，胱天蛋白酶-1使用抗体casp-1克隆4B4.2.1(Genentech,San  Francisco,CA赠 送)和兔中培养的胱天蛋白酶-1抗体(Gabriel 赠送)，脑啡肽酶使用抗体56C6(Santa  Cruz ,Heidelberg ,Germany)，和β-肌动蛋白使用A2228(Sigma ,Munich ,Germany)和926- 42212(LI-COR  Biosciences ,Bad  Homburg ,Germany)。通过增强的化学发光反应 (Millipore,Darmstadt,Germany)或近红外检测(Odyssey,LI-COR)检测免疫反应性。化学 发光强度使用Chemidoc  XRS文件系统(Biorad ,Munich,Germany)进行分析。NEP(重组小鼠 NEP蛋白；1126-ZN)和IDE(重组IDE蛋白；2496-ZN)的阳性对照来自R&D系统(美国明尼苏达 州明尼阿波利斯市R&D  System，Inc.)。NEP(重组小鼠NEP蛋白质；1126-ZN)和IDE(重组IDE 蛋白质；2496-ZN)的阳性对照来自R&D系统(R&D  System,Inc.Minneapolis,MN,USA)。 [0229] 硫黄素T荧光测定：合成Aβ1-40和Aβ1-42肽采购自Peptide  Specialty  Laboratories (PSL,Heidelberg ,Germany)。将冻干的肽溶解在10mM  NaOH中至1mg/ml的终浓度，在水浴 (Brandelin  Sonopuls,Berlin,Germany)中超声处理5分钟，并保存在-80℃下直至进一步 使用。为了监测Aβ-原纤维化，进行硫黄素T(ThT)结合测定，如先前所描述30。简言之，在ThT 荧光测定缓冲液(50mM磷酸钠缓冲液(pH  7.4)，50mM  NaCl，20μM  ThT，和0.01％叠氮化钠) 中将Aβ母液稀释至50μM的最终Aβ浓度。使用Varian  Cary  Eclipse荧光分光光度计 (Agilent,Waldbronn,Germany)进行实时ThT荧光测量。在搅拌下将样品在37℃下培育。在 激发和发射波长分别为446nm和482nm，狭缝宽度为5nm的情况下，每5分钟测量ThT荧光，持 续25小时。为了评估Aβ原纤维化的交叉播种，将新鲜稀释的Aβ1-40和Aβ1-42(50μM)与从ASC表 达细胞(0.22和1.75μM)纯化的ASC斑点在37℃下伴随搅拌一起培育。如上所述进行实时ThT 荧光测量。还评估了ASC斑点对TAMRA标记的Aβ1-42和Aβ42-1肽的交叉播种作用。 [0230] 浊度测定：对于浊度测定，使用在团聚测定结束时收集的样品等分试样。使用设置 在403nm波长的Agilent  8453紫外分光光度计测量吸光度。 [0231] Aβ与重组ASC蛋白质的相互作用：将单独的重组ASC蛋白(不具有Aβ)与补充或不补 充重组ASC蛋白(2μM)的单体Aβ1-40和Aβ1-42溶液(50μM)在37℃下振荡培育长达96小时。使在 不同时间间隔(0、12、24、48、72和96h)下收集的样品等分试样经历电子显微镜和SDS-PAGE 电泳。SDS-PAGE后，采用Odyssey  Clx成像系统(Li-COR,Bad  Homburg ,Germany)使用抗ASC 斑点和抗Aβ抗体进行蛋白质印迹分析。使用Li-COR  Image  Studio软件进行量化(Li-COR, Bad  Homburg,Germany)。 [0232] 透射电子显微镜：将1mg冻干的淀粉样-β(1-42)肽(PSL ,Germany)溶解在250μl  NaOH和750μl  Tris/HCl(pH  7.6)缓冲液中至1mg/ml的终浓度。将样品在37℃下培育2小时， 然后以20,000g离心5分钟。然后将Aβ与ASC蛋白混合并在时程实验中培育长达72小时。将 41 CN 111556875 A 说　明　书 37/45 页 ASC-mCherry、Aβ或ASC-mCherry连同Aβ的样品结合到碳涂覆的网格上，并用1％乙酸铀酰染 色。图片是在具有4096×4096像素TemCam(Tietz,Gauting,Germany)的CM120显微镜上以点 扫描模式以72,000倍的放大倍数拍摄。 [0233] 免疫沉淀实验：用抑制剂(AEBSF，蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich,Munich, Germany)，NaF和NaVO3)在NP-40缓冲液中匀浆人或小鼠的脑样品。将60μl蛋白G磁珠在1ml  PBS、0.1％Tween  20中洗涤3次，并在旋转的同时与抗ASC或6E10抗体在室温下培育10分钟。 将小珠在1ml  0.1％PBS-T中洗涤3次。添加样品并在旋转的同时在室温下培育1小时。样品 在PBS、0.1％Tween  20中洗涤3次，重悬于4x  NuPAGE样品缓冲液中，在70℃下加热10分钟， 并在14000xg下离心5分钟。上清液通过4-12％NuPAGE分离并通过蛋白质印迹进行分析。 [0234] Aβ-ASC斑点共沉降分析：使用纯化的ASC斑点和合成的Aβ肽进行Aβ-ASC斑点共沉 降分析。在37℃震荡下，在有或没有ASC斑点(1.75μM)的情况下，培育单体Aβ1-40和Aβ1-42 溶液(50μM)。在各自的缓冲液中，没有Aβ的情况下的ASC斑点用作对照。为了进行定量沉降 分析，将在不同时间间隔(0.25小时和6小时)下收集的样品等分试样分级成上清液，并将沉 淀进行超速离心(100,000xg，1小时，4℃)。将得到的沉淀重悬于对应于上清液体积的缓冲 液体积中。在变性和还原条件下，将上清液和沉淀级分在4-12％NuPAGE(Invitrogen , Karlsruhe ,Germany)梯度凝胶上进行电泳。采用Odyssey  Clx成像系统(Li-COR ,Bad  Homburg ,Germany)使用抗ASC斑点和抗Aβ抗体进行蛋白质印迹分析。使用Li-COR  Image  Studio软件(Li-COR,Bad  Homburg ,Germany)进行量化。通过ThT荧光测定法量化富含β-折 叠的寡聚物/原纤维的形成。在460和605nm之间的λ发射和446nm激发下，监测Aβ1-40和Aβ1-42 上清液以及沉淀级分——有和无ASC斑点——的荧光光谱。激发和发射狭缝设置为10nm。