技术摘要：
本发明属于医药生物技术领域，公开了一种用于食管癌前病变恶性进展风险检测或食管癌早期筛查的试纸条，试纸条包括结合垫和层析垫，结合垫上包被有捕获抗体，捕获抗体为量子点标记的PSMC4抗体、量子点标记的ALDOC抗体和量子点标记的TXLNA抗体的混合物；层析垫上沿样品流  全部
背景技术：
食管癌(又称食管鳞癌)是世界上常见十大恶性肿瘤之一，我国是世界食管癌高发 国家，组织类型主要为鳞状细胞癌。2018年出版的《中国肿瘤登记年报》最新数据显示，我国 食管癌居恶性肿瘤发病第六位，死亡第四位，尤其是河南林县、河北磁县和山西长治地区， 是食管癌高发区，与其它地区相比，食管癌发病率为500:1。对人民生活质量和家庭幸福构 成了严重威胁。 食管癌起病隐匿，以进食哽咽为主诉就诊时，95％患者已处于晚期，中晚期患者术 后5年总体生存率仅10％左右，如果在早期食管癌阶段即接受手术，5年生存率可达90％。因 此，找到食管癌早期发现的关键技术，是减少食管癌发病率和死亡率的重要途径。现有研究 表明，食管癌的病变进展历程为：正常食管粘膜→基底细胞增生→炎症→食管粘膜上皮不 典型增生(包括轻度、中度和重度)→早期癌→晚期癌的过程。食管癌前病变是指食管上皮 癌变极早期阶段的上皮异常增生，形态表现为基底细胞过度增生、轻、中和重度不典型增生 及原位癌。王立东教授领衔的食管癌研究团队历经24年建立了5.4万例食管癌高发区无症 状人群33年随访(1985-2018)研究队列和50万例食管癌患者临床诊疗、病理和45年随访 (1973-2018)大数据库及生物样本库，随访过程中发现，食管癌前病变突出临床特点是其双 向发展的不稳定性，即可向癌的方向持续发展(恶性进展)，也可以停留在某一阶段多年不 变(稳定)，甚至可以退回到正常状态(逆转)。目前临床上无预测癌前病变恶性进展方向的 诊断方法，仅依靠定期随访进行登记研究。综上，需要寻找一种准确、便捷和灵敏的方法对 高发现场食管癌前病变人群进行癌变恶性进展风险预测和早期癌筛查，以指导临床尽早进 行干预和治疗。将食管癌发病阻断在癌前病变阶段或者早期癌阶段，将大大降低死亡率。 量子点(Quantum  dot,QD)又称半导体纳米晶，呈近似球形，直径在2-10nm范围内， 具有明显的量子效应。量子点一般由II-VI族元素(如CdS、CdSe、CdTe、ZnSe、ZnS等)或III-V 族元素(无镉量子点，如InP、InAs等)等半导体材料构成，也可由两种或两种以上的半导体 材料构成核/壳结构(如常见的CdSe/ZnS核/壳结构量子点等)。量子点的物理、光学、电学特 性远优于现有有机荧光染料，具有灵敏度高、稳定性好、保存期长等优势，是新一代荧光标 记探针的最优选择。量子点作为标记探针尤其适用于高灵敏度、活体/在体长时间动态观 察、多指标同时检测等应用领域。十几年来，量子点在生物标记领域涌现越来越多的研究成 果和应用实例，但是在食管癌癌前病变恶性进展和食管癌早期筛查领域诊断试纸方面尚未 见相关发明报道。 3 CN 111551721 A 说　明　书 2/12 页
技术实现要素：
针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的旨在提供一种用于高发区食管 癌前病变恶性进展风险检测或食管癌早期筛查的标志物，本发明的目的之二旨在提供一种 上述标志物的应用，本发明的目的之三提供一种用于食管癌前病变恶性进展风险检测或食 管癌早期筛查的试纸条。 为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下： 本发明首先提供了一种用于食管癌前病变恶性进展风险检测或食管癌筛查的标 志物，所述生物标志物为PSMC4抗原、ALDOC抗原、TXLNA抗原中的任意一种或多种的组合。 本发明还提供了一种上述标志物的检测试剂在制备食管癌前病变恶性进展风险 检测产品中的应用。 根据上述的应用，优选地，所述检测试剂为与所述标志物特异性结合的抗体。 根据上述的应用，优选地，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。 根据上述的应用，优选地，所述产品通过免疫层析法或酶联免疫法检测样本中的 所述标志物，确定样本中所述标志物的表达水平。 根据上述的应用，优选地，所述产品为试纸条或试剂盒。 本发明还提供了一种上述标志物的检测试剂在制备食管癌早期筛查产品中的应 用。 根据上述的应用，优选地，所述检测试剂为与所述标志物特异性结合的抗体。 根据上述的应用，优选地，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。 根据上述的应用，优选地，所述产品通过免疫层析法或酶联免疫法检测样本中的 所述标志物，确定样本中所述标志物的表达水平。 根据上述的应用，优选地，所述产品为试纸条或试剂盒。 本发明还提供了一种用于食管癌前病变恶性进展风险检测或食管癌早期筛查的 试纸条，所述试纸条包括结合垫和层析垫，所述结合垫上吸附有捕获抗体，所述捕获抗体为 PSMC4单克隆抗体、ALDOC单克隆抗体和TXLNA单克隆抗体的混合物，PSMC4单克隆抗体、 ALDOC单克隆抗体和TXLNA单克隆抗体上均带有可检测的标记物；所述层析垫上设有三条检 测线和一条质控线，所述检测线上均包被有检测抗体，三条检测线包被的检测抗体分别为 PSMC4多克隆抗体、ALDOC多克隆抗体和TXLNA多克隆抗体；所述质控线上包被有兔抗鼠IgG。 根据上述的试纸条，优选地，所述标记物为量子点。更加优选地，所述标记物为 CdSe/ZnS量子点。最优选地，所述标记物为羧基水溶性CdSe/ZnS量子点。 根据上述的试纸条，优选地，所述试纸条还包括样品垫、吸样垫和底板，所述样品 垫、结合垫、层析垫和吸样垫依次固定在底板上；其中，结合垫的一端压在样品垫的下方，结 合垫的另一端压在层析垫的上方；层析垫的一端压在结合垫的下方，层析垫的另一端压在 吸样垫的下方。 根据上述的试纸条，优选地，所述捕获抗体中PSMC4单克隆抗体、ALDOC单克隆抗体 和TXLNA单克隆抗体的质量比为1:1:1。 根据上述的试纸条，优选的，所述层析垫上的三条检测线和一条质控线按照以下 次序排列而成：从靠近吸样垫一端到靠近结合垫一端依次为包被有兔抗鼠IgG的质控线C、 包被有TXLNA多克隆抗体的检测线T3、包被有ALDOC多克隆抗体的检测线T2、包被有PSMC4多 4 CN 111551721 A 说　明　书 3/12 页 克隆抗体的检测线T1。 根据上述的试纸条，优选地，层析垫上检测线T1、T2、T3以及质控线C之间的间隔均 不小于5mm。 根据上述的试纸条，优选地，所述样品垫的材质为吸水性玻璃纤维，所述结合垫的 材质为玻璃纤维膜，所述层析垫的材质为硝酸纤维膜；所述吸样垫的材质为吸水纸或吸水 性玻璃纤维膜；所述底板为PVC底板、硬纸板或硬质纤维板。 优选地，本发明中所述样本为血清。 优选地，本发明中食管癌前病变为食管鳞状上皮的不典型增生，食管鳞状上皮的 不典型增生根据程度不同，分为轻度不典型增生、中度不典型增生和重度不典型增生。 优选地，本发明中所述食管癌前病变恶性进展是指食管癌前病变人群5年后从食 管癌前病变恶变进展为食管癌。 优选地，本发明用于食管癌前病变恶性进展风险检测或食管癌早期筛查的试纸条 的应用范围为中国食管癌高发区人群。 本发明还提供了一种上述用于食管癌前病变恶性进展风险检测或食管癌早期筛 查的试纸条的制备方法，包括以下步骤： (1)制备结合垫：采用量子点分别标记PSMC4抗体、ALDOC抗体和TXLNA抗体，得到量 子点标记PSMC4单克隆抗体、量子点标记ALDOC单克隆抗体和量子点标记TXLNA单克隆抗体， 然后将量子点标记PSMC4单克隆抗体、量子点标记ALDOC单克隆抗体和量子点标记TXLNA单 克隆抗体混合均匀后喷涂在玻璃纤维素膜上，干燥，得到结合垫； (2)制备层析垫：将PSMC4多克隆抗体、ALDOC的多克隆抗体、TXLNA多克隆抗体和兔 抗鼠IgG分别包被在硝酸纤维膜上的检测线T1、T2、T3和质控线C上，包被完成后，将硝酸纤 维膜放入封闭液中封闭，封闭后干燥，即得层析垫； (3)试纸组装：将结合垫和层析垫固定在底板上，结合垫的一端与层析垫的一端连 接，在结合垫的另一端放置样品垫，在层析垫的另一端放置吸样垫，干燥，即完成试纸组装， 得到用于食管癌前病变进展风险检测的试纸条(如图1所示)。 