使 用以0.25h和6h间隔的上清液和沉淀级分的最大λ发射值(485nm)进行统计分析。 [0235] 行为分型：莫里斯水迷宫测试。空间记忆测试是在24℃下，在由充满不透明水的圆 形水箱 组成的水池中进行。水盆的灯光昏暗(20-30勒克斯)，并且周围被白色窗帘包 围。迷宫实际上分为四个象限，一个象限包含隐藏的平台(15x15cm)，位于水面以下1.5cm 处。训练小鼠寻找平台，借助三个不对称放置的额外迷宫提示以作为空间参考，进行定向。 将它们以准随机的方式放入水中，以防止策略学习。允许小鼠搜索平台40s；如果小鼠在分 配的时间内没有到达平台，则将它们手动放置在平台上。在下一次试验开始之前，允许小鼠 在平台上停留15s。在完成四次试验后，将小鼠干燥，然后放回它们的母笼里。小鼠连续8天 每天进行4次试验。分析每只动物的积分时间或行进距离，基线水平设置为曲线下面积计算 (AUC，延迟10s，距离100cm)。对于最后一次训练(第9天)后24小时进行的空间探测试验，将 平台移开，并允许小鼠游泳30s。下降位置在3rd和4th象限之间的边界处，小鼠开始时面向墙 壁。数据以在Q1象限中所花费的时间百分比表示，Q1代表了平台所在的象限，并与动物在其 余象限中所花费的平均时间进行了比较。同一天下午，进行视觉提示测试，其中平台被以旗 帜标出，并在每次试验期间确定了起点和终点的新位置。所有小鼠移动均由计算机化跟踪 系统记录，该系统计算移动的距离和到达平台所需的延迟(Noldus,Ethovision  3.1)。 [0236] 鼠和人Aβ斑块分析：淀粉样斑块核根据先前发表的方法进行分离32XX31。简言之，将 小鼠脑半球或人脑样品匀浆，在2％SDS、50mM  Tris-HCl  pH  7 .5、50mM  DTT中煮沸，并在 100,000×g下于10℃下离心1小时。将沉淀溶解在1％SDS、50mM  Tris-HCl  pH  7 .5、50mM  DTT中，并在100,000×g下于10℃下离心1小时。将沉淀悬浮在1％SDS、50mM  Tris-HCl  pH  42 CN 111556875 A 说　明　书 38/45 页 7 .5、50mM  DTT中，并装载在不连续的蔗糖梯度(含1％SDS的50mM  Tris  pH  7 .5中的1.0、 1.2、1.4和2.0M蔗糖)上，在220,000×g下于10℃下以离心20小时，并分级为6个级分。发现 淀粉样斑块核在1.4/2M界面处富集。使用针对ASC的抗体6E10或Alz-177(Invivogen,San  Diego,CA)通过免疫点印迹分析样品。 [0237] 脑Aβ浓度的ELISA量化。使用电化学发光ELISA对Aβ1-38、Aβ1-40和Aβ1-42(Meso  Scale  Discovery,Gaithersburg,MD,USA)进行Aβ量化确定。在SECTOR  Imager  2400阅读器(Meso  Scale  Discovery ,Gaithersburg ,MD ,USA)上测量信号。用5％阻断剂A(Meso  Scale , Gaithersburg,MA)、0.1％小鼠γ球蛋白(Rockland ,Gilbertsville,PA)阻断平板。来自小 鼠脑的SDS和FA级分分别在1％阻断剂A、0.1％小鼠γ球蛋白1:25和1:100中稀释。将30μl样 品在室温下培育4小时，用Tris洗涤缓冲液(Meso  Scale,Gaithersburg,MA)洗涤，然后在室 温下，与在1％阻断剂A、0.1％小鼠γ球蛋白中稀释的0.25μg/ml  MSD标记的抗体4G8(Meso  Scale,Gaithersburg ,MA)一起培育1小时。用Tris洗涤缓冲液洗涤孔。加入在150μl的2x读 出缓冲液(Meso  Scale,Gaithersburg,MA)中进行的检测洗涤。 [0238] 立体定向手术。用腹膜内注射氯胺酮(0.10mg/g体重)和甲苯噻嗪(0.01mg/g体重) 麻醉三个月大的宿主小鼠。将动物放入配备有加热毯的立体定向小鼠架(Stoelting ,Wood  Dale,IL,U.S.A.)中，以在整个过程中将体温维持在37℃。使用适合立体定位架的Dremel设 备在颅骨上钻两个小孔。随后，宿主动物接受双侧立体定向注射2μl  ASC斑点或对照(扩展 数据图11b、f，Exp  I，宿主：APP/PS1小鼠)，由APP/PS1或WT小鼠制备的脑提取物(扩展数据 图11b、f，Exp.II,宿主：ASC-/-、APP/PS1、APP/PS1/ASC-/-)，由APP/PS1或APP/PS1/ASC-/-小鼠 制备的脑提取物(扩展数据图11b、f，Exp  III，宿主：APP/PS1)或使用Hamilton注射器将由 APP/PS1小鼠制备的含有抗ASC-IgG或同种型-IgG的脑提取物(扩展数据图11b、f，Exp  IV， 宿主：APP/PS1)，注射到海马中，AP-2.5mm，L /-2mm，DV-1.8mm。泵的注射速度控制在0.5μl/ min。将针头保持在适当位置10分钟，然后缓慢拔出针头，以免针道回流。用无菌的骨蜡仔细 填充颅骨孔。然后，再次清洁手术区域并缝合切口。监测所有小鼠，直到由麻醉完全恢复。随 后，在IVC笼中将动物在标准条件下圈养，直到将其处死。 [0239] 动物灌注。用氯胺酮/甲苯噻嗪(分别为100mg/kg和10mg/kg)溶液腹膜内麻醉动 物，然后该动物经心灌注冷PBS(30ml)。从动物中取出大脑，并在4℃下于4％多聚甲醛(PFA) 溶液中保存24小时，然后用PBS洗涤3次，并保存在PBS-NaN3中直至进一步使用。 [0240] 组织提取物:按照23 ,32所述的方法，由老年动物(16个月大)的APP/PS1、APP/PS1/ ASC-/-和WT前脑(无小脑)制备小鼠脑组织匀浆(也参见扩展数据图11e)。将脑组织样品在液 氮中速冻并保存在-80℃直至使用。在无菌PBS中将组织匀浆(10％w/v)。根据来自Aβ1-42的 ELISA测量的结果，通过添加野生型小鼠脑组织匀浆，将APP/PS1和APP/PS1/ASC-/-小鼠的脑 组织匀浆等分试样调整为Aβ的相等量。使用抗体82E1和抗肌动蛋白抗体通过免疫印迹分析 等分试样的Aβ含量，以对蛋白质负载量标准化。在使用前，将组织匀浆在4℃下以3000g离心 5分钟，等分试样，并在-80℃下保存。 [0241] Aβ斑块沉积物的分析：将自由浮动的40μm厚的连续切片在振动切片机(Leica , Wetzlar,Germany)上切割。将切片保存在0.1％NaN3、PBS中。为了进行免疫染色，将每只动 物的8个切片以彼此限定的距离(扩展数据图11f)固定在载玻片上，并洗涤三次，在PBS中洗 涤5分钟，在PBS  0.1％Triton  X-100中洗涤10分钟，在PBS中3％H2O2洗涤15分钟。将它们在 43 CN 111556875 A 说　明　书 39/45 页 PBS中洗涤5分钟，并在3％BSA，0.1％Triton  X-100，PBS(封闭缓冲液)中封闭1h，然后与 IC16(1:400)抗体33在封闭缓冲液中培育过夜。将载玻片在PBS中洗涤3次，并与二抗在封闭 缓冲液中培育2小时。样品用PBS洗涤3次5分钟，然后与PBS中的A B溶液(1:50) (ABC  Vectastain  Elite  Kit  Lsg,Vector  Laboratories,Burlingame,CA)一起培育30分钟，并 在PBS中洗涤3次5分钟。将样品在二氨基联苯胺溶液(0.17mM二氨基联苯胺，0.01％H2O2在 PBS中)中培育30秒，并在5分钟后用水终止反应。使用Immu-Mount(Thermo  Scientific , Cheshire ,UK)固定切片。在Olympus  BX61亮场显微镜上进行亮场显微镜检查，并使用 ImageJ处理图像。 [0242] 脑蛋白提取：如先前所述提取速冻脑半球12。简言之，将半球在PBS，1mM  EDTA，1mM  EGTA，3μl/ml蛋白酶抑制剂混合物(Sigma ,Munich,Germany)中匀浆。在RIPA缓冲液(25mM  Tris-HCl，pH  7.5，150mM  NaCl，1％NP40，0.5％NaDOC，0.1％SDS)中提取组织匀浆，以100, 000xg离心30分钟，并在2％SDS，25mM  Tris-HCl，pH7.5中溶解含有不溶性Aβ的沉淀。另外， 用70％的甲酸水溶液萃取不溶于SDS的沉淀。使用真空离心蒸发浓缩器(speed  vac) (Eppendorf ,Hamburg ,Germany)除去甲酸，并将得到的沉淀溶解在的200mM  Tris-HCl，pH  7.5中。 [0243] IDE活性：根据制造商的说明，使用 520IDE活性测定试剂盒(AnaSpec, Fremont,CA)，使用FRET(荧光共振能量转移)底物(5-FAM/QXL520)测量小鼠脑组织匀浆中 的IDE活性。当活性IDE切割FRET底物时，其会导致5-FAM(5-羧基荧光素)荧光的增加，其在 Infinite  200PRO读板器(Tecan, Switzerland)上在490nm的激发波长和520nm 的发射波长下测得。使用以下公式计算总IDE活性： 其中A1是30分钟 时5-FAM的浓度，A0是0分钟时的浓度；C是总蛋白浓度，和D是稀释度(dilution)。使用BCA试 剂(Thermo  Scientific,Rockford ,USA)测定的每毫克总蛋白质中的5-FAM相对荧光单位 (RFU)被标准化。 [0244] 通过FACS评估Aβ吞噬作用：为了确定吞噬活性，向3个月大的APP/PS1或APP/PS1/ ASC-/-注射了APP/PS1和WT裂解物或ASC斑点和对照细胞裂解物。1个月后，给动物注射在 50％DMSO/50％NaCl(0 .9％)pH＝12中的10mg/kg甲氧基-XO4(863918-78-9 ,TOCRIS  bioscience,Bristol,UK)，并在3小时后，如先前所述对其进行分析12。如先前所述12，从小 鼠中分离小胶质细胞群，并与CD11b-APC(101212,BioLegend ,Fell,Germany)和CD45-FITC (11-0451-82 ,eBioscience ,Frankfurt ,Germany)一起培育，并通过流式细胞术(FACS  Canto  II,BD  Biosciences,Heidelberg  Germany)确定和甲氧基-XO4-阳性吞噬小胶质细 胞。使用FlowJo  X  10.0.7(FlowJo,Ashland,Oregon)分析数据。 [0245] 统计：通过单向ANOVA，随后适当时析因分析或通过双尾非成对学生t检验，如果未 指示，则使用用于Mac  OS或R的Graph  Pad  Prism  6。在各自的图解中给出统计细节。 [0246] 数据可用性：当前研究期间生成的和/或当前研究期间分析的数据集已作为补充 信息(补充图1-3)和xls.files可用。向通讯作者合理要求，可获得更多数据。 [0247] 实施例1：ASC斑点增强Aβ团聚 [0248] ASC斑点可以在AD病例和APP/PS1转基因小鼠的脑切片中可视化，并且位于小胶质 细胞内和细胞外空间中，并且还与Aβ沉积物结合(图1a、b，图5)。在体外，通过暴露于NLRP3 44 CN 111556875 A 说　明　书 40/45 页 炎性体激活剂，可以在预刺激的鼠小胶质细胞(图1c、d，图6a、b)或人THP-1细胞(图6c-j)中 诱导ASC斑点的形成和释放。小胶质细胞暴露于Aβ1-42引起ASC斑点的形成和释放。动态成像 显示，其释放后不久，ASC斑点与TAMRA标记的Aβ1-42结合(图1e)。通过将源自炎性体刺激的 原代野生型和ASC-/-小胶质细胞(图1f-h)或巨噬细胞的上清液与Aβ1-42一起培育，并随后进 行FACS分析(图7a-e)或免疫沉淀实验(图7b、c)，该观察被进一步证实。来自ASC-/-小胶质细 胞或巨噬细胞的上清液无法影响Aβ团聚，只有在源自产生ASC的细胞的上清液中才能检测 到Aβ团聚(图1g、h，图4e、f)。 [0249] 使用通过免疫沉淀和酶促释放生成的纯化ASC斑点(图8)的硫黄素T荧光测定法和 蛋白质印迹分析进一步揭示了与Aβ1-42(图1i-k，图9d)或Aβ1-40(图9a-c、e)的共同培育以时 间和浓度依赖性方式促进Aβ聚集。在这里，在ASC存在下团聚的滞后期减少表明通过两种不 同肽/蛋白质的相互作用增强了播种核的形成，并因此ASC斑点对于Aβ团聚具有交叉播种活 性(图1i，图9d、e)。通过浊度测定法测量和透射电子显微镜进一步证实了这些结果(图9f、 g)。值得注意的是，对照实验表明ASC斑点既不诱导Aβ1-42反向序列的团聚，也不诱导对照肽 (牛血清白蛋白)的团聚(图9h、i)。 [0250] 实施例2:Aβ交叉播种取决于ASC-PYD结构域 [0251] 如通过免疫印迹实验检测的(图10a-d、i、j)，源自重组蛋白(recASC)的ASC斑点从 早期时间点开始同样促进Aβ1-40和Aβ1-42团聚，从而证实了先前的观察结果。