根据上述的制备方法，优选地，步骤(1)的具体操作为： (1a)量子点活化：采用N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)将量子点表面的羧基活化，得 到活化量子点；接下来的反应中，在乙基-3-碳化二亚胺酸化物(EDC)的作用下，活化的量子 点的羧基将会和捕获抗体表面的原始氨基形成酰胺键； (1b)制备量子点标记的PSMC4单克隆抗体：将活化量子点放置至室温，向活化量子 点中加入乙基-3-碳化二亚胺盐酸化物溶液、N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液、BSA溶液，摇匀后 加入PSMC4单克隆抗体，摇匀后室温孵育30～45分钟，孵育过程中加入乙基-3-碳化二亚胺 盐酸化物溶液、N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液；孵育后加入甲醇，混合后避光振荡；再加入β- 巯基乙醇终止反应，终止反应后采用β－巯基乙醇进行透析；透析后离心去除上清，即得量 子点标记PSMC4单克隆抗体； (1c)按照上述步骤(1a)和(1b)的操作步骤，制备量子点标记ALDOC单克隆抗体和 量子点标记TXLNA单克隆抗体，然后将量子点标记PSMC4单克隆抗体、量子点标记ALDOC单克 隆抗体和量子点标记TXLNA单克隆抗体混合，得到捕获抗体； (1d)将步骤(1c)制备的捕获抗体均匀喷涂在玻璃纤维素膜上，干燥，得到结合垫。 5 CN 111551721 A 说　明　书 4/12 页 根据上述的制备方法，优选地，步骤(1)中所述量子点为CdSe/ZnS量子点。更加优 选地，所述量子点为羧基水溶性CdSe/ZnS量子点。 根据上述的制备方法，优选地，步骤(1a)中所述活化量子点的浓度为1～10μM；步 骤(1b)中所述PSMC4单克隆抗体的浓度为10～100μg/ml，所述活化量子点与PSMC4单克隆抗 体的质量比为(1:2)～(1:10)，所述BSA溶液的浓度为20～200mg/mL。 根据上述的制备方法，优选地，步骤(1d)中，在喷涂前，采用包被缓冲液作溶剂，将 捕获抗体溶解在包被缓冲液中。更加优选地，所述包被缓冲液为包含20～150mM  NaCl、 0.05％～3％PEG(w/v)、0.2％～1％海藻糖(w/v)、2～10mg/mL  BSA(w/v)、0.05％NaN3的10 ～100mM  PBS缓冲液。 根据上述的制备方法，优选地，步骤(1d)中，在喷涂捕获抗体前，将玻璃纤维素膜 放入预处理液中浸泡1～2h，然后于36～38℃烘干或真空冷冻干燥。更加优选地，所述预处 理液为含0.02％～0.1％Tween-20(w/v)的0.01M  PBS缓冲液(pH为7～7.3)；该预处理液对 多种抗原和抗体都有良好的适应性。 根据上述的制备方法，优选地，步骤(2)的具体操作为： (2a)采用包被缓冲液作为溶剂，将PSMC4多克隆抗体、ALDOC的多克隆抗体、TXLNA 多克隆抗体和兔抗鼠IgG均配制成浓度为0.1～5mg/mL的溶液，得到PSMC4多克隆抗体溶液、 ALDOC的多克隆抗体溶液、TXLNA多克隆抗体溶液和兔抗鼠IgG溶液； (2b)按1～3μL/cm的用量将步骤(2a)制备的PSMC4多克隆抗体溶液、ALDOC的多克 隆抗体溶液、TXLNA多克隆抗体溶液和兔抗鼠IgG溶液分别喷涂在硝酸纤维膜上的检测线 T1、T2、T3和质控线C上，包被完成后，将硝酸纤维膜放入封闭液中封闭，封闭后干燥，即得层 析垫。 根据上述的制备方法，优选地，步骤(2a)中，所述包被缓冲液为包含20～150mM  NaCl、0.05％～3％PEG(w/v)、0.2％～1％海藻糖(w/v)、2～10mg/mL  BSA(w/v)、0.05％NaN3 的10～100mM  PBS缓冲液。 根据上述的方法，优选地，步骤(2b)中所述封闭液为1％-5％的牛血清白蛋白溶 液。 根据上述的方法，优选地，步骤(1)、(2)和(3)中所述干燥的温度为37℃，干燥时间 为3～5h。 