为了进一步支持 ASC斑点和Aβ的特异性相互作用，测试了携带位于ASC的PYD或CARD结构域中的突变的 recASC。ASC-PYD结构域在21、22和26位的突变(其阻止了ASC螺旋原纤维组装18)，完全阻止 了ASC斑点对Aβ团聚的促进作用(图10e)。相反，ASC  CARD结构域中的点突变阻止了ASC原纤 维自组装——这有助于ASC斑点的形成，但并未实质性地改变ASC斑点介导的Aβ团聚的促进 (图10f、g)。ASC的团聚推进作用使人联想到数种fAD——其引起编码APP或早老素的基因的 突变，这增加了Aβ肽的团聚倾向19-21。特别地，考虑到ASC对Aβ1-40团聚的影响，小胶质细胞的 先天免疫应答可以通过ASC斑点释放来实现类似的作用。因此，人们可以推测增加sAD风险 并且也已知参与脑中的炎性体激活的因素是否通过这种机制起作用22。 [0252] 为了进一步确定ASC斑点和Aβ的物理相互作用，进行了共沉降测定。仅在Aβ1-40和A β1-42存在的情况下，ASC斑点在培育的6小时内在沉淀级分中共沉降，但在没有Aβ1-40和Aβ1-42 肽存在的所有时间点，ASC斑点都会保留在上清液级分中(图2a、b)。对共沉降测定样品的上 清液和沉淀级分进行的额外硫黄素T实验表明，在ASC存在下，增加的富含β-折叠的寡聚物 和原纤维(图11)。与在共沉降实验中观察的ASC-Aβ相互作用一致，ASC和Aβ从APP/PS1小鼠 的脑样品中共免疫沉淀(图2c、d)。与ASC结合的Aβ随着年龄的增长而增加，而在野生型动物 中则不存在。通过梯度离心从APP/PS1脑中分离的Aβ沉积物的区室分析显示，核心部分以及 纤维部分中都存在ASC连同Aβ(图2e，图12a-c)。与此相一致，免疫组织化学表明，甚至在4月 龄时，早期的Aβ沉积物也显示出ASC免疫阳性核心，该核心被抗体6E10免疫阳性Aβ包围(图 2f，图12d、e)。这表明，ASC斑点介导的先天免疫应答可在体内Aβ团聚和沉积的早期阶段导 致Aβ的交叉播种。类似地，在非痴呆年龄匹配的对照的大脑样品中几乎没有ASC结合的Aβ， 但在AD大脑中却强烈增加(图2g、h，图12f、g)。对Aβ沉积物的核心和纤维区室的分析发现， 与对照相比，患有由于AD(明显AD痴呆的临床前期)造成的轻度认知障碍(MCI)的患者在核 心部分中具有ASC-Aβ共定位，而纤维部分对于两个靶标仅显示较小的免疫反应性(图2i)。 45 CN 111556875 A 说　明　书 41/45 页 类似地，AD的特征是核心内ASC和Aβ共同存在，而纤维部分仍主要对Aβ呈免疫阳性，这表明 ASC斑点-Aβ交叉播种发生在MCI之前或期间(图2i)，从而引起ASC免疫染色被Aβ包围的核心 (图2j，图12h)。值得注意的是，患有其他神经变性疾病(包括额颞痴呆、皮质基底变性和血 管痴呆)的患者的尸检组织中未检测到ASC结合的Aβ(图12i、j)。 [0253] 实施例3:ASC斑点促进体内Aβ沉积 [0254] 为了表征ASC对Aβ病理学和相关行为缺陷的总体影响，将ASC敲除动物(ASC-/-)与 APP/PS1转基因小鼠杂交，并在3、8或12月龄时进行分析。尽管在3月龄时未检测到差异，但 APP/PS1/ASC-/-转基因小鼠在8个月和12个月时大脑Aβ负荷显著降低(图3a、b，图13a、c、d， 图14a、b)。应当注意，先前在16个月大的APP/PS1转基因小鼠中描述的NLRP3介导的免疫机 制的调节，包括胱天蛋白酶-1激活(CASP1，图14c-f)，Aβ降解酶脑啡肽酶(NEP)(图14c-f)和 胰岛素降解酶(IDE，图14c-f)的生成或吞噬作用(图15a)，没有考虑观察到的脑Aβ变化。同 样，APP/PS1/ASC-/-动物显示出显著改善的空间记忆性能(图3c-f，图13b)。在12月龄时仍可 检测到ASC缺乏的这种保护作用(图13e-h)。 [0255] 为了研究ASC是否在体内充当Aβ交叉播种剂，我们将细胞上清液来源或纯化的ASC 斑点注入了3月龄的APP/PS1小鼠的海马中，并分析了6月龄时它们大脑的Aβ沉积(图14b- f)。与接受溶剂对照的对侧海马相比，海马内ASC斑点注射增加了Aβ免疫阳性沉积物的数量 和总面积(图16a、b、e)，而不会影响吞噬作用(图16i)。该结果通过对由距注射部位限定距 离的大脑切片生成的合并脑组织匀浆进行免疫印迹分析得到证实，这表明ASC斑点注射诱 导的Aβ显著增加，而APP表达或APP裂解产物没有变化(图16c、d)。先前，响应于用来源于APP 或APP/PS1转基因动物的脑组织匀浆注射APP转基因动物，描述了Aβ病理学的扩散9,23。为了 测试内源性ASC是否有助于此现象，APP/PS1或APP/PS1/ASC-/-小鼠接受了海马内注射APP/ PS1源的脑组织匀浆，而对侧海马注射野生型小鼠脑组织匀浆。在3个月时注射动物，并在8 个月龄时进行分析(图15d)。在APP/PS1动物中，与对侧注射野生型小鼠脑相比，注射APP/ PS1小鼠脑源的组织匀浆增加了Aβ阳性沉积物的数量和总面积，从而证实了先前的结果(图 3g、h)23。重要的是，在APP/PS1/ASC-/-小鼠中完全没有这种作用。此外，对接受APP/PS1小鼠 脑组织匀浆的APP/PS1和APP/PS1/ASC-/-小鼠的半球的比较显示Aβ沉积物数量、其表面积以 及其头尾扩散的强烈差异(图16f)。该免疫组织化学结果通过SDS可溶性Aβ1-40和Aβ1-42的 ELISA或脑组织匀浆的免疫印迹分析以及Aβ单体和寡聚物级分的量化验证(图3i-k)，而APP 表达或裂解产物没有任何变化(图3j)。我们评估了吞噬作用(图17a、b)、CASP1激活或Aβ降 解酶NEP和IDE的生成(图14d)。两种基因型的所有参数的结果均相同，除了IDE以外，其在注 射的和未注射的ASC-/-动物中增加(图14d)。尽管在相同的脑组织中，这种现象与IDE活性的 显著增加并没有并行(图17c)，但是我们不能排除IDE的增加有助于整体效果。尽管如此，所 有其他体内实验并未显示IDE水平或活性的显著差异，但ASC斑点介导的Aβ病理学调制表明 该体内发现在很大程度上是基于ASC诱导的播种。这些实验共同表明，内源性ASC代表了该 模型中诱导的Aβ扩散的潜在机制。 [0256] 实施例4：ASC斑点抗体减少Aβ沉积 [0257] 接下来，测试了在注射的脑组织匀浆中存在的内源性ASC对其对Aβ扩散的潜在影 响的贡献。