根据上述的方法，优选地，步骤(3)中，在组装前，将样品垫放入预处理液中浸泡1 ～2h，然后于36～38℃烘干或真空冷冻干燥。更加优选地，所述预处理液为含0.02％～ 0.1％Tween-20(w/v)的0.01M  PBS缓冲液(pH为7～7.3)。 本发明还提供了一种包含上述用于食管癌前病变恶性进展风险检测的试纸条的 试剂盒。 根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂盒还包含样本稀释液，所述样本稀释液为包 含有0.45％～0.9％氯化钠(w/v)、0.02％～0.1％Tween-20(w/v)、20～200mg/mL牛血清白 蛋白的PBS缓冲液。 本发明试纸条的使用方法为：将待测血清样本滴加在试纸条的样品垫上，5～ 15min后对试纸条层析垫进行鉴定。 本发明试纸条的结果判定方法为： 6 CN 111551721 A 说　明　书 5/12 页 (1)定性结果判定： 将试纸条在紫外灯下观察，试纸条的层析垫上T1、T2、T3中任意1条检测线出现红 色条带，质控线C上出现1条红色条带，判定检测结果为阳性；试纸条层析垫上的T1、T2、T3检 测线均未出现红色条带，仅质控线C上出现一条红色条带，判定检测结果为阴性；试纸条层 析垫质控线C上未出现红色条带，判断检测结果为无效，需要重新进行测试。 用本发明试纸条对食管癌前病变患者的血清样品进行检测时，检测结果若为阳 性，说明该癌前病变患者5年后进展为食管癌的风险较高，检测结果若为阴性，说明该癌前 病变患者在本发明检测方法中5年后进展为食管癌的风险较低。 用本发明试纸条对食管癌高发区无症状高危人群的血清样品进行检测时，检测结 果若为阳性，说明该无症状人可能患有早期食管癌，建议进一步进行内镜检查和粘膜病理 活检。 (2)定量结果判定： 通过本发明的试纸条能够实现待测样本中PSMC4蛋白、ALDOC蛋白、TXLNA蛋白的定 量检测。 待测样本中PSMC4蛋白的浓度判定：配置一系列浓度梯度的PSMC4蛋白标准液，如 7.8125ng/L、15.625ng/L、31.25ng/L、62.5ng/L、125ng/L、250ng/L、500ng/L作为标准品溶 液，分别取各浓度的标准品100μL样品加入到试纸样品垫上，5min后显色完成出现明显的T 和C带，利用量子点荧光定量分析仪读取实验结果，分别将T/C的荧光强度及对应的PSMC4蛋 白浓度来绘制标准曲线，得到荧光强度PSMC4蛋白浓度的标准曲线(如图2中A所示)，得到荧 光强度与PSMC4蛋白浓度的计算公式；将试纸条检测线T1读取的荧光强度代入上述计算公 式中，即可得到待测样本中PSMC4蛋白的浓度。 待测样本中ALDOC蛋白的浓度判定：按照上述同样的步骤绘制T/C的荧光强度- ALDOC蛋白浓度的标准曲线(如图2中B所示)，得到荧光强度与ALDOC蛋白浓度的计算公式； 将试纸条检测线T2读取的荧光荧光强度代入上述计算公式中，即可得到待测样本中ALDOC 蛋白的浓度。 待测样本中TXLNA蛋白的浓度判定：按照上述同样的步骤绘制T/C的荧光强度- TXLNA蛋白浓度的标准曲线(如图2中C所示)，得到荧光强度与TXLNA蛋白浓度的计算公式； 将试纸条检测线T3读取的荧光荧光强度代入上述计算公式中，即可得到待测样本中TXLNA 蛋白的浓度。 试纸条的灵敏度检测： 以零浓度标准品(即空白对照，不含蛋白)当作标本测量20次，计算其荧光值均值 及标准差；以测定值的均值加上2倍的标准差所得的荧光值分别代入PSMC4蛋白、ALDOC蛋 白、TXLNA蛋白的标准曲线方程，得到试纸条对PSMC4蛋白、ALDOC蛋白、TXLNA蛋白的最低检 出浓度，其中，试纸条对PSMC4蛋白最低检出浓度为1ng/ml；对ALDOC蛋白的最低检出浓度为 1ng/ml；对TXLNA蛋白的最低检出浓度为1ng/ml。由此说明，本发明试纸条的检测灵敏度高。 