在这些实验中，3月龄的APP/PS1小鼠接受海马内注射接受源自APP/PS1或APP/ PS1/ASC-/-动物的小鼠脑裂解物(图15b、d)，其被调整为Aβ的相等量(图15e)。与上述发现一 46 CN 111556875 A 说　明　书 42/45 页 致，在8个月大时进行分析时，APP/PS1/ASC-/-源的脑裂解物显示出增加总体脑Aβ负荷和诱 导Aβ病理学头尾扩散的能力降低(图4a-d，图16g)。因此，综合证据表明，APP/PS1脑组织匀 浆中所含的ASC是Aβ病理学扩散的促成因素。为了在体外和体内验证ASC斑点的致病作用， 进行了通过抗体共培育靶向ASC斑点的实验。利用ThT荧光光谱法，发现特异性抗ASC斑点抗 体以浓度依赖性方式阻止ASC斑点诱导的Aβ团聚(图4e)，而不会影响Aβ本身团聚(图4e)。为 了进一步证实ASC斑点是否是对观察到的对Aβ体内扩散影响的介导成分，并且为了排除ASC 缺陷小鼠中肠道微生物组差异的潜在混杂因素24，APP/PS1动物接受了与APP/PS1脑组织匀 浆一起共注射的ASC斑点特异性IgG或同种型特异性IgG(图4f-i)。通过单次共注射靶向ASC 斑点可减少头尾Aβ沉积(图16h)。这种作用伴随着Aβ单体和寡聚物的减少(图4g、i)。在上述 实验中，APP表达、APP裂解产物(图4c、i)或IDE、NEP和CASP1均未显示任何变化(图14e、f)。 [0258] 这些数据一起表明ASC斑点有助于Aβ团聚和扩散。先前的实验报道合成的Aβ不能 有效诱导Aβ斑块形成，表明需要辅助因子驱动Aβ组装和沉积。小胶质细胞先天免疫激活后 释放的ASC斑点可能代表了这种辅助因子，表明脑中的炎性体激活与AD中Aβ斑块形成的进 展有关。与这种推定的机制相反，朊病毒相关疾病的进展不受Scrapie鼠模型中ASC或NLRP3 遗传缺陷的影响25，这表明在神经变性疾病之间，驱动扩散的机制不同。炎性体反应与Aβ斑 块扩散的病理生理联系表明，针对炎性体的药理靶向可能代表AD的新型治疗方式。 [0259] 人抗ASC斑点抗体可以防止衰老期间脑中β-淀粉样肽的交叉播种。老化相关的免 疫衰老的特征是抗体生成和免疫监视受到损害。因此，免疫衰老可能与针对ASC斑点的自身 抗体水平降低有关。我们建议使用内源性抗ASC斑点抗体滴度作为疾病进展的可能标记，尤 其是在诸如阿尔兹海默症之类的神经变性疾病的临床沉默前期。由于β-淀粉样沉积物也发 生在路易体痴呆中，因此以下机制可特别用于所有形式痴呆的诊断和鉴别诊断。 [0260] 此外，ASC斑点形成可能作为其他神经变性疾病(如帕金森病、多系统萎缩症、亨廷 顿病、肌萎缩性侧索硬化症和髓脑小脑性共济失调)中公认的先天免疫反应的一部分发生。 [0261] 实施例5：暴露于增加浓度的ASC斑点的原代海马神经元 [0262] ASC斑点的纯化 [0263] 为了纯化ASC斑点，使用永生化的巨噬细胞以及NLRP3和ASC的过表达。播种后两 天，收获细胞并沉淀。细胞裂解用两倍沉淀体积的CHAPS缓冲液(20mM  HEPES，5mM  MgCl2， 0.5mM  EGTA，0.1％CHAPS，0.1mM  PMSF，1×蛋白酶抑制剂混合物(Roche))通过在冰上注射 器上的20G针25倍填充进行。在将裂解物以18,500xg离心8分钟后，收集上清液，并再次在4 ℃以100,000xg离心30分钟。取出所得的上清液，并通过使用0.22μm  PVDF过滤器通过离心 (5分钟，在4℃下18,500xg)进行过滤。随后，通过在37℃下培育30分钟来诱导滤液中ASC斑 点形成。将ASC斑点在4℃下以600×g离心8分钟。将沉淀溶解在无菌PBS中。将含有ASC斑点 的溶液保存在4℃下。 [0264] 通过ASC斑点处理原代神经元。 [0265] 从C57BL/6N小鼠在El5-16下制备海马神经元。将每孔70,000个细胞接种在24多孔 板中。接种后12天，将神经元用各种体积的ASC斑点溶液处理24小时。为了测量细胞生存力， 在ASC斑点处理之后，通过对应于制造商方案的XTT溶液(Cell  Signalling)培育神经元。在 平板读取装置(TECAN)上三个小时后以450nm的吸收读取结果。 [0266] 如发明人所证实的，例如，在阿尔茨海默症患者中观察到主要的炎性事件来自β- 47 CN 111556875 A 说　明　书 43/45 页 淀粉样蛋白团聚。发现该影响是例如阿尔茨海默症(Morbus  Alzheimer)的主要原因。通过 使用抗ASC斑点配体，尤其是抵消ASC斑点有助于A-β团聚和扩散作用的抗体，可以成功克服 Aβ团聚后的炎症。因此，本发明发现(如图9F至9I的体内实验所示)，抗ASC斑点抗体有效地 减少了基于ASC斑点的团聚。Franklin等人的发现描述了由注射二氧化硅晶体触发的体内 炎性体活化的独特情形。在这种情况下，抗ASC斑点抗体与二氧化硅晶体触发体内炎性体活 化后出现的ASC斑点结合。 [0267] 参考文献 [0268] 1 .Heneka ,M .T .,Kummer ,M .P .&Latz ,E .Innate  immune  activation  in  neurodegenerative  disease.Nat.Rev.Immunol.14,463–477(2014) . 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110 His  Phe  Ile  Asp  Gln  His  Arg  Ala  Ala  Leu  Ile  Ala  Arg  Val  Thr  Asn 115  120  125 Val  Glu  Trp  Leu  Leu  Asp  Ala  Leu  Tyr  Gly  Lys  Val  Leu  Thr  Asp  Glu 130  135  140 Gln  Tyr  Gln  Ala  Val  Arg  Ala  Glu  Pro  Thr  Asn  Pro  Ser  Lys  Met  Arg 145  150  155  160 Lys  Leu  Phe  Ser  Phe  Thr  Pro  Ala  Trp  Asn  Trp  Thr  Cys  Lys  Asp  Leu 165  170  175 Leu  Leu  Gln  Ala  Leu  Arg  Glu  Ser  Gln  Ser  Tyr  Leu  Val  Glu  Asp  Leu 180  185  190 Glu  Arg  Ser 195 <210>  2 51 CN 111556875 A 序　列　表 2/4 页 <211>  90 <212>  PRT <213>  智人 <400>  2 Met  Gly  Arg  Ala  Arg  Asp  Ala  Ile  Leu  Asp  Ala  Leu  Glu  Asn  Leu  Thr 1  5  10  15 Ala  Glu  Glu  Leu  Lys  Lys  Phe  Lys  Leu  Lys  Leu  Leu  Ser  Val  Pro  Leu 20  25  30 Arg  Glu  Gly  Tyr  Gly  Arg  Ile  Pro  Arg  Gly  Ala  Leu  Leu  Ser  Met  Asp 35  40  45 Ala  Leu  Asp  Leu  Thr  Asp  Lys  Leu  Val  Ser  Phe  Tyr  Leu  Glu  Thr  Tyr 50  55  60 Gly  Ala  Glu  Leu  Thr  Ala  Asn  Val  Leu  Arg  Asp  Met  Gly  Leu  Gln  Glu 65  70  75  80 Met  Ala  Gly  Gln  Leu  Gln  Ala  Ala  Thr  His 85  90 <210>  3 <211>  89 <212>  PRT <213>  智人 <400>  3 Ala  Ala  Lys  Pro  Gly  Leu  His  Phe  Ile  Asp  Gln  His  Arg  Ala  Ala  Leu 1  5  10  15 Ile  Ala  Arg  Val  Thr  Asn  Val  Glu  Trp  Leu  Leu  Asp  Ala  Leu  Tyr  Gly 20  25  30 Lys  Val  Leu  Thr  Asp  Glu  Gln  Tyr  Gln  Ala  Val  Arg  Ala  Glu  Pro  Thr 35  40  45 Asn  Pro  Ser  Lys  Met  Arg  Lys  Leu  Phe  Ser  Phe  Thr  Pro  Ala  Trp  Asn 50  55  60 Trp  Thr  Cys  Lys  Asp  Leu  Leu  Leu  Gln  Ala  Leu  Arg  Glu  Ser  Gln  Ser 65  70  75  80 Tyr  Leu  Val  Glu  Asp  Leu  Glu  Arg  Ser 85 <210>  4 <211>  176 <212>  PRT <213>  智人 <400>  4 Met  Gly  Arg  Ala  Arg  Asp  Ala  Ile  Leu  Asp  Ala  Leu  Glu  Asn  Leu  Thr 52 CN 111556875 A 序　列　表 3/4 页 1  5  10  15 Ala  Glu  Glu  Leu  Lys  Lys  Phe  Lys  Leu  Lys  Leu  Leu  Ser  Val  Pro  Leu 20  25  30 Arg  Glu  Gly  Tyr  Gly  Arg  Ile  Pro  Arg  Gly  Ala  Leu  Leu  Ser  Met  Asp 35  40  45 Ala  Leu  Asp  Leu  Thr  Asp  Lys  Leu  Val  Ser  Phe  Tyr  Leu  Glu  Thr  Tyr 50  55  60 Gly  Ala  Glu  Leu  Thr  Ala  Asn  Val  Leu  Arg  Asp  Met  Gly  Leu  Gln  Glu 65  70  75  80 Met  Ala  Gly  Gln  Leu  Gln  Ala  Ala  Thr  His  Gln  Gly  Leu  His  Phe  Ile 85  90  95 Asp  Gln  His  Arg  Ala  Ala  Leu  Ile  Ala  Arg  Val  Thr  Asn  Val  Glu  Trp 100  105  110 Leu  Leu  Asp  Ala  Leu  Tyr  Gly  Lys  Val  Leu  Thr  Asp  Glu  Gln  Tyr  Gln 115  120  125 Ala  Val  Arg  Ala  Glu  Pro  Thr  Asn  Pro  Ser  Lys  Met  Arg  Lys  Leu  Phe 130  135  140 Ser  Phe  Thr  Pro  Ala  Trp  Asn  Trp  Thr  Cys  Lys  Asp  Leu  Leu  Leu  Gln 145  150  155  160 Ala  Leu  Arg  Glu  Ser  Gln  Ser  Tyr  Leu  Val  Glu  Asp  Leu  Glu  Arg  Ser 165  170  175 <210>  5 <211>  135 <212>  PRT <213>  智人 <400>  5 Met  Gly  Arg  Ala  Arg  Asp  Ala  Ile  Leu  Asp  Ala  Leu  Glu  Asn  Leu  Thr 1  5  10  15 Ala  Glu  Glu  Leu  Lys  Lys  Phe  Lys  Leu  Gln  Ala  Ala  Thr  His  Gln  Gly 20  25  30 Ser  Gly  Ala  Ala  Pro  Ala  Gly  Ile  Gln  Ala  Pro  Pro  Gln  Ser  Ala  Ala 35  40  45 Lys  Pro  Gly  Leu  His  Phe  Ile  Asp  Gln  His  Arg  Ala  Ala  Leu  Ile  Ala 50  55  60 Arg  Val  Thr  Asn  Val  Glu  Trp  Leu  Leu  Asp  Ala  Leu  Tyr  Gly  Lys  Val 65  70  75  80 Leu  Thr  Asp  Glu  Gln  Tyr  Gln  Ala  Val  Arg  Ala  Glu  Pro  Thr  Asn  Pro 85  90  95 Ser  Lys  Met  Arg  Lys  Leu  Phe  Ser  Phe  Thr  Pro  Ala  Trp  Asn  Trp  Thr 53 CN 111556875 A 序　列　表 4/4 页 100  105  110 Cys  Lys  Asp  Leu  Leu  Leu  Gln  Ala  Leu  Arg  Glu  Ser  Gln  Ser  Tyr  Leu 115  120  125 Val  Glu  Asp  Leu  Glu  Arg  Ser 130  135 54 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 1/75 页 图1 55 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 2/75 页 图1(续) 56 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 3/75 页 图1(续) 57 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 4/75 页 图1(续) 58 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 5/75 页 图1(续) 59 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 6/75 页 图1(续) 60 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 7/75 页 图2 61 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 8/75 页 图2(续) 62 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 9/75 页 图2(续) 63 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 10/75 页 图2(续) 64 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 11/75 页 图2(续) 65 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 12/75 页 图3 66 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 13/75 页 图3(续) 67 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 14/75 页 图3(续) 68 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 15/75 页 图3(续) 69 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 16/75 页 图3(续) 70 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 17/75 页 图3(续) 71 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 18/75 页 图4 72 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 19/75 页 图4(续) 73 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 20/75 页 图4(续) 74 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 21/75 页 图4(续) 75 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 22/75 页 图4(续) 76 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 23/75 页 图5 77 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 24/75 页 图5(续) 78 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 25/75 页 图5(续) 79 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 26/75 页 图5(续) 80 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 27/75 页 图6 81 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 28/75 页 图6(续) 82 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 29/75 页 图6(续) 83 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 30/75 页 图6(续) 84 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 31/75 页 图7 85 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 32/75 页 图7(续) 86 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 33/75 页 图7(续) 87 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 34/75 页 图7(续) 88 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 35/75 页 图7(续) 89 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 