本发明用于食管癌前病变进展风险检测的试纸条的检测原理为： 将试纸条插入待测血清样品中，样品流向吸样垫的方向，当流到结合垫上时，结合 垫上的量子点标记PSMC4单克隆抗体、量子点标记ALDOC单克隆抗体和量子点标记TXLNA单 克隆抗体溶解，其中，量子点标记PSMC4单克隆抗体与血清样品中可能含有的PSMC4抗原 7 CN 111551721 A 说　明　书 6/12 页 (PSMC4蛋白)结合，形成量子点标记PSMC4单克隆抗体-PSMC4抗原复合物，量子点标记ALDOC 单克隆抗体与血清样品中可能含有的ALDOC抗原(ALDOC蛋白)结合，形成量子点标记ALDOC 单克隆抗体-ALDOC抗原复合物，量子点标记TXLNA单克隆抗体与血清样品中可能含有的 TXLNA抗原(TXLNA蛋白)结合，形成量子点标记TXLNA单克隆抗体-TXLNA抗原复合物；由于毛 细管效应，三种量子点标记的捕获抗体-抗原复合物TXLNA在层析垫上移动，当移动至检测 线T1时，量子点标记的PSMC4单克隆抗体-抗原复合物与PSMC4多克隆抗体特异性结合，形成 固化的免疫复合物，被截留在检测线T1上；当移动至检测线T2时，量子点标记的ALDOC单克 隆抗体-抗原复合物与ALDOC多克隆抗体特异性结合，形成固化的免疫复合物，被截留在检 测线T2上；当移动至检测线T3时，量子点标记的TXLNA单克隆抗体-抗原复合物与TXLNA多克 隆抗体特异性结合，形成固化的免疫复合物，被截留在检测线T3上；游离的量子点标记捕获 抗体由于毛细管效应继续向前泳动，与质控线C上包被的兔抗鼠IgG发生结合而被截留在质 控线上；多余的未结合的物质在毛细作用下继续移动到吸样垫上。因此，通过检测线T1、T2、 T3的显色情况或荧光强度，能够定性或定量判断待测样本中PSMC4、ALDOC和TXLNA肿瘤相关 抗原。 与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果为： (1)本发明首次将PSMC4蛋白、ALDOC蛋白、TXLNA蛋白这三种蛋白作为一个组合用 于食管癌早期筛查检测，其检测灵敏度高达89.5％(即早期食管癌患者中应用这3个蛋白进 行诊断时被正确的诊断为早期食管癌的比率为89.5％)，特异度达到了67.5％(即非食管癌 患者中应用这3个蛋白进行诊断时确定为未患食管癌者的比率为67.5％)，因此，本发明的 标志物具有较高的灵敏度和特异度，极大地提高了早期食管癌的检出率，而且，对食管癌的 检出率远高于现有临床内镜筛查食管癌的检出率，可用于食管癌高发区无症状人群的大规 模筛查，有利于无症状食管癌高危人群早期发现，从而大大降低了食管癌患者的死亡率，为 食管癌患者和家庭带来极大的福祉。 (2)本发明首次将PSMC4蛋白、ALDOC蛋白、TXLNA蛋白这三种蛋白作为一个组合用 于食管癌前病变患者的病变恶性进展风险检测，通过对10000例内镜诊断为癌前病变患者 的血清进行检测，评估出恶变高风险的人群，对恶变高风险人群进行5年跟踪随访、胃镜检 查和组织病理活检，最终确定为食管鳞癌的比例为24.5％(953/3884)，具有较高的准确率， 有利于食管癌的早期发现，实现早发现早治疗，将病变阻断在早期，大大提高食管癌检出率 和延长患者寿命。 (3)本发明的该试纸条能够快速检测人血清/血浆中的PSMC4、ALDOC、TXLNA蛋白， 实现了三种肿瘤标志物的联合检测，根据检测结果可以预测食管癌前病变患者5年后的病 程恶化风险，操作简单，使用方便、快捷，检测时间短，数分钟即可获得结果，极大地提高了 癌前病变风险的检测效率和诊断效率，适合在食管癌高发区高危人群的体检筛查诊断中使 用。 (4)本发明采用量子点标记捕获抗体，量子点具有很强的荧光强度，量子点标记的 灵敏度和特异性均优于其它有机荧光标记(如荧光素或荧光微球等)，检测灵敏度高，灵敏 度可达到传统胶体金试纸条的数100～1000倍；而且，量子点的荧光寿命长，采用量子点标 记捕获抗体，能够提高试纸条的长期存储稳定性。 8 CN 111551721 A 说　明　书 7/12 页 附图说明 图1为本发明用于食管癌前病变恶性进展风险检测或食管癌早期筛查的试纸条的 结构示意图。 图2为试纸条定量结果判定的标准曲线；其中A为荧光强度-PSMC4蛋白浓度的标准 曲线，B为荧光强度-ALDOC蛋白浓度的标准曲线，C为荧光强度-TXLNA蛋白浓度的标准曲线。