36/75 页 图8 90 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 37/75 页 图8(续) 91 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 38/75 页 图8(续) 92 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 39/75 页 图8(续) 93 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 40/75 页 图9 94 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 41/75 页 图9(续) 95 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 42/75 页 图9(续) 96 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 43/75 页 图9(续) 97 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 44/75 页 图10 98 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 45/75 页 图10(续) 99 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 46/75 页 图10(续) 100 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 47/75 页 图10(续) 101 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 48/75 页 图10(续) 102 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 49/75 页 图11 103 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 50/75 页 图11(续) 104 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 51/75 页 图12 105 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 52/75 页 图12(续) 106 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 53/75 页 图12(续) 107 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 54/75 页 图12(续) 108 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 55/75 页 图13 109 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 56/75 页 图13(续) 110 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 57/75 页 图13(续) 111 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 58/75 页 图13(续) 112 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 59/75 页 图13(续) 113 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 60/75 页 图14 114 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 61/75 页 图14(续) 115 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 62/75 页 图14(续) 116 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 63/75 页 图14(续) 117 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 64/75 页 图15 118 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 65/75 页 图15(续) 119 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 66/75 页 图16 120 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 67/75 页 图16(续) 121 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 68/75 页 图16(续) 122 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 69/75 页 图16(续) 123 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 70/75 页 图16(续) 124 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 71/75 页 图16i(续) 125 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 72/75 页 图17 126 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 73/75 页 图17(续) 127 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 74/75 页 图17(续) 128 CN 111556875 A 说　明　书　附　图 75/75